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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS


ESCUELA DE TECNOLOGÍA MÉDICA
ÁREA DE LABORATORIO CLÍNICO
CUARTO SEMESTRE BACTERIOLOGÍA
2014

TEMA:
TOMA DE MUESTRAS, STAPHYLOCOCCUS Y STREPTOCOCCUS

1. OBJETIVOS

 Identificar las características macromorfológicas de las colonias


de Staphylococcus y Streptococcus en los medios de cultivo.

 Determinar los diferentes tipos de hemólisis que se producen en


el agar sangre por las especies del género Staphylococcus y
Streptococcus.

 Realizar pruebas bioquímicas para poder identificar y diferenciar


las especies del Género Staphylococcus.

 Realizar pruebas bioquímicas para poder identificar y diferenciar


las especies del Género Streptococcus.

2. MARCO TEÓRICO

EXUDADO NASAL:

Esta muestra solo se utiliza para buscar portadores de S.aureus o en el


diagnóstico etiológico de impétigo. No es útil para el diagnóstico etiológico en
casos de rinitis, rinosinusitis ni en casos de otitis media ni cuadros respiratorios
altos prolongados

Alrededor del 30% de la población es portadora de este microorganismo a nivel


nasofaríngeo por lo cual su hallazgo no tiene habitualmente significancia clínica
salvo en situaciones especiales. En el personal de salud sólo se realizará la
búsqueda de portadores en el caso de brotes de infecciones en los que no se
ha encontrado otra fuente de infección. Este tipo de investigación se realizará
en coordinación con el

D. TRANSPORTE Y CONSERVACION.
Envío inmediato al laboratorio (no superior a 2 horas).

EXUDADO FARINGEO

Se utiliza para el diagnóstico de faringitis estreptocóccica. Excepcionalmente se


pueden requerir búsqueda de otros patógenos (por ejemplo: Neisseria
gonorrhoeae) consultar con el laboratorio.

D. TRANSPORTE Y CONSERVACION.
Envío inmediato al laboratorio (no superior a 2 horas).
Si no es posible, conservar en heladera a 4ºC hasta 12 horas.
D. OBSERVACIONES.
Se investigará rutinariamente la presencia de Streptococcus beta-hemolítico del
grupo A (S.
pyogenes) y otros grupos beta hemolíticos como C y G.

Género Staphylococcus

STAPHYLOCOCCUS AUREUS, STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS Y


STAPHYLOCOCCUS SAPROPHYTICUS.

Los Staphylococcus que se asocian con infecciones humanas son colonizadores


principalmente de superficies cutáneas y mucosas. El crecimiento de las colonias
bacterianas son visibles casi sobre todos los medios de cultivo, en especial en agar
sangre.

Son bacterias en forma de coco Gram positivas producen catalasa, son aerobios
facultativos. La temperatura ideal de crecimiento es de 37ºC,
Consumen lípidos, proteínas y fermenta una gran variedad de azucares, no es
formadora de esporas y crecen en niveles de salinidad 7.5-10%.

Dentro del género Staphylococcus hay 52 especies, siendo las más importantes desde


el punto de vista clínico las siguientes:

 Staphylococcus aureus (coagulasa positivo)


 Staphylococcus epidermidis (coagulasa negativo)
 Staphylococcus saprophyticus (coagulasa negativo)

Morfología colonial.
En agar sangre, nutritivo chocolate, soya tripticasa, etc, se ven colonias pequeñas,
blanquecinas, de forma circular, bordes redondeados, superficie lisa y convexa.
Algunas cepas producen un pigmento carotenoide que les da un color dorado
(Staphylococcus aureus).

Staphylococcus aureus en agar sangre


a contra luz para observar la hemolisis
beta.
Cultivos

Los estafilococos crecen rápidamente en casi


todos los medios bacteriológicos bajo condiciones
aerobias o microaerofílicas.
Se desarrollan con más rapidez a una temperatura
de 37°C pero forman pigmento mejor a una temperatura ambiente (20 a 25°C).
Las colonias en medios sólidos son redondas, lisas, elevadas y brillantes.

Staphylococcus aureus

Algunas cepas de S. aureus pueden producir


un pigmento carotenoide que les da un color
amarillo, el color es más evidente en agares
nutritivos como agar sangre, agar chocolate,
agar infusión cerebro corazón, agar nutritivo,
entre otros.

Las cepas de S. aureus son productoras de


coagulasa y beta-hemolisinas (algunas cepas
carecen de hemolisina) presenta colonias de 1 a 3 mm de diámetro, lisas, levemente
elevadas, de bordes enteros, levemente convexas.

Pruebas bioquímicas para la identificación de Staphylococcus aureus.

 Agar sales y manitol: positivo (color amarilllo).


 Prueba de coagulasa: positivo.
 Sensisbilidad a vancomicina: positivo.
 Única especie de Staphylococcus que puede producir pigmentación
amarilla.
 DNAasa: positiva.

Staphylococcus saprophyticus.
Casi nunca se asocia a enfermedades nosocomiales, muchas cepas son manitol
positivo, no producen beta-hemolisis en agar sangre, es causante de infecciones
urinarias,
carece de coagulasa y no produce ninguna
pigmentación.

Bioquímicas para la identificación de Staphylococcus saprophyticus.

 Agar sales y manitol: negativo o positivo (variable).


 Prueba de coagulasa: negativo.
 Sensibilidad a vancomicina: resistente.
 DNAasa: negativo.

Staphylococcus epidermidis.
.
Las infecciones por S. epidermidis son oportunistas, nosocomiales y generalmente
está asociado a los implantes de prótesis, catéteres e intervenciones quirúrgicas.

Las colonias de S. epidermidis por lo


general son grises a blancas en el
aislamiento primario; muchas colonias
forman pigmento sólo tras una incubación
prolongada. No se produce pigmento en
condiciones anaerobias o en caldo y
presenta colonias generalmente de menor
tamaño y estas no presentan pigmentación.

Pruebas bioquímicas para la


identificación de Staphylococcus
epidermidis.

 Agar sales y manitol: negativo (da


un color rosa).
 Prueba de coagulasa: negativo.
 Sensisbilidad a vancomicina: positivo..

Para identificar el género usamos las pruebas bioquímicas primarias.

 Tinción de Gram: Cocos Gram positivos, agrupados en racimos.


 Catalasa: positiva.
 Oxidasa: positiva.
 O/F: F

La prueba de O/F es la que diferencia Staphylococcus sp. Del género


Micrococcus sp. Este último tiene metabolismo oxidativo.

Diferenciación de especies de Staphylococcus

Bacteria. Manitol. Coagulasa. Novobiocina. DNAasa.

S. aureus Positivo Positivo Sensible Positivo

S.saprophyticus Variable Negativo Resistente Negativo

S. epidermidis Negativo Negativo Sensible Negativo

GÉNERO STREPTOCOCCUS

El género Streptococcus es un grupo formado por diversos cocos


grampositivos que normalmente se disponen en parejas o en cadenas.
La mayoría de las especies son anaerobios facultativos, y algunos crecen
únicamente en una atmósfera enriquecida con dióxido de carbono. Sus
exigencias nutricionales son complejas, y su aislamiento requiere el uso de
medios enriquecidos con sangre o suero. Son capaces de fermentar
hidratos de carbono, proceso que produce ácido láctico, y son catalasa-
negativos, a diferencia de las especies del género Staphylococcus

Un gran número de especies estreptocócicas destacan por su papel como


patógenos humanos. Lamentablemente, la diferenciación de las especies que
componen este género es complicada debido a que se utilizan los tres sistemas
diferentes parcialmente coincidentes enumerados
a continuación para clasificar a estos microorganismos:

1) Propiedades serológicas: grupo de Lancefield;


2) Patrones hemolíticos: hemólisis completa (beta), hemólisisincomplet
a (alfa) y ausencia de hemólisis, y

3) Propiedades bioquímicas (fisiológicas)

Rebeca Lancefield desarrolló en 1933 el sistema de clasificación serológica


para diferenciar las cepas beta-hemolíticas. La mayoría de estas cepas y
algunas de las alfa-hemolíticas y no hemolíticas poseen antígenos específicos
de grupo, la mayoría de los cuales son hidratos de carbono de la pared celular.
Estos antígenos se pueden detectar fácilmente con pruebas inmunológicas, y
han sido útiles para identificación rápida de algunos patógenos estreptocócicos.
Por ejemplo, ´

La mayoría (pero no todos) de los estreptococos alfa-hemolíticos y no


hemolíticos carecen de los antígenos de la pared celular específicos de
grupo. Estos microorganismos se deben identificar a través de pruebas
bioquímicas. Noobstante, estos sistemas de clasificación no son mutuamente
excluyentes

STREPTOCOCCUS PYOGENES.

El S. pyogenes (también conocido como GAS) pertenece al GRUPO A y es el


agente causal en las infecciones estreptocócicas del Grupo A, (GAS)
incluyendo faringitis estreptocócica ("amigdalitis"), fiebre reumática aguda,
fiebre escarlata, glomerulonefritis aguda y fascitis necrotizante

El hidrato de carbono específico de grupo, es el antígeno del grupo A, es un


dímero de N-acetilglucosamina y de ramosa.

La infección por Estreptococo Grupo A es diagnosticada generalmente con una


Prueba Rápida de Estreptococos o mediante Cultivo.
El método más comúnmente empleado en los laboratorios clínicos para la
identificación presuntiva en cultivos de Streptococcus Beta-hemolítico del grupo
A (Streptococcus pyogenes) es la prueba de susceptibilidad a la bacitracina o
Taxo A. Otra manera es detectar el antígeno A mediante enzimoinmunoanálisis
o inmunoaglutinación.

STREPTOCOCCUS AGALACTIAE

Características generales

S. agalactiae, o GBS, pertenece al grupo B y causa neumonía y meningitis en


neonatos y en las personas más jóvenes, con bacteremia sistémica ocasional.
Estos también pueden colonizar los intestinos y el tracto reproductor femenino,
incrementando el riesgo de ruptura prematura de membranas y la transmisión
al infante.

Es un coco grampositivo, catalasa y oxidasa negativo, anaerobio facultativo,


que se presenta formando cadenas de longitud variable. En medios
suplementados con sangre o suero se favorece su crecimiento. Tras 18-24 h de
incubación en agar sangre, las colonias son de unos 2 mm de diámetro, lisas y
rodeadas por un halo de ß-hemólisis, aunque existen algunas cepas no
hemolíticas.

El empleo de medios selectivos favorece la recuperación del EGB. Como


agentes selectivos se emplean, gentamicina, ácido nalidíxico, colistina o cristal
violeta.

IDENTIFICACIÓN

Las pruebas bioquímicas más utilizadas son el CAMP-test, la hidrólisis del


hipurato y la resistencia a discos debacitracina y cotrimoxazol, aunque ninguna
de ellas es específica. En medios de cultivo especiales, el EGB produce un
pigmento de color rojo naranja, que es característico, y que permite su
identificación directa, sin necesidad de otras pruebas.

STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE

Se trata de una bacteria Gram. Positiva que presenta una forma oval y el
extremo distallanceolado. Es inmóvil, no forma endosporas, y es un miembro
alfa hemolítico del género Streptococcus. Generalmente, se presenta en forma
de diplococo, aunque existen algunos factores que pueden inducir la formación
de cadenas. Neumococo es un patógeno casi exclusivamente humano
causante de un gran número de infecciones como neumonía, endocarditis y de
procesos invasivos severos como meningitis, septicemia, etc. particularmente
en ancianos, niños y personas inmunodeprimidas. El hábitat natural de
neumococo es la faringe

El estreptococo pneumoniae se puede diferenciar del estreptococo viridans en


que solo el primero es soluble en bilis,el viridans no. Y la otra diferencia es que
el estreptococo pneumoniae se inhibe en la presencia de optoquina.
Elestreptococo viridans no se inhibe con la optoquina

Resistente a la optoquina (S. Sensible a la optoquina (S.


viridans), pneumonae)

Actividad Hemolítica

La hemólisis observada en los aislamientos de Streptococcus y Enterococcus


en diferentes muestras clínicas es una de las primeras características
sugestivas de posibles especies. Algunas especies muestran una hemólisis
completa (hemólisis ß) alrededor de las colonias en agar sangre, como S.
pyogenes, S. agalactiae (aunque algunos aislamientos aparecen como no-
hemolíticos), Streptococcus de los grupos C, F y G, así como algunas cepas de
Enterococcus,

Otras especies pueden mostrar una hemólisis incompleta (hemólisis alfa)


alrededor de las colonias en agar sangre, incluyendo S. pneumoniae,
Streptococcus del grupo D y del grupo viridans.

Al realizar la determinación de los patrones hemolíticos de los aislamientos de


Streptococcus y Enterococcus es importante considerar que muchas de sus
citolisinas (hemolisinas) son lábiles al O2, por lo que las bacterias deben ser
inoculadas dentro del agar para proporcionar un ambiente relativamente
anaeróbico.

PRUEBA DE CAMP

La prueba de CAMP se utiliza para la identificación presuntiva de S. agalactiae


(grupo B de Lancefield). En esta prueba se observa un efecto sinérgico que se
produce al interactuar el factor CAMP producido por cepas de S. agalactiae con
la hemolisina β de Staphylococcus aureus. Ambos son productos extracelulares
que difunden en el medio de cultivo para producir dicho efecto en forma de
flecha cuando se utilizan placas de agar sangre preparada con eritrocitos
ovinos o bovinos. Una vez inoculados, los medios de cultivo deben ser
incubados a 35-37°C por 18-24 horas. Algunos autores recomiendan no
incubar las placas de agar sangre para la prueba de CAMP en una atmósfera
enriquecida con CO2 debido a un probable efecto inhibitorio sobre el
sinergismo. 

PRUEBA DEL DISCO DE OPTOQUINA

Prueba de resistencia al optoquina. 


La prueba de resistencia a la optoquina (hidrocloruro de hidrocupreína) permite
la diferenciación de Streptococcus pneumoniae (sensible al optochin) de otros
Streptococcus α- hemolíticos como los Streptococcus del grupo viridans
(resistentes al optochin). Para la realización de esta prueba el microorganismo
en estudio debe ser inoculado densamente en una placa de agar sangre y
sobre el inóculo se coloca un disco conteniendo optochin (rotulado con una P) ,
el cual se presiona levemente para que se adhiera a la superficie del medio.
Las placas de agar sangre son posteriormente incubados a 35-37oC por un
período de 18-24 horas en una atmósfera enriquecida con CO2. La mayoría de
los discos conteniendo optochin disponibles comercialmente tienen un diámetro
de 6 mm. Utilizando estos discos de 6 mm para la prueba de resistencia al
optochin, un resultado se considera negativo (susceptible) cuando el halo de
inhibición mide al menos 14 mm de diámetro. Sin embargo, algunas pocas
casas comerciales tienen a disposición discos conteniendo optochin de 10 mm
de diámetro. En este caso, unhalo de inhibición igual o superior a 16 mm de
diámetro se debe interpretar como un resultado negativo (susceptible)

 Prueba de hidrólisis de esculina.


Esta prueba se utiliza para la identificación presuntiva de Streptococcus del
grupo D, como S. bovis y S. equinus, y de las especies de Enterococcus, todos
los cuales dan esta prueba positiva. Esta prueba se realiza utilizando un medio
llamado agar bilis-esculina, el cual contiene 4% de sales biliares y 1% de
esculina. La hidrólisis de la esculina resulta en la formación de glucosa y
esculetina. La esculetina en presencia de Fe3+ forma un complejo de color
negro. Por lo tanto, las bacterias que crecen en presencia de las sales biliares
e hidrolizan esculina tornan el medio de color negro, generalmente en un
periodo de incubación de 18-24 horas a 35-37°C. La presencia de crecimiento
pero sin la formación delcolor negro se considera como una prueba negativa.
3. RECURSOS

Toma de muestra  Estándar de turbidez


Macfarland 0.5
 Hisopo de algodón con medio
 Colorantes para coloración
de transporte.
Gram
 Bajalenguas
 Peróxido de hidrógeno al 3%
 Agar Sangre, chocolate
 Discos de Novobiocina 5mcg

STREPTOCOCCUS
STAPHYLOCOCCUS  Microscopio
 Bacitracina 0.04  Estufa a 35oC
 Pinza  Bilis esculina
 Asas bacteriológicas  Cloruro de sodio al 6.5%
 Regla milimetrada  Disco de optoquinina
 Microscopio  Regla milimetrada
 Estufa a 35oC  Asas bacteriológicas Cajas
 Cajas con agar (sangre, con agar (sangre)
chocolate, Muller-Hinton)  Discos de bacitracina 0.04u
 Caldo de Tripticase soya  Peróxido de hidrogeno
 Cepa de Staphylococcus
aureus

4. PROCEDIMIENTO

Exudado nasal
Tomar muestra profunda de ambas fosas nasales con el mismo hisopo,
previamente embebido en suero fisiológico estéril.

Exudado faríngeo
Bajo visión directa, con la ayuda del bajalengua, se tocará con el hisopo en
todas las partes con
exudado, membranas o inflamación. Se deben frotar las criptas tonsilares y la
faringe posterior. En
lo posible no tocar la mucosa oral, lengua, úvula ni dientes.

STAPHYLOCOCCUS
Tinción de Gram
 Con medios de cultivos ya crecidos realizamos la práctica
correspondiente a Sthaphylococcus
 Cogemos un asa de siembra, la esterilizamos en el mechero de Bunsen
y con dicha asa cogemos una colonia del agar sangre.
 Con la ayuda de la asa realizamos un extendido sobre un portaobjetos
de la colonia que cogimos.
 Realizamos la tinción de Gram y esperamos que se seque la placa.
 Observamos la placa en el microscopio con la lente de 100x con la
ayuda del aceite de inmersión.
 Observamos y anotamos la micromorfología de la colonia.

Prueba de la catalasa
 Colocamos en un portaobjetos limpio una gota de Peróxido de
Hidrógeno
 Cogemos un asa de siembra, la esterilizamos en el mechero de Bunsen
y con dicha asa cogemos una colonia del agar sangre.
 Mezclamos la colonia con la gota de Peróxido de Hidrógeno que se
encuentra en la placa y observamos que sucede.

Prueba de la coagulasa
Realizar la prueba de la coagulasa la ligada y la libre

En la C. Ligada:
 Colocamos en un portaobjetos limpio dos gotas de solución salina (una
como prueba y la otra como control).
 Cogemos un asa de siembra, la esterilizamos en el mechero de Bunsen
y con dicha asa cogemos una colonia del agar sangre.
 Mezclamos la colonia con la gota de solución salina de prueba que se
encuentra en la placa y colocamos una gota de plasma citratado.
 Agitamos 10 segundos y observamos que sucede.

En la C. Libre
 Colocamos plasma citratado en un tubo de ensayo pequeño.
 Cogemos un asa de siembra, la esterilizamos en el mechero de Bunsen
y con dicha asa cogemos una colonia del agar sangre.
 Mezclamos la colonia con el plasma citratado.
 Agitamos y el resultado se leerá en una hora.

Prueba de sensibilidad
 Cogemos con el asa de siembra una colonia de Staphylococcus.
 Introducimos en un tubo con solución salina y homogenizar esta
dilución, debe estar 0,5 en la escala de Macfarland
 Procedemos a hisopar en el agar Muller-Hinton, el mismo que debe ser
bipetri ya que en el otro lado hisoparemos la dilución del Micrococcus.
 Colocamos el disco de Bacitracina (0.04 u) y la Novobiocina(30 mct) en
el Micrococcus, también colocamos la Novobiocina(30 mct) en el
Sthaphylococcus.

Prueba de Manitol
 Cogemos con el asa estéril una colonia
 Realizamos la picada en el tubo con manitol y la estriación.

 Guardamos los agares en la estufa a 35oC por 24horas para observar


los resultados al día siguiente.

STREPTOCOCCUS

 Conseguir muestras de Streptococcus beta-hemolíticos


 Las muestras que necesitamos son Streptococcus beta- hemolíticos
 Cogemos una agar sangre y con el asa de siembra esterilizada la
dividimos en la mitad y la parte inferior la dividimos en la mitad, de tal
manera que el agar se divide en tres partes

Prueba de CAMP
 Con un asa estéril cogemos una colonia se Staphylococcus aureus beta-
hemolítico y de manera vertical en la primera división inoculamos.
 Esterilizamos el asa y cogemos una colonia de Streptococcus beta-
hemolítico del grupo A e inoculamos de manera horizontal al otrolado de
la línea verical.
 Esterilizamos el asa y cogemos una colonia de Streptococcus beta-
hemolítico del grupo B e inoculamos de manera horizontal a un lado de
la línea verical.

Prueba de sensibilidad a la optoquina

 Usamos la segunda división del agar en la cual mediante un asa estéril,


seleccionamos tres o cuatro colonias bien aisladas del microorganismo a
probar y estriarlas en la mitad de la división.
 Colocamos un disco de optoquinina en el centro del área sembrada
 Presionamos suavemente el disco sobre el agar
 Incubamos en la estufa a 35oC durante 24 horas.

Prueba de sensibilidad a la bacitracina

 Usamos la tercera división del agar sangre y cogemos tres o cuatro


colonias aisladas de Streptococcus beta hemolítico y estriamos el
inóculo hasta el centro de la mitad del agar sangre.
 Con un hisopo estéril diseminados por la división del agar sangre.
 Colocamos un disco de bacitracina en el centro del área sembrada
 Presionamos suavemente el disco con pinzas flameadas sobre el agar.
 Incubar en la estufa a 35oC durante 24 horas.

Prueba de bilis esculina

 Cogemos una colonia del agar sangre con el asa esterilizada


 Realizamos la picada en el tubo y la estriación.
Resistencia al NaCl
 Cogemos una colonia homogenizamos bien en el cloruro de sodio al
15%

 Guardamos los agares en la estufa a 35oC por 24horas para observar


los resultados al día siguiente.

5. RESULTADOS

STAPHYLOCOCCUS

Prueba de Catalasa
Resultado: debido a la aparición de burbujas el resultado es positivo, ya que el
peróxido de hidrógeno (H2O2) se convierte en agua y oxígeno.

Prueba de Manitol
Resultado: la prueba es positiva debido al cambio de color de rojo a amarillo.

Prueba de Coagulasa Ligada

Resultado: La presencia de aglutinación en el portaobjetos a los 20 segundos


nos indica que la prueba es positiva.

Prueba de Coagulasa Libre

Resultado: La reacción positiva en tubo se considera cuando se forma el


coágulo después de 4 horas.
Resultado: En el agar Muller-Hinton obtuvimos como resultado resitente para
la Novobiocina la cual presenta un halo de inhibicion <16 mm y sensible para
la bacitracina

STREPTOCOCCUS

Prueba de Bilis esculina


Resultado: La prueba es positiva debido al cambio de color a marrón obscuro.

Resultado: El tubo con cloruro de sodio no presenta turbidez se mantiene


claro.
Resultado del Camp
Resultado: Se formó las flechas positivo para Beta Hemolítico.

Resultado de la sensibilidad
Sensible a la Bacictracina (Halo >18). Resitente a la Optoquinina

6. CONCLUSIONES

 Se diferenció la micromorfología de los Staphylococcus (racimos) con


los Streptococcus (cadenas) con la ayuda del microscopio.
 Se conoció que para diferenciar entre Staphylococcus y Streptococcus
debemos realizar la prueba de la catalasa, ya que los Staphylococcus
son catalasa positiva, mientras que los Streptococcus son catalasa
negativos.
 La prueba de coagulasa ya sea ligada o libre es fundamental para la
identificación de Staphylococcus
 Se determinó que con la prueba de Bilis esculina se identifica
Streptococcus y Enterococcus
 Se concluyó que una prueba para la diferenciación rápida del
Staphylococcus aureus es mediante la prueba de la coagulasa, ya que
el S. aureus es el único coagulasa positivo.

7. RECOMENDACIONES

 Debemos leer la prueba de la coagulasa a su debido tiempo, ya que


si pasa mucho tiempo el coágulo puede disolverse.
 Al coger la colonia con el asa de siembra no se debe tomar parte del
agar sangre porque la catalasa presente en los eritrocitos pueden
producir falsos positivos

 Siempre antes de coger una colonia de los diferentes agares se debe


esterilizar el asa de siembra para evitar contaminación.

8. BIBLIOGRAFÍA

Pabón, L. (2009). Manual en Prácticas en Bacteriología. Fussion.

Manual of Clinical Microbiology. 7th edition. Edited by Murray P, Baron E.J,


Pfaller M, Tenover F, Yolken R. 1999. ASM Press, Washington Pag. 273

Struthers Kelth . (2005). Bacteriologia Clinica. Masson. Capitulos


Streptococcus y Sthaphylococcus