INTRODUCCION

Introducción
Investigadora: Dra. Liliana N. Guerra
Alumnas: Fabiana Durante y Tamara Broitman
Blog: www.tyf-proyecto08.blogspot.com
Año:2008
Autor: Fabiana Durante y Tamara Broitm Página 1 de 26

1. Objetivo
Tomando en cuenta los antecedentes de nuestro laboratorio y los resultados

obtenidos por otros grupos de investigación, nos propusimos investigar el
mecanismo de acción por el cual factores de secreción del epitelio mamario
inhiben la diferenciación de preadipocitos 3T3-L1 y de un cultivo primario
desarrollado en el laboratorio. Dado que hemos realizado estudios que nos
permitieron determinar la expresión proteica de los factores de transcripción
adipogénicos C/EBPs y PPARg, nos abocaremos ahora a realizar estudios para
ver la expresión de RNA de estos factores adipogénicos, por medio de la
técnica de RT-PCR. De forma tal a poder discriminar a que nivel es la
interacción células epiteliales de mama - adipocitos.
Como continuación de este trabajo, estamos caracterizando estos factores
secretados por el epitelio mamario, para ello decidimos realizar técnicas
cromatográficas y electroforéticas que permiten separar la proteína de interés
del resto de proteínas no relevantes, presentes en el preparado original de
extracción. Como continuación se realiza una espectrometría de masa (que se
lleva a cabo como servicio técnico en la Facultad de Ciencias Exactas y
Naturales) y a partir de los resultados obtenidos, por comparación con un
banco de datos internacional se puede distinguir el factor de secreción del
epitelio mamario de nuestro interés. Esta estrategia de trabajo se denomina
proteómica. Todavía resta saber si estamos frente a un factor nuevo o a un
factor conocido con una nueva función.
2. Tejido Adiposo
Es un tejido conjuntivo especializado en el que predominan las células

conjuntivas llamadas adipocitos. Los lipoblastos, células precursoras de
adipocitos producen cantidades importantes de colágeno I y III, pero los
adipocitos adultos secretan muy bajas cantidades de colágeno y pierden la
capacidad de dividirse .El tejido adiposo es uno de los tejidos más abundantes
y representa alrededor del 15-20% del peso corporal del hombre y del 20-25%
del peso corporal en mujeres. Los adipocitos almacenan energía en forma de
triglicéridos. Debido a la baja densidad de estas moléculas y su alto valor

calórico, el tejido adiposo es muy eficiente en la función de almacenaje de
energía. Los adipocitos diferenciados pierden la capacidad de dividirse; sin
embargo, son células de una vida media muy larga y con capacidad de
aumentar la cantidad de lípidos acumulados. Además, el tejido adiposo
postnatal contiene adipocitos inmaduros y precursores de adipocitos residuales
a partir de los cuales pueden diferenciarse adipocitos adicionales. Estos
mecanismos se hacen operativos cuando la ingesta calórica aumenta
exageradamente. La diferenciación a adipocitos es un proceso complejo en el
que los preadipocitos deben interrumpir su crecimiento y salir del ciclo celular
previamente a su conversión terminal a adipocitos. Este proceso de
diferenciación supone cambios cronológicos en la expresión de numerosos
genes. Así, se van expresando aquellos genes característicos de los adipocitos,
al mismo tiempo que se van reprimiendo genes que son inhibitorios para la
adipogénesis o que son innecesarios para la función del adipocito maduro.
Todos estos cambios en la expresión y función de estos genes conducen
finalmente a la adquisición del fenotipo característico del adipocito. Estudios
bioquímicos han revelado que la acumulación de Tg citoplasmático está
correlacionado con la expresión coordinada de casi todas las enzimas de la vía
de síntesis de novo de los ácidos grasos y la biosíntesis del triacilglicerol. Los
preadipocitos en cultivo también adquieren las proteínas necesarias para la
lipólisis del triacilglicerol, la captación (“uptake”) y la translocación intracelular
de los ácidos grasos y los receptores para las hormonas lipolíticas y
lipogénicas que regulan este proceso.
El tejido adiposo se clasifica en adiposo unilocular y el tejido adiposo

multilocular, de acuerdo a las características de las células que lo constituyen.
Tejido adiposo unilocular o blanco

Corresponde a la variedad de tejido
adiposo más corriente en adultos. Sus
células son poliédricas, miden entre 50 y
150 Um de diámetro y contienen una
sola gota de lípido que llena todo el
citoplasma desplazando las organelas

hacia la periferia. Al microscopio de luz cada célula aparece como un pequeño
anillo de citoplasma rodeando una vacuola, resultado de la disolución de la
gota lipídica, y que contiene un núcleo excéntrico y aplanado. El MET revela
que cada célula adiposa contiene sólo una gota de lípido. En el citoplasma
perinuclear se ubican un Golgi pequeño, escasas mitocondrias de forma
ovalada, cisternas de RER (retículo endoplasmatico rugoso) poco desarrolladas
y ribosomas libres. En el citoplasma que rodea la gota de lípido contiene
vesículas de RER (retículo endoplasmatico liso), algunos microtúbulos y
numerosas vesículas de pinocitosis.
Tejido adiposo multilocular o marrón

Esta variedad de tejido adiposo es de distribución restringida en el adulto. Sus
células son poligonales y más pequeñas que las del tejido adiposo unilocular.
Su citoplasma contiene numerosas gotas de lípido de diferente tamaño y
numerosas mitocondrias con abundantes crestas. Su un núcleo está al centra y
es esférico. Este tejido adiposo se asocia con numerosos capilares sanguíneos
y se conoce también como grasa parda. En embriones humanos y en el recién
nacido, este tipo de tejido adiposo se concentra en la región interescapular y
luego en individuos adultos disminuye notablemente.
Procesos en la diferenciación a adipocitos

La diferenciación a adipocitos es un proceso complejo en el que los
preadipocitos deben interrumpir su crecimiento y salir del ciclo celular
previamente a su conversión terminal a adipocitos. Este proceso de
diferenciación supone cambios cronológicos en la expresión de numerosos
genes. Así, se van expresando aquellos genes característicos de los adipocitos,
al mismo tiempo que se van reprimiendo genes que son inhibitorios para la
adipogénesis o que son innecesarios para la función del adipocito maduro.
Todos estos cambios en la expresión y función de estos genes conducen
finalmente a la adquisición del fenotipo característico del adipocito . Estudios
bioquímicos han revelado que la acumulación de Tg citoplasmático está
correlacionado con la expresión coordinada de casi todas las enzimas de la vía
de síntesis de novo de los ácidos grasos y la biosíntesis del triacilglicerol. Los
preadipocitos en cultivo también adquieren las proteínas necesarias para la

lipólisis del triacilglicerol, la captación (“uptake”) y la translocación intracelular
de los ácidos grasos y los receptores para las hormonas lipolíticas y
lipogénicas que regulan este proceso.
Aunque los fenómenos moleculares implicados en la diferenciación de los
adipocitos no son totalmente conocidos, se ha sugerido un modelo que incluye
varias etapas (se describe como ejemplo el modelo de diferenciación propuesto
para la línea celular 3T3-L1):
Determinación
Hasta ahora, se han descrito dos familias de factores de transcripción, las

C/EBPs (CCAAT/Enhancer Binding Proteins) y PPARγ (Peroxisome
Proliferator-Activated Receptor γ), que han sido identificadas como “directores”
reguladores de la transcripción de genes adipogénicos. Aunque no todos los
factores de transcripción involucrados en el compromiso hacia el linaje adiposo
han sido identificados, se ha sugerido que en células Balb/c 3T3 uno de los
factores de transcripción que participa en este mecanismo es el C/EBP α .
Aunque estas células no se diferencian espontáneamente por el aumento en la
expresión de este factor de transcripción, la expresión ectópica de C/EBPα
parece crear un estado permisivo a partir del cual las células pueden
diferenciarse en respuesta a agentes inductores exógenos. Además como este
factor de transcripción se expresa en otros tejidos es difícil creer que la
expresión de este único factor sea responsable del compromiso adiposo.
2. Tejido Epitelial
Las células epiteliales se encuentran formando láminas de células
estrechamente unidas, denominadas epitelios, que actúan principalmente
como:
*Cubierta o revestimiento para algunas superficies corporales tales como, por
ejemplo, la piel, el intestino y diversos conductos.
*Unidades funcionales de glándulas secretoras, como las glándulas salivales y
el hígado.

La mama
Diagrama esquemático de un seno (sección de
una hembra adulta humana) Leyenda: 1. Caja
torácica 2. Músculo pectoral 3. Lóbulos 4.
Pezones 5. Areola 6. Ducto 7. Tejido adiposo 8.
Piel
Cada mama, cuyo aspecto exterior es una
prominencia de tamaño y turgencia variables,
está poseé ciertas estructuras tanto externas e
internas, iniciando por las del exterior en donde
se puede visualizar al pezón y a la areola.
Internamente la mama posee gran parte de tejido adiposo, que la constituye en
un 90 por ciento dándole la forma abultada, además se integran al tejido los
conductos galactóforos y la glándula mamaria encargados ambos de la
producción y secreción de leche materna. Las glándulas mamarias se
distribuyen por todo el seno, aunque las dos terceras partes del tejido glandular
se encuentran en los 30 mm más cercanos a la base del pezón. Estas
glándulas drenan en el pezón por medio de ductos, cada uno de los cuales
tiene su propia apertura o poro. La intricada red formada por los ductos se
ordena de forma radial y convergen en el pezón. Sin embargo los ductos más
próximos a éste no actúan como reservorios de leche.
Histología
La glándula mamaria consta de dos elementos fundamentales: los acinos
glandulares, donde se encuentran las células productoras de leche y los
ductos, un conjunto de estructuras tubulares y huecas, ramificadas en forma de
árbol, cuyas luces confluyen progresivamente en canalículos más y más
gruesos hasta terminar en uno de los doce a dieciocho vértices llamados
galactóforos. Los galactóforos son dilataciones ductales a modo de reservorios
situados inmediatamente por detrás del pezón, formados por un epitelio
escamoso no querantinizado.
En la base del conjunto areola-pezón se localizan las células mioepiteliales,
estrictamente epiteliales en cuanto a su origen, aunque con la particularidad de
que son capaces de contraerse a la manera de fibras musculares. Estas

células, rodeadas por fibras musculares lisas en forma radial, provocan la
erección del pezón ante estímulos como succión, roce, tacto y frío, produciendo
la salida de la leche almacenada en los galactóforos.
El resto de las mamas está compuesto por tejido conjuntivo -colágeno y
elastina-, tejido adiposo (grasa) y una aponeurosis llamada ligamento de
Cooper. La proporción de glándula y tejido adiposo parte de 1:1 en mujeres que
no están lactando, hasta 2:1 en mujeres lactantes.
3. Interacción adipositos-células epiteliales de mama.

Investigaciones en nuestro laboratorio proveen evidencia de un cambio en los
proteoglicanos componentes de la matriz extracelular durante la diferenciación
de preadipocitos 3T3-L1 en cultivo .
La íntima relación entre el epitelio mamario y el tejido adiposo adyacente ha
sido establecida muy claramente tanto in vivo como in Vitro. La experiencia
previa en el laboratorio permitió encontrar una interacción entre células
epiteliales mamarias de ratón adulto (NMuMG, Normal Murine Mammary
Gland) y una línea celular preadipocítica de ratón (3T3-L1, fibroblastos de
embriones de ratones Swiss).
Como resultado de los experimentos se pudo detectar la presencia de factores
solubles que sintetizados por las células epiteliales mamarias de ratón,
reducían la acumulación de triglicéridos por parte de los preadipocitos 3T3-L1.
Este/os factor/es se caracterizó/aron en forma preliminar como proteicos por
tratamiento térmico y por filtración a través de membrana con poro definido.
4. El proyecto
Con el objetivo de estudiar la interacción entre el epitelio mamario y el tejido

adiposo se realizaron ensayos en los cuales se utilizó el medio condicionado de
una línea celular de epitelio mamario, MC NMUMG, sobre preadipocitos. Como
modelo de preadipocitos se utilizaron para los ensayos de la línea celular Swiss
3T3-L1 (American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA). Con el
propósito de utilizar un modelo más aproximado al fisiológico desarrollamos un
cultivo primario a partir de tejido adiposo supraescapulario de ratones machos

adultos CF1 de aproximadamente 3 meses al cual llamamos PAL
(Preadipocitos Acumuladores de Lípidos). Los primeros estudios sobre la
acumulación de triglicéridos se realizaron con los dos modelos de trabajo, para
comprobar la similitud de resultados obtenidos. Estudios posteriores se
realizaron con el cultivo primario solamente como, por ejemplo, los estudios de
expresión de factores de transcripción de la adipogénesis.
Comparación entre células 3T3-L1 y PAL
Para validar el modelo experimental propuesto anteriormente, se realizaron

ensayos morfológicos, bioquímicos y de diferenciación sobre células PAL y
3T3-L1. En los primeros ensayos realizados por microscopía óptica se analizó
la morfología celular y la formación de vacuolas lipídicas (refringentes al
microscopio). Como puede verse en la Figura 1, las células 3T3-L1 y PAL no
diferenciadas (ND = control) presentan forma estrellada de tipo fibroblástica,
típica de preadipocitos, mientras que las células diferenciadas (CD =
diferenciadas) presentan una morfología más redondeada y con vacuolas
refringentes.

A B
C D
Figura 1: Microscopía óptica de células 3T3-L1 (panel A células ND y panel B

células CD) y PAL (panel C células ND y panel D células CD) (400X).
Para determinar si las vacuolas refringentes observadas en la Fig. 1 B y D

contenían triglicéridos, realizamos sobre células PAL determinaciones por
microscopía y analíticas. La determinación al microscopio fue realizada
mediante la tinción Oil Red O que permite poner de manifiesto la presencia de
vacuolas lipídicas. Se consideraron células positivas para la acumulación de
triglicéridos a aquellas que presentaron una coloración rojiza-brillante. Como se
observa en la Figura 2 la muestra de células PAL diferenciadas (CD) muestra
un mayor número de células positivas respecto a la muestra de células PAL no
diferenciadas (ND). La determinación analítica consistió en la cuantificación de

la concentración de triglicéridos en las distintas muestras. Este parámetro será
utilizado como parámetro de diferenciación. Es decir, que células que
presenten una concentración de Tg no significativamente diferente al control
serán consideradas como células ND mientras que si la acumulación de Tg es
significativamente mayor a la del control serán consideradas como células CD.
Al microscopio las CD siempre presentan vacuolas características de
acumulación de triglicéridos, sin embargo no consideramos suficiente esta
observación para considerar las células como diferenciadas y por lo tanto
siempre se realizó la determinación cuantitativa de la concentración de
triglicéridos para considerarlas diferenciadas.
CD ND
Figura 2: Tinción Oil Red O de células PAL. Se observa un aumento en la acumulación de

Tg en células CD respecto a las células ND.
A
.
0,25 . 3,5 B
3
0,2
g Tg / g proteina
g Tg / g proteina
2,5
0,15 2
1,5
0,1
1
0,05
0,5
0 0
L1
ol
D
IO
ol
tr
C
3-
tr
R
on
on
A
3T
IM
C
C
PR

D
. C
300 .
250
800 .
700
% Tg / proteinas
% Tg / proteina
200 600
500
150 400
300
100
200
50 100
0
0
D
L1
ol
IO
C
CD
ol
tr
3-
tr
on
AR
3T
n
Co
C
IM
PR
Figura 3: Acumulación de Tg en células 3T3-L1 y en células PAL. En los paneles A y B se muestra

el valor absoluto de Tg normalizado por proteínas totales mientras que en los paneles C y D se
muestra el porcentaje de Tg normalizado por proteínas totales.
Como
CD se observa en la Figura 3 las células PAL diferenciadas muestran un
incremento significativo en la acumulación de Tg absoluta (Figura 3 panel A,
CD: 0.18 ± 0.02 vs. Control: 0.08 ± 0.01 g Tg/ g proteínas, p < 0.01) y
porcentual (Figura 3 panel C). Además podemos observar que aunque tanto
PAL como 3T3-L1 muestran un incremento significativo en la acumulación de
Tg cuando se induce la diferenciación, la acumulación de Tg en células PAL es
menor que en células 3T3-L1 (Figura 3, paneles A y B CD PAL: 0.18 ± 0.02 vs.
CD 3T3-L1: 2.74 ± 0.49 g Tg/ g proteínas, p < 0.01).

Estos resultados demuestran que las células PAL presentan un
comportamiento similar al de la línea celular 3T3-L1, ya caracterizada como
células fibroblásticas pre-adipocitos que se diferencian a adipocitos. Como se
mencionó anteriormente, las células PAL presentan tanto aspectos
morfológicos característicos como aspectos bioquímicos propios de este linaje,
como ser la acumulación de Tg en vacuolas citoplasmáticas. Esto nos permite
utilizar este cultivo primario como un buen modelo fisiológico para estudiar la
interacción entre el epitelio mamario y el tejido adiposo. Dado que las líneas
celulares se adaptan a las condiciones del cultivo durante su crecimiento, un
cultivo primario permite obtener resultados que serían más representativos de
lo que ocurre in vivo y por lo tanto más fáciles de extrapolar.
Efectos de la interacción epitelio mamario – tejido adiposo: estudios

sobre temporalidad del efecto observado sobre la acumulación de
triglicéridos en 3T3-L1 y PAL
Calvo et al. mostraron que las células de epitelio mamario secretan un factor
proteico que sería el responsable de la inhibición de la acumulación de
triglicéridos por parte de los adipocitos y evitaría la diferenciación de los
preadipocitos en adipocitos.
Además, hemos mostrado que la concentración de suero a la cual se cultive la
línea celular NMUMG no afecta el nivel de inhibición sobre la acumulación de
triglicéridos causada por el medio condicionado. Esto se observa en la Figura
4, donde concentraciones de 1% hasta 20% de suero fetal bovino en el medio
de cultivo utilizado para el crecimiento de las células NMuMG, no modifican el
nivel de inhibición observado con el medio condicionado, obteniéndose niveles
de triglicéridos similares a los observados en las células 3T3 – L1 no
diferenciadas (control).

350
300
250
% Tg/Prot
200
150
100
50
0
CD Control 20% 10% 5% 2% 1%
Figura 4: Acumulación de Tg en 3T3-L1 luego del tratamiento con MC NMuMG obtenido

a partir de distintas concentraciones de SFB.
Una vez confirmado que el PAL obtenido es un buen modelo de diferenciación

de preadipocitos decidimos estudiar los efectos que producen las células de
epitelio mamario sobre la diferenciación de preadipocitos utilizando tanto la
línea establecida 3T3-L1 como el cultivo primario. Según los resultados
previamente mencionados, recolectamos medio condicionado de las células
NMuMG (MC NMuMG) y determinamos el efecto del mismo sobre la
acumulación de triglicéridos en nuestros dos modelos de trabajo.
Paralelamente a este trabajo, en nuestro laboratorio se realizan estudios físico-
químicos para identificar el factor presente en el MC NMuMG denominado por
nosotros TgIF (Triglyceride inhibiting factor).
Como mencionamos anteriormente, utilizamos como parámetro bioquímico
para determinar diferenciación la acumulación de Tg. Para probar si TgIF
realmente estaba inhibiendo la diferenciación de los preadipocitos estudiamos
el patrón temporal de acumulación de triglicéridos en PAL y 3T3-L1. El TgIF fue
agregado a diferentes tiempos, tomando como día 0 el momento en el que se
agrega medio de diferenciación a las células en cultivo. La determinación de la
acumulación de Tg se hizo, para todas las muestras, a los 8 días. Como se
observa en la Figura 5 el patrón de acumulación de Tg en función del tiempo

fue similar para los dos tipos celulares. El tratamiento con TgIF a diferentes
tiempos disminuyó la acumulación de Tg en todos los casos, siendo más
marcada esta disminución para los tiempos 0 y 24 h. Estas dos condiciones
que llevan al máximo de inhibición serán las utilizadas para los ensayos de
factores de transcripción de la adipogénesis.
400
350
300
250
% Tg/Prot
200
150
100
50
0
Figura 5: Acumulación de triglicéridos en PAL y 3T3-L1 luego del tratamiento
IO
l
l
h
h
h
L1
h
0h
0h
tro
tro
72
48
72
24
48
24
AR
C
3-
on
on
con el MC NMUMG agregado post-diferenciación. Efecto temporal.
IM
3T
C
C
PR
Al realizar la comparación de los resultados obtenidos de los tratamientos con

factor respecto del contenido de triglicéridos de las células tratadas con
vehículo (control = ND) observamos que el tratamiento provoca una
disminución significativa (p < 0.01) en el contenido de triglicéridos de las
células PAL y 3T3-L1 tratadas con factor respecto del contenido en las CD,
mostrando un importante efecto del TgIF durante el proceso de diferenciación.
Al comparar las células tratadas con las células control observamos que: A)
para el cultivo primario PAL no se observan diferencias significativas para los
tratamientos F0 y F24 respecto de control (ND), mientras que sí hay diferencias
significativas (p < 0.01) para los otros tiempos de tratamiento estudiados; B)
para la línea 3T3-L1 se observa un nivel de triglicéridos significativamente
diferente (p < 0.01) al obtenido en el control para todos los tiempos de
tratamiento, con menores valores de contenido de triglicéridos en los
tratamientos realizados en las primeras 24 horas (F0 y F24). Por este motivo se
decidió estudiar la expresión de factores de transcripción en la etapa temprana
de la diferenciación y utilizar el cultivo primario PAL que permitiría entender el
problema con un modelo más fisiológico.

Estos resultados sugieren que el factor proteico descrito por Calvo et al., el cual
inhibe la diferenciación de las células 3T3-L1, tendría el mismo efecto sobre las
células PAL desarrolladas en el laboratorio. Además el hecho que la inhibición
por el TgIF haya sido mayor cuando éste fue agregado dentro de las primeras
24 h post diferenciación nos estaría indicando que la vía de acción de este
factor podría estar relacionada con algún evento involucrado en las etapas
tempranas de este proceso.
Efectos del factor sobre la expresión de factores de transcripción

involucrados en la adipogénesis
Dadas las primeras evidencias del rol inhibitorio del TgIF sobre la diferenciación
de los preadipocitos, nos preguntamos si éste estaría afectando la expresión de
factores de transcripción involucrados en la adipogénesis. Conociendo cuáles
son estos factores de transcripción y basándonos en nuestros resultados
anteriores que involucran al TgIF en la fase temprana de la diferenciación
llevamos a cabo ensayos de Western Blot.
Para esto tratamos a preadipocitos PAL con TgIF a tiempo cero (F0) y a tiempo
24 h (F24) y evaluamos la expresión de los factores de transcripción C/EBP β ,
C/EBP δ  C/EBP α y PPARγ. Dado que durante la adipogénesis la expresión
de los factores de transcripción es transitoria, realizamos un estudio de tipo
cinético evaluando la expresión de cada uno de ellos a lo largo de la
diferenciación celular. Para ello, una vez agregado el TgIF al cultivo, se
levantaron las células el día posterior del tratamiento con el factor (día 1), así
como a los 2, a los 4 y a los 6 días con posterioridad a la inclusión del factor en
el medio de cultivo. Como controles se utilizaron preadipocitos incubados en
DMEMc (control negativo = ND) y preadipocitos incubados en medio de
diferenciación (control positivo = CD). Todos los valores fueron relativizados
respecto del valor obtenido para el control positivo el día 1 y se expresan como
unidades relativas (UR) al día 1. En la Figura 7 se muestran los Western Blots
obtenidos para cada factor de transcripción en las condiciones control y F0. Se
muestra un control de carga obtenido a partir del revelado de las membranas
con anticuerpo anti-actina para el caso de la membrana revelada con

anticuerpo anti-C/EBP β . En todos los experimentos realizados se cargó, en
cada calle, la misma concentración de proteínas.
Control F0 Actina
1 2 4 6 1 2 4 6 1 2 4 6
C/EBPβ
C/EBPδ
C/EBPα
PPARγ
Figura 7: Western Blots obtenidos para cada factor de transcripción cuando los
preadipocitos PAL fueron tratados con DMEMc (control) o con TgIF a tiempo cero (F0).
Se muestra además un control de carga (Actina).
La Figura 8 muestra los primeros resultados obtenidos para la cinética de

expresión del C/EBP β . Se puede observar un importante aumento de la
expresión de C/EBP β en las CD respecto del control negativo para todos los
tiempos estudiados. La cinética observada para C/EBP β en aquellos

preadipocitos en los cuales la diferenciación ha sido inducida muestra una
mayor expresión para este factor de transcripción posterior al día 1; el patrón
de expresión mostraría un incremento entre los días 2 y 4, mientras que
disminuiría aunque de forma no significativa el día 6. El efecto de TgIF (Fo) es
evidente al día 1 post tratamiento, aunque no lleva a la expresión de este factor
a los niveles basales observados en el control negativo. Las columnas
correspondientes al día 1, 2 y 6 post diferenciación mantuvieron el mismo perfil,
mientras que las células que fueron levantadas el día 4 mostraron una marcada
disminución en la expresión de C/EBP β , de esta forma es evidente que el
efecto de TgIF continúa luego del día 1, mostrando un mayor efecto al día 4.
Estos resultados son coincidentes con el hecho de que las células tratadas con
el factor son capaces de acumular triglicéridos en menor cantidad de las CD.

Por otro lado, las células tratadas con factor TgIF 24 h post-diferenciación,
mostraron una menor expresión del C/EBP β que la observada en las CD (día
2: 1.326 UR (CD), 0.834 UR (TgIF); día 4: 1.314 UR (CD), 1.122 UR (TgIF))
(datos no mostrados).
C/EBP β
1,8
1,6
1,4
1,2
1
UR
0,8
0,6
0,4
0,2
0
C+ C- Fo
Día 1 1 0,587
Día 2 1,326 0,164 0,756
Día 4 1,314 0,183
Día 6 0,699 0,313
Figura 8: Cinética obtenida para la expresión del factor de transcripción C/EBPβ. Los valores
fueron relativizados respecto al valor obtenido para el Día 1 del control positivo.
La Figura 9 muestra los resultados obtenidos para la cinética de expresión del

factor de transcripción C/EBPδ. La diferenciación induce la expresión de C/EBP
δ tempranamente, la cual se mantiene elevada durante el tiempo evaluado del
experimento de diferenciación, con un leve descenso no significativo el día 6. El
tratamiento con TgIF (Fo) parecería inducir un incremento en el nivel de
expresión del C/EBPδ durante los primeros dos días de diferenciación celular
respecto de CD, mientras que tardíamente (al día 4) se ve un efecto inhibitorio.
Las células tratadas con factor TgIF 24 h post-diferenciación, mostraron una
menor expresión de C/EBPδ respecto de CD (día 2: 3.041 UR (CD), 0.82 UR

(TgIF); día 4: 3.538 UR (CD), 1.150 UR (TgIF); día 6: 3.139 UR (CD), 2.080 UR
(TgIF)) (datos no mostrados).
C/EBPδ
4,5
3,5
3
UR
2,5
1,5
0,5
0
C+ C- Fo
Día 1 1 3,420
Día 2 3,042 2,480
Día 4 3,538 0,534 1,048
Día 6 3,139 2,100
Figura 9: Cinética obtenida para la expresión del factor de transcripción C/EBPδ. Los valores
Los resultados de los niveles de expresión para el factor de transcripción

C/EBPα se muestran en la Figura 10. Se observa un incremento del 20%
aproximadamente en la expresión de C/EBPα en CD respecto del control
negativo a partir del día 2, el cual no se mantuvo en el tiempo. El tratamiento
con factor TgIF agregado en el momento de la diferenciación modificó este
perfil pues produjo un descenso en la expresión del C/EBPα el día 4, que
resultó ser menor a la observada en el control negativo. Dado que está descrito
que este factor de transcripción se induce tardíamente (recién al día 4 en
células 3T3-L1), no deja de sorprender que en CD no se vea claramente este
incremento; aunque es notable el efecto que produce el TgIF en ese momento,
en coincidencia con la disminución de la expresión de C/EBPβ en ese tiempo
experimental. Mientras que la disminución observada para el día 6 es
coincidente con CD, por lo que no podemos descartar que durante el proceso
de diferenciación ocurra una disminución de la expresión de C/EBPα al día 6.

Las células tratadas con factor TgIF 24 h post-diferenciación mostraron menor
expresión del factor de transcripción respecto de CD en los días 2 y 4 (día 2:
1.221 UR (CD), 0.474 UR (TgIF); día 4: 1.220 UR (CD), 1.020 UR (TgIF))
(datos no mostrados).
C/EBPα
1,8
1,6
1,4
1,2
UR
0,8
0,6
0,4
0,2
0
C+ C- Fo
Día 1 1 1,477
Día 2 1,221 0,828 1,476
Día 4 1,220 0,343
Día 6 0,280 0,473
Figura 10: Cinética obtenida para la expresión del factor de transcripción C/EBPα. Los valores
En el caso del factor de transcripción PPARγ los resultados se exponen en la

Figura 11. En coincidencia con lo descrito hasta ahora en la bibliografía para la
diferenciación de células 3T3-L1, PPARγ aumenta su expresión al día 4 del
proceso de diferenciación celular La cinética de expresión muestra un aumento
significativo el día 4, que no se mantiene en el tiempo.
El tratamiento con factor TgIF agregado en el momento de la diferenciación
modificó este perfil pues produjo un descenso en la expresión del PPARγ el día
4, la cual es coincidente con lo observado para C/EBPβ y C/EBPα, siendo un
resultado esperado dado que C/EBPβ es factor de transcripción para el gen de
PPARγ.
El tratamiento con TgIF 24 h post-diferenciación mostró una disminución en la
expresión de PPARγ respecto de CD el día 2 (día 2: 1.128 UR (CD), 0.687 UR
(TgIF)) y un aumento respecto a CD el día 6 (día 6: 0.316 UR (CD), 0.734 UR

(TgIF)). El día 4 no se observaron diferencias respecto a CD (día 6: 1.859 UR
(CD), 1.757 UR (TgIF)) (datos no mostrados).
PPARχ
2,5
1,5
UR
0,5
0
C+ C- Fo
Día 1 1 0,826
Día 2 1,128 0,830 0,749
Día 4 1,859 0,923
Día 6 0,316 0,208
Figura 11: Cinética obtenida para la expresión del factor de transcripción PPARγ. Los valores
Puede verse en las Figuras 8 a 11 que la expresión de los factores de

transcripción en células PAL difiere respecto a lo descrito para células 3T3-L1
(54). En cuanto a C/EBPβ, está descrito para 3T3-L1 un rápido aumento en la
expresión, llegando a un pico 24 h después de inducida la diferenciación y
disminuyendo a partir del día 2 lentamente. En la Figura 8 se observa un
incremento en la expresión de C/EBPβ 24 h post – diferenciación pero este alto
nivel se mantuvo durante todos los días ensayados. La cinética descripta en
3T3-L1 para C/EBPδ es similar a la descrita para C/EBPβ con la diferencia que
a partir del día 2 disminuye abruptamente su expresión. Al igual que para 3T3-
L1, en células PAL (Figura 9) observamos un incremento en la expresión
durante las primeras 48 h y posteriormente, un nivel de expresión sostenido. En
cuanto a C/EBPα, este factor comienza a expresarse lentamente a partir de las
24 h post diferenciación, alcanzando su nivel de máxima expresión 72 h post
diferenciación y manteniéndose en el tiempo. En células PAL (Figura 10) vimos

que la expresión de este factor comenzó a aumentar también 24 h post
diferenciación pero alcanzó su máximo nivel de expresión ya a las 48 h. En
este caso no se mantuvo el nivel de expresión durante los siguientes días
ensayados. Respecto a PPARγ se ha visto en 3T3-L1 que su expresión
antecede la inducción de C/EBPα en la cascada de eventos que conducen a la
diferenciación de los adipocitos (68). Sin embargo, en células PAL (Figura 11),
la expresión de PPARg comenzó a aumentar lentamente también 24 h post
diferenciación hasta el día 4, en donde se obtuvo el pico de máxima expresión
y a partir de donde comenzó a caer. Estos resultados, aunque parciales hasta
el momento pues falta repetirlos para poder realizar un análisis estadístico,
estarían sugiriendo que los eventos genéticos que llevan a la expresión de
adipoquinas difieren entre células PAL (cultivo primario) y células 3T3-L1 (línea
establecida). Esto puede deberse, por ejemplo, a que la adaptación de la línea
celular 3T3-L1 en cultivo conlleva modificaciones que son inherentes a un
crecimiento indefinido y que a pesar de ser diploides la alejan de un modelo
fisiológico, mientras que las células PAL son un modelo más cercano a las
célula normales presentes en el individuo mostrando senescencia después de
cierta cantidad de pasajes.
Respecto al tratamiento con TgIF, la expresión de C/EBPβ se vio disminuida
durante todos los tiempos ensayados, mostrando un mayor efecto al día 4. Sin
embargo, TgIF parecería haber inducido un incremento en el nivel de expresión
del C/EBPδ durante los primeros dos días de diferenciación celular respecto de
CD, mientras que tardíamente (al día 4) se vio un efecto inhibitorio. El TgIF
produjo un descenso en la expresión del C/EBPα y PPARg el día 4. Esto es
coincidente con la disminución de la expresión de C/EBPβ y en ese tiempo
experimental y el hecho que estos dos factores de transcripción regulan la
expresión de C/EBPα y PPARγ. Mientras que la disminución observada para el
día 6 es coincidente con CD, por lo que no podemos descartar que durante el
proceso de diferenciación de células PAL ocurra una disminución de la
expresión de C/EBPα al día 6. Estos resultados sugieren que TgIF estaría
afectando la acumulación de Tg tempranamente, a través de la inhibición de la
expresión de C/EBPβ (desde 24 h y más marcadamente a los 4 días post

diferenciación) y tardíamente a través de C/EBPδ (a partir del día 4 post
diferenciación).
En este trabajo hemos desarrollado un modelo in vitro de diferenciación a partir
de un cultivo primario de preadipocitos de ratón. Hemos demostrado que este
modelo, más fisiológico, muestra un comportamiento similar al ya descrito para
la línea celular 3T3-L1 tanto para aspectos morfológicos como para la
acumulación de triglicéridos. Sin embargo, cuando estudiamos la expresión de
los factores de transcripción responsables de la diferenciación de los
preadipocitos observamos diferencias en los perfiles temporales de su
expresión. Esto podría deberse a la adaptación de las líneas celulares a las
condiciones del cultivo durante su crecimiento.
Por otra parte, el tratamiento de células PAL con TgIF mostró un mayor efecto
sobre la acumulación de Tg cuando éste fue agregado el día 0 y 24 h post-
diferenciación. Esto sugiere que la acción de este factor sobre la diferenciación
de los preadipocitos es en algún evento de la fase temprana de la
adipogénesis. Nuestros resultados mostraron un efecto inhibitorio de este factor
sobre la expresión de C/EBPβ (a partir del día 1) y C/EBPδ (a partir del día 4)
que condujo a la inhibición de los factores de transcripción tardíos C/EBPα y
PPARγ, responsables de la expresión de adipoquinas.

TgIF
PPARγ
+ +
Adipoquinas y
Gen c/ebpβ C/EBPβ
acumulación de
Tg
Gen c/ebpδ C/EBPδ

+
C/EBPα +
Día
4
TgIF
En el laboratorio del Dr. Juan Carlos Calvo se continúa este estudio de

purificación y caracterización del TgIF el cual está siendo desarrollado por
Francisco Adot y la Dra. Liliana Guerra. Es nuestro objetivo poder determinar si
TgIF es una proteína ya conocida para la cual describimos una nueva función o
si se trata de una nueva proteína. La interacción entre células epiteliales
mamarias y el tejido adiposo en la glándula mamaria podría llegar a variar en
las diferentes fases del desarrollo de la misma. Sería importante realizar
estudios que permitan evaluar la expresión de TgIF en los diferentes estadios
de la mama normal para así conocer más sobre su rol fisiológico.
5. El método
La proteómica
Desde 1995, más de 640 proyectos de genoma han sido completados,
incluyendo organismos procariotas y eucariotas, así como el proyecto del
genoma humano. Muchos estudios han sido realizados para definir las
secuencias del ADN, correspondientes a las regiones genómicas expresadas y
almacenadas en la base de datos EST (expressed Sequence Tag). Sin
embargo, aunque accesible, las secuencias del EST no aportan información

confiable sobre la función biológica de una cierta proteína. Por otro lado,
definen facetas de la expresión genómica, características en condiciones
normales o patológicas, incluyendo diferenciación celular y muerte celular. La
comparación de la biblioteca cDNA, y la diferenciación del ARNm de las
eucariotas se pueden utilizar para caracterizar y cuantificar la expresión
genómica en diferentes tipos de células.
El análisis globar del ARNm presente en una célula en un momento específico
es importante para obtener la información sobre la real actividad transcripcional
de la célula, pero ese análisis no describe propiedades importantes de las
proteínas expresadas, por ejemplo: la abundancia relativa sobre todas las
proteínas en un tipo de célula. De hecho, ha sido demostrado que no hay una
relación linear entre la cantidad de ARNm y la cantidad de la proteína
correspondiente. En realidad, la cantidad de especies de proteínas en las
células eucariota ha aumentado notoriamente gracias al Splicing alternativo en
el momento de la transcripción y una gran variedad de modificaciones co- y
post- traduccional, importantes para la función de la proteína.
Para describir este fenómeno la palabra PROTEOMA se introdujo para indicar
el set completo de proteínas que se expresan, y se modifican tras la expresión,
en el genoma completo durante la vida de una célula o un tejido. La secuencia
de ADN de un genoma no cambia, a menos que haya una mutación, durante la
vida de un organismo. Por otro lado, el proteoma representa una entidad muy
dinámica, cuya composición depende del contexto y su cambio se basa en el
estado de la expresión genómica, y por lo tanto en función del tiempo, del
estado de la célula, del ambiente y del estado psicopatológico del organismo.
La proteómica se acerca al análisis de muestras biológicas complejas
apuntadas en gran escala a la visualización y caracterización de la expresión
genética. De esta manera las propiedades temporales, del espacio y
funcionales de una gran cantidad de proteínas diferentes pueden ser anotadas,
incluyendo información del producto del gen primario como también los
productos con modificaciones post-traduccionales que el genoma puede
expresar en un momento especifico, compartimiento celular, o en el contexto
especifico del proceso biológico.
Siguiendo estas consideraciones, la proteómica puede ser dividida en tres
categorías básicas:

1- profiling/expresión proteomics: esta orientada a catalogar la
expresión de todas las proteínas presentes en células, tejidos celulares,
organismos o descifrar proteínas que están expresadas diferente en
cualquier condición psicológica, patológica o de desarrollo dada.
2- Functional proteomics: principalmente orientada en delinear las
interacciones proteína-proteína, actividad enzimática, señalización de los
caminos río abajo y modificaciones post-traduccionales. Y por ultimo
descifrar la función molecular de una célula completa, describiendo
todas las maquinas moleculares, sus funciones, sus reacciones ante
estimulación externa y sus interconectividades.
3- Structural proteomics: principalmente orientada a definir la estructura
3D de las proteínas representativas de cada familia encontrada en un
organismo viviente. Este es uno de los componentes cruciales para el
entendimiento de la funcionalidad de las proteínas no caracterizadas.
La teoría y las técnicas para la descripción del proteoma sido realizadas

durante los pasados 15 años apuntando a definir la mayor cantidad posible de
componentes proteicos de las células y tejidos, derivando de la expresión
genética las subsecuentes modificaciones. Los potenciales y las desventajas
de la tecnología y el rango de aplicación de la técnica de la proteómica,
incluyendo biomedicina y biología han sido las primeras en describir en un libro
titulado “proteom Research: New Fronteirs Genomics”. Este libro puede
representar un buen comienzo para todos los científicos que quieren empezar
con investigaciones sobre el proteoma.
A nivel practico en los laboratorios de investigación para realizar la proteómica
se hace una purificación parcial de un extracto proteico, esta purificación
parcial puede realizarse obteniendo medios condicionados por células que
secretan la proteína de interés, a partir de allí se realiza una cromatografía
sólida-liquida (en nuestro caso una columna de tamiz molecular, la cual separa
las proteínas por su peso molecular), a partir de allí precipitan las diferentes
proteínas obtenidas(cada una por separado) y se realiza una electroforesis que
permita una mejor caracterización y se lleva el material obtenido a una técnica
que se llama espectrofotometría de masa, que nos informa la secuencia de la
proteína y de esta manera comparando esta secuencia con los bancos de

datos previamente mencionados, que poseen información sobre todas las
proteínas conocidas, se puede deducir si estamos frente a una nueva proteína
o una ya descripta. En nuestro laboratorio realizamos el extracto proteico y la
caracterización hasta la electroforesis, en la facultad de ciencias exactas hay
un servicio de espectrofotometría de masa que completa el proceso nos
informa esta secuencia.

INTRODUCCION

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Introducción

Investigadora: Dra. Liliana N. Guerra

Alumnas: Fabiana Durante y Tamara Broitman

Autor: Fabiana Durante y Tamara Broitm Página 1 de 26

Tomando en cuenta los antecedentes de nuestro laboratorio y los resultados

Es un tejido conjuntivo especializado en el que predominan las células

Autor: Fabiana Durante y Tamara Broitm Página 2 de 26

El tejido adiposo se clasifica en adiposo unilocular y el tejido adiposo

Tejido adiposo unilocular o blanco

Autor: Fabiana Durante y Tamara Broitm Página 3 de 26

Tejido adiposo multilocular o marrón

Procesos en la diferenciación a adipocitos

Autor: Fabiana Durante y Tamara Broitm Página 4 de 26

Hasta ahora, se han descrito dos familias de factores de transcripción, las

Autor: Fabiana Durante y Tamara Broitm Página 5 de 26

Autor: Fabiana Durante y Tamara Broitm Página 6 de 26

3. Interacción adipositos-células epiteliales de mama.

Con el objetivo de estudiar la interacción entre el epitelio mamario y el tejido

Autor: Fabiana Durante y Tamara Broitm Página 7 de 26

Comparación entre células 3T3-L1 y PAL

Para validar el modelo experimental propuesto anteriormente, se realizaron

Autor: Fabiana Durante y Tamara Broitm Página 8 de 26

Figura 1: Microscopía óptica de células 3T3-L1 (panel A células ND y panel B

Para determinar si las vacuolas refringentes observadas en la Fig. 1 B y D

Autor: Fabiana Durante y Tamara Broitm Página 9 de 26

Figura 2: Tinción Oil Red O de células PAL. Se observa un aumento en la acumulación de

Autor: Fabiana Durante y Tamara Broitm Página 10 de 26

Figura 3: Acumulación de Tg en células 3T3-L1 y en células PAL. En los paneles A y B se muestra

Autor: Fabiana Durante y Tamara Broitm Página 11 de 26

Efectos de la interacción epitelio mamario – tejido adiposo: estudios

Autor: Fabiana Durante y Tamara Broitm Página 12 de 26

Figura 4: Acumulación de Tg en 3T3-L1 luego del tratamiento con MC NMuMG obtenido

Una vez confirmado que el PAL obtenido es un buen modelo de diferenciación

Autor: Fabiana Durante y Tamara Broitm Página 13 de 26

Al realizar la comparación de los resultados obtenidos de los tratamientos con

Autor: Fabiana Durante y Tamara Broitm Página 14 de 26

Efectos del factor sobre la expresión de factores de transcripción

Autor: Fabiana Durante y Tamara Broitm Página 15 de 26

La Figura 8 muestra los primeros resultados obtenidos para la cinética de

tiempos estudiados. La cinética observada para C/EBP β en aquellos

Autor: Fabiana Durante y Tamara Broitm Página 16 de 26

La Figura 9 muestra los resultados obtenidos para la cinética de expresión del

Autor: Fabiana Durante y Tamara Broitm Página 17 de 26

Los resultados de los niveles de expresión para el factor de transcripción

Autor: Fabiana Durante y Tamara Broitm Página 18 de 26

En el caso del factor de transcripción PPARγ los resultados se exponen en la

Autor: Fabiana Durante y Tamara Broitm Página 19 de 26

Puede verse en las Figuras 8 a 11 que la expresión de los factores de

Autor: Fabiana Durante y Tamara Broitm Página 20 de 26

Autor: Fabiana Durante y Tamara Broitm Página 21 de 26

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Gen c/ebpδ C/EBPδ

En el laboratorio del Dr. Juan Carlos Calvo se continúa este estudio de

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Autor: Fabiana Durante y Tamara Broitm Página 24 de 26

La teoría y las técnicas para la descripción del proteoma sido realizadas

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