VIGESIMA CUARTA (24) CLASE DE BIOQUIMICA

(SEGUNDO SEMESTRE 2020)

MARTES 3 de NOVIEMBRE DE 2020
CINÉTICA ENZIMATICA
Catedrático: Ing. Q. César Alfonso García G.

Los inhibidores enzimáticos son moléculas que se unen a enzimas y disminuyen

su actividad. Puesto que el bloqueo de una enzima puede matar a un agente patógeno o
corregir un desequilibrio metabólico, muchos medicamentos actúan como inhibidores
enzimáticos.
También son usados como herbicidas y pesticidas. Sin embargo, no todas las moléculas
que se unen a las enzimas son inhibidores; los activadores enzimáticos se unen a las
enzimas e incrementan su actividad.
La unión de un inhibidor puede impedir la entrada del sustrato al sitio activo de la enzima
y/u obstaculizar que la enzima catalice su reacción correspondiente. La unión del inhibidor
puede ser reversible o irreversible.

1
Modelo estructural de la proteasa del virus del sida unida a un inhibidor de la proteasa,
el ritonavir. La estructura de la proteasa se muestra mediante cintas de color rojo, azul y
amarillo, mientras que el inhibidor es representado por una estructura de esferas y varillas
cerca del centro de la proteasa.

Normalmente, los inhibidores irreversibles reaccionan con la enzima de forma covalente y

modifican su estructura química a nivel de residuos esenciales de
los aminoácidos necesarios para la actividad enzimática. En cambio, los inhibidores
reversibles se unen a la enzima de forma no covalente, dando lugar a diferentes tipos de
inhibiciones, dependiendo de si el inhibidor se une a la enzima, al complejo enzima-
sustrato o a ambos.
Muchos medicamentos son inhibidores enzimáticos, por lo que su descubrimiento y mejora
es un campo de investigación activo en la bioquímica y la farmacología. La validez de un
inhibidor enzimático medicinal suele venir determinada por su especificidad (su
incapacidad de unirse a otras proteínas) y su potencia (su constante de disociación, la cual
indica la concentración necesaria para inhibir a una enzima). Una alta especificidad y
potencia asegura que el medicamento va a tener pocos efectos secundarios y por tanto una
baja toxicidad.
Los inhibidores enzimáticos también son usados en la naturaleza y están implicados en la
regulación del metabolismo. Por ejemplo, las enzimas en una ruta metabólica pueden ser
inhibidas por los productos resultantes de sus respectivas rutas. Este tipo
de retroalimentación negativa retarda el flujo a través de la ruta cuando los productos
comienzan a acumularse y es una manera importante de mantener la homeostasis en
una célula.
Otros inhibidores enzimáticos celulares son proteínas que se unen específicamente e
inhiben una diana enzimática. Esto puede ayudar a controlar enzimas que pueden ser
dañinas para la célula, como las proteasas o nucleasas. Un buen ejemplo es el inhibidor de
la ribonucleasa, que se une a esta enzima en una de las interacciones proteína-proteína más
fuertes conocidas.1 Como inhibidores enzimáticos naturales también cabe destacar
los venenos, que son usados como defensa contra los depredadores o como forma de matar
a una presa.

2
3
Inhibidores o sustratos reversibles[editar]

4
Los inhibidores reversibles se unen a las enzimas mediante interacciones
no covalentes tales como los puentes de hidrógeno, las interacciones hidrofóbicas y
los enlaces iónicos.

Los enlaces débiles múltiples entre el inhibidor y el sitio activo se combinan para producir
una unión fuerte y específica. Al contrario de lo que ocurre con el sustrato y los inhibidores
irreversibles, los inhibidores reversibles generalmente no experimentan reacciones
químicas cuando se unen a la enzima y pueden ser eliminados fácilmente por dilución o
por diálisis.
Tipos de inhibidores reversibles[editar]

Inhibición competitiva: el sustrato (S) y el inhibidor (I) compiten por el sitio activo
(cavidad de la enzima).

5
CINETICA ENZIMATICA - inhibición

Ejemplos
Aspirina (prostaglandinsintasa)
Penicilina (glicopeptidotranspeptidasa)
AZT (HIV reverse transcriptasa)
Viagra(cGMPfosfodiesterase)
Metanol (alcohol deshidrogenasa)

6
Existen tres tipos de inhibidores reversibles. Se clasifican en base al efecto producido por
la variación de la concentración del sustrato de la enzima en el inhibidor.2

7
• En la inhibición competitiva, el sustrato y el inhibidor no se pueden unir a la
misma enzima al mismo tiempo, como se muestra en la figura de la derecha. Esto
generalmente ocurre cuando el inhibidor tiene afinidad por el sitio activo de una
enzima en el que también se une el sustrato; el sustrato y el
inhibidor compiten para el acceso al sitio activo de la enzima. Este tipo de
inhibición se puede superar con concentraciones suficientemente altas del
sustrato, es decir, dejando fuera de competición al inhibidor. Los inhibidores
competitivos son a menudo similares en estructura al sustrato verdadero (ver
ejemplos expuestos más abajo).

8
 • En la inhibición no competitiva, el inhibidor se puede unir a la enzima al mismo
tiempo que el sustrato. Sin embargo, la unión del inhibidor afecta la unión del
sustrato, y viceversa. Este tipo de inhibición se puede reducir, pero no superar al
aumentar las concentraciones del sustrato. Aunque es posible que los inhibidores
de tipo mixto se unan en el sitio activo, este tipo de inhibición resulta
generalmente de un efecto alostérico donde el inhibidor se une a otro sitio que no
es el sitio activo de la enzima. La unión del inhibidor con el sitio
alostérico cambia la conformación (es decir, la estructura terciaria o la forma
tridimensional) de la enzima de modo que la afinidad del sustrato por el sitio
activo se reduce.
• La inhibición mixta, es una forma de inhibición mixta donde la unión del
inhibidor con la enzima reduce su actividad pero no afecta la unión con el
sustrato. Como resultado, el grado de inhibición depende solamente de la
concentración de inhibidor.
Descripción cuantitativa de la inhibición reversible[editar]
La inhibición reversible puede ser descrita cuantitativamente en términos de la unión del
inhibidor a la enzima y al complejo enzima-sustrato, y sus efectos en las constantes
cinéticas de la enzima. En el esquema clásico de Michaelis-Menten mostrado abajo, una
enzima (E) se une a su sustrato (S) para formar el complejo enzima-sustrato (ES). En la
catálisis, este complejo se rompe para liberar el producto (P) y la enzima (E). El inhibidor
(I) puede unirse tanto a (E) como a (ES) con las constantes de disociación Ki o Ki',
respectivamente.

Los inhibidores competitivos se pueden unir a (E), pero

no a (ES). La inhibición competitiva aumenta el valor
de Km (es decir, el inhibidor interfiere con la unión del Esquema cinético aplicable a
sustrato), pero no afecta a la Vmax (el inhibidor no los inhibidores enzimáticos
reversibles.

9
obstaculiza la catálisis en (ES) porque no se puede unir a
(ES)).3

Los inhibidores no competitivos tienen afinidades

idénticas por (E) y (ES) (Ki = Ki'). La inhibición no
competitiva no cambia la Km (es decir, no afecta a la unión
del sustrato) pero disminuye la Vmax (es decir, la unión del
inhibidor obstaculiza la catálisis).3

• Los inhibidores de tipo mixto se unen tanto

a (E) como a (ES), pero sus afinidades por estas dos formas
de enzimas son distintas (Ki ≠ Ki'). Por lo tanto, los
inhibidores de tipo mixto interfieren con la unión del
sustrato (incremento de Km) y dificulta la catálisis en el
complejo (ES) (disminución de la Vmax).3

Cuando una enzima tiene múltiples sustratos, los inhibidores pueden mostrar distintos tipos
de inhibiciones dependiendo del sustrato que se considere, ya que el sitio activo posee dos
diferentes lugares para la unión con el sustrato en el mismo sitio activo, uno para cada
sustrato. Por ejemplo, un inhibidor puede competir con el sustrato A por el primer sitio de
unión, pero ser un inhibidor no competitivo con respecto al sustrato B en el segundo sitio
de unión.3
Medición de las constantes de disociación en un inhibidor reversible[editar]

10
Diagramas de Lineweaver-Burke de los diferentes tipos de inhibidores enzimáticos
reversibles. La flecha muestra el efecto producido por el incremento de las concentraciones
de inhibidor.

Según lo observado arriba, un inhibidor enzimático está caracterizado por sus

dos constantes de disociación, Ki y Ki', de la enzima y del complejo enzima-sustrato,
respectivamente. La constante del complejo enzima-inhibidor Ki puede ser medida
directamente por varios métodos. Un método extremadamente exacto es la calorimetría

11
 isoterma de titulación, en donde el inhibidor es titulado en una solución de enzimas y el
calor liberado o absorbido es medido.4 Sin embargo, la otra constante de disociación Ki' es
difícil de medir directamente, ya que el complejo enzima-sustrato tiene un periodo de vida
muy corto y está dando lugar a la reacción química para formar el producto. Por lo tanto, Ki'
suele medirse de forma indirecta, observando la actividad enzimática bajo varias
concentraciones de sustrato e inhibidor, y ajustando los datos5 a una ecuación de
Michaelis–Menten modificada:

donde los factores de modificación α y α' son definidos por la concentración del inhibidor
y sus dos constantes de disociación

Así, en presencia del inhibidor, la efectividad de la enzima Km y Vmax es ahora (α/α')Km y

(1/α')Vmax, respectivamente. Sin embargo, la ecuación de Michaelis-Menten modificada
asume que la unión del inhibidor a la enzima alcanza el equilibrio, el cual puede ser un
proceso muy lento para los inhibidores con constantes secundarias nanomolares de
disociación. En estos casos, es usualmente más práctico tratar al inhibidor de unión fuerte
como un inhibidor irreversible (ver abajo). Sin embargo, todavía puede ser posible
estimar Ki' cinéticamente si Ki es medido independientemente.5
Los efectos de diferentes tipos de inhibidores enzimáticos reversibles en la
actividad enzimática pueden ser visualizados usando la representación gráfica de la
ecuación de Michaelis–Menten, mediante los diagramas de Lineweaver-Burke o de Eadie-
Hofstee. Por ejemplo, en los diagramas de Lineweaver-Burk a la derecha, las líneas de la
inhibición competitiva intersecan el eje-y, ilustrando que tales inhibidores no afectan a
la Vmax. De igual manera, las líneas de la inhibición no competitiva intersecan el eje-x,
mostrando que estos inhibidores no afectan a la Km. Sin embargo, puede ser complicado
estimar Ki y Ki' con precisión en estos diagramas, por lo que es recomendable estimar estas
constantes usando métodos más fiables de regresión no lineal,6 según lo descrito arriba.
Casos especiales[editar]

• El mecanismo de la inhibición parcialmente competitiva es similar al de la inhibición no

competitiva, excepto que el complejo EIS tiene actividad catalítica, la cual decrece o
incluso aumenta (activación parcialmente competitiva) en comparación al complejo

12
 enzima-sustrato (ES). Esta inhibición suele exhibir un valor más bajo de Vmax, pero un valor
de Km inalterado.3

• La inhibición acompetitiva se produce cuando el inhibidor se une sólo al complejo

enzima-sustrato, no a la enzima libre. El complejo EIS es catalíticamente inactivo. Esta
forma de inhibición es rara y causa una disminución tanto en el valor de Vmax como en el
de Km.3

• La inhibición por sustrato y por producto es donde el sustrato o el producto de una

reacción enzimática inhiben la actividad enzimática. Este tipo de inhibición puede seguir
los patrones competitivos, no competitivos o mixtos. En la inhibición por sustrato hay una
disminución progresiva de la actividad a altas concentraciones de sustrato. Esto puede
indicar la existencia de dos sitios de unión entre sustrato y enzima. Cuando hay poco
sustrato, se ocupa el sitio de alta afinidad y sigue la cinética normal. Sin embargo, a altas
concentraciones, el segundo sitio de inhibición se ocupa, inhibiendo a la enzima.7 La
inhibición por parte del producto es a menudo una característica reguladora en
el metabolismo y puede ser una forma de retroalimentación negativa.

• La inhibición lenta y fuerte se produce cuando el complejo enzima-inhibidor EI inicial

experimenta una isomerización a un segundo complejo más fuertemente unido, EI*, pero
el proceso total de la inhibición es reversible. Esto se manifiesta como un lento aumento
en la inhibición enzimática. En estas condiciones, la tradicional cinética de Michaelis–
Menten da un valor falso para Ki, el cual depende del tiempo. El verdadero valor
de Ki puede ser obtenido a través de un análisis más complejo de las constantes de rango
de encendido (kon) y apagado (koff) para la asociación del inhibidor (véase la inhibición
irreversible para más información).37
Ejemplos de inhibidores reversibles[editar]

Estructura molecular del ritonavir, un inhibidor de proteasa de

carácter peptídico.
Puesto que las enzimas han evolucionado para unirse a sus sustratos fuertemente,
y la mayoría de los inhibidores reversibles se unen al sitio activo de las enzimas, es poco
sorprendente que algunos de estos inhibidores sean muy similares en estructura a los
sustratos de sus dianas. Como ejemplo de estos imitadores de sustratos caben destacar
los inhibidores de la proteasa, una clase muy efectiva de fármacos antirretrovirales usados
para tratar el VIH. La estructura del ritonavir (figura de la derecha), un inhibidor de la
proteasa, consiste en un péptido con tres enlaces peptídicos. Dicha estructura se asemeja a
la proteína que es el sustrato de la proteasa del VIH, por lo que ambos compiten por la
unión al sitio activo de la enzima.8
Los inhibidores enzimáticos son a menudo diseñados para imitar el estado de transición o
intermedio de una reacción catalizada por una enzima. Esto asegura que el inhibidor
cambie el estado de transición estableciendo un efecto en la enzima, lo que resulta en una
13
afinidad de unión mejor (baja Ki) que los diseños basados en sustratos. Un ejemplo de un
inhibidor en ese estado de transición es el fármaco antiviral oseltamivir, que imita la
naturaleza plana del anillo del ion oxonio en la reacción de la neuraminidasa, una enzima
del virus.9

Estructura molecular del tipranavir, un inhibidor de proteasa de carácter no peptídico.

Sin embargo, no todos los inhibidores están basados en la estructura del sustrato. Por
ejemplo, la estructura de otro inhibidor de la proteasa del VIH, el tipranavir, (representada
a la izquierda), no está basada en un péptido y no tiene similitudes estructurales obvias con
la proteína sustrato. Estos inhibidores no peptídicos pueden ser más estables que los
inhibidores que contienen enlaces peptídicos porque estos no son sustratos para
las peptidasas, con lo que son menos propensas a ser degradadas en la célula.10
En el diseño de fármacos es importante considerar las concentraciones de sustrato a las
cuales se expondrá la enzima en cuestión. Por ejemplo, algunos inhibidores de proteínas
quinasas tienen estructuras químicas que son similares al adenosín trifosfato, uno de los
sustratos de esta enzima. Sin embargo, ciertos fármacos que son simplemente inhibidores
competitivos tendrán que competir con altas concentraciones de ATP en la célula. Las
proteínas quinasas también pueden ser inhibidas por competencia en el sitio de unión donde
la quinasa interactúa con sus proteínas sustrato, y la mayoría de las proteínas presentes en
el interior de una célula se encuentran a concentraciones mucho menores que las
concentraciones de ATP. En consecuencia, si dos inhibidores de proteínas quinasas se unen
en sus sitios activos con afinidad similar, pero solo uno tiene que competir con el ATP,
entonces el inhibidor competitivo en el sitio de unión de la proteína inhibirá a la enzima
más eficientemente.11

Inhibidores irreversibles[editar]

Reacción del inhibidor irreversible diisopropilfluorofosfato (DFP) con una serín-proteasa.

14
Los inhibidores irreversibles normalmente modifican una enzima covalentemente, con lo
que la inhibición no puede ser invertida. Los inhibidores irreversibles suelen contener
grupos funcionales reactivos como mostazas
nitrogenadas, aldehídos, haloalcanos o alquenos. Estos grupos electrofílicos reaccionan
con las cadenas de aminoácidos para formar uniones covalentes. Los residuos modificados
son aquellos que contienen en sus cadenas laterales nucleófilos como por ejemplo un grupo
hidroxilo o un grupo sulfhidrilo. Esto incluye a los aminoácidos serina (como en el DFP, a
la derecha), cisteína, treonina o tirosina.12
Tipos de inhibiciones irreversibles[editar]
La inhibición irreversible es diferente de la inactivación enzimática reversible. Los
inhibidores irreversibles son generalmente específicos para un tipo de enzima y no
inactivan a todas las proteínas. No funcionan destruyendo la estructura proteínica, sino
alterando específicamente la estructura tridimensional del sitio activo inhabilitándolo. Por
ejemplo, el pH y las temperaturas extremas causan la desnaturalización de casi todas
las proteínas, pero este no es un efecto específico. De forma similar, algunos tratamientos
químicos no específicos destruyen la estructura de la proteína: por ejemplo, si son
sometidas a una elevada concentración de ácido clorhídrico, el cual hidrolizará los enlaces
peptídicos que mantienen unidos los aminoácidos de las proteínas.13
Los inhibidores irreversibles dan lugar a una inhibición dependiente del tiempo y, por ello,
su potencia no puede ser caracterizada mediante la determinación del valor IC50. Esto se
debe a que la cantidad de enzima activa a una concentración dada de inhibidor irreversible
será diferente dependiendo del tiempo de pre-incubación del inhibidor con la enzima. Por
ello, en lugar del valor IC50, se utiliza el parámetro kobs/[I],14 donde kobs es el primer valor
observado de la tasa de inactivación (obtenido al representar en una gráfica log (actividad)
VS. tiempo) e [I] es la concentración de inhibidor. El parámetro kobs/[I] es válido siempre y
cuando el inhibidor no se encuentre a concentraciones saturantes (en cuyo caso tendríamos
que kobs = kinact).14
Análisis de la inhibición irreversible[editar]

Esquema de la cinética enzimática de los inhibidores irreversibles.

Como se muestra en la figura de la izquierda, los inhibidores irreversibles forman
inicialmente un complejo reversible y no covalente con la enzima (EI o ESI), que
reaccionará posteriormente para producir una modificación covalente en lo que se
denomina el "complejo del punto muerto" EI*. La tasa a la cual se forma EI* es llamada
tasa de inactivación o kinact. Puesto que la formación de EI puede competir con ES, la unión
de los inhibidores irreversibles puede ser prevenida por competencia tanto con el sustrato
como con un segundo inhibidor reversible. Este efecto de protección es una buena
evidencia de una reacción específica del inhibidor irreversible con el sitio activo.15
Los pasos de unión e inactivación de esta reacción son analizados incubando la enzima con
el inhibidor y midiendo la actividad que va quedando a lo largo del tiempo. La actividad
irá disminuyendo de forma paulatina con tiempo, generalmente siguiendo una dinámica
de decaimiento exponencial. Ajustando estos datos a una ecuación de rango podemos
obtener la tasa de inactivación a esta concentración de inhibidor. Esto se hace a diferentes
15
concentraciones de inhibidor. Si un complejo EI reversible está involucrado el rango de
inactivación será saturable y al ajustarla a esta curva obtendremos los valores
de kinact y Ki.15
Otro método que es ampliamente utilizado en estos análisis es la espectrometría de masas.
En este caso, la medida exacta de la masa de la enzima nativa sin modificar y de la enzima
inactivada, nos da el aumento en la masa causado por la reacción con el inhibidor, con lo
que obtenemos la estequiometría de la reacción. Para llevar a cabo esta técnica suele ser
necesario el uso de un espectrómetro de masas MALDI-TOF. Una técnica complementaria
a esta es la huella peptídica, que implica la digestión de proteínas nativas o modificadas
con una peptidasa como la tripsina. Esto genera una serie de péptidos que pueden ser
analizados usando un espectrómetro de masas. El péptido que cambie su masa después de
llevar a cabo la reacción con el inhibidor será aquel que contenga el sitio de la
modificación.16
Casos especiales[editar]

Mecanismo químico para inhibición irreversible de la ornitina descarboxilasa

por medio de DFMO. El piridoxal 5'-fosfato (Py) y la enzima (E) no se muestran.17
(Adaptado del artículo que figura en la referencia).
No todos los inhibidores irreversibles forman uniones covalentes con la enzima que tienen
como diana. Algunos inhibidores reversibles se unen tan fuertemente a su objetivo que son
prácticamente irreversibles. Estos inhibidores de unión fuerte suelen mostrar una cinética
similar a la de los inhibidores irreversibles que forman enlaces covalentes. En estos casos,
algunos de estos inhibidores se unen rápidamente a la enzima formando un complejo EI de
baja afinidad, que después experimenta una reacción más lenta hacia un complejo EI* muy
fuertemente unido (ver la imagen arriba). Este comportamiento cinético es denominado
unión lenta.18 Este lento reajuste posterior normalmente implica un cambio
conformacional cuando la enzima se pliega alrededor de la molécula inhibidora. Como
ejemplos de inhibidores de unión lenta cabe destacar algún fármaco importante como
el metotrexato,19 el alopurinol20 y la forma activada del aciclovir.21
Ejemplos de inhibidores irreversibles[editar]

16
 Tripanotión reductasa donde se muestran dos moléculas unidas al centro activo:
la inferior es un inhibidor unido de forma irreversible y la superior un inhibidor
unido de forma reversible. Creado mediante PDB 1GXF.
El diisopropilfluorofosfato (DFP) se muestra como un ejemplo de inhibidor
irreversible de la proteasa en el apartado "Inhibidores irreversibles" arriba a la
derecha. La enzima hidroliza el enlace entre el fósforo y el flúor, pero el residuo
de fosfato se mantiene unido a una serina en el centro activo, inactivándolo.22
Además, el DFP también reacciona con el centro activo de
la acetilcolinesterasa en la sinapsis de las neuronas, lo que lo convierte en una
potente neurotoxina, con una dosis letal a partir de cantidades inferiores a 100
mg.23
La inhibición suicida es un tipo común de inhibición irreversible donde la
enzima convierte al inhibidor en una sustancia reactiva en su centro activo. Un
ejemplo de esto es el inhibidor de biosintetizadores de poliaminas α-
difluorometilornitina o DFMO, que es un análogo del aminoácido ornitina, y es
usado para tratar la Tripanosomiasis Africana (enfermedad del sueño).
La ornitina decarboxilasa puede catalizar la descarboxilación del DFMO
sustituyendo a la ornitina, como se muestra en la figura del apartado anterior.
Sin embargo, esta reacción de descarboxilación es seguida por la eliminación del
átomo de flúor, lo que convierte a este intermediario en una imina, una especie
altamente electrofílica. Esta forma reactiva del DFMO reacciona posteriormente
con un residuo de cisteína o lisina en el centro activo para inactivar la enzima
irreversiblemente.17
Puesto que la inhibición irreversible implica a menudo la formación inicial de
un complejo EI covalente, a veces es posible que un inhibidor pueda unirse a una
enzima de diversas formas. Como ejemplo cabe destacar el caso de la
enzima tripanotión reductasa perteneciente al protozoo y parásito
humano Trypanosoma cruzi, donde dos moléculas de un inhibidor
llamado mostaza quinacrina, presentan la capacidad de unirse a su centro activo.
La molécula superior se une de forma reversible, pero la de abajo se une de forma
covalente al reaccionar con un residuo de aminoácido a través de su grupo
de mostaza nitrogenada.24

Descubrimiento y diseño de inhibidores[editar]

La investigación y desarrollo de nuevos fármacos es un largo proceso en el cual
el primer paso casi siempre es el descubrimiento de un nuevo inhibidor enzimático. En el
pasado, la única forma de descubrir estos nuevos inhibidores era mediante el sistema de
prueba y error: probando un elevado número de compuestos contra la enzima a la cual se
quiere inhibir y esperando conseguir alguno que sea efectivo. Esta aproximación, si bien
se basa en la fuerza bruta, sigue logrando actualmente un gran éxito gracias a nuevos
sistemas de barrido, como la química combinatoria, que rápidamente producen un gran
número de compuestos novedosos, y a la tecnología basada en la investigación de
procesamiento de alto-rendimiento, mediante la cual se pueden revisar rápidamente estas
enormes bibliotecas químicas de inhibidores útiles.25
Más recientemente, se ha comenzado a aplicar un nuevo tipo de investigación alternativa:
el diseño racional de fármacos que usa la estructura tridimensional del sitio activo de una
enzima para predecir qué moléculas podrían ser inhibidores.26 Una vez realizada la
predicción, se prueban y se selecciona el mejor. Este nuevo inhibidor es usado después
para tratar de obtener una estructura de la enzima en un complejo enzima-sustrato para
mostrar cómo se une la molécula al sitio activo. Esta estructura es después inspeccionada
y se llevan a cabo ciertos cambios en la estructura del inhibidor con el fin de optimizar la

17
unión con la enzima. Este ciclo de prueba y optimización se repite de forma sucesiva hasta
obtener un inhibidor lo suficientemente potente, es decir, cuando se alcanza un valor de la
constante de disociación que esté en torno a <10-9 M.27
Aplicaciones de los inhibidores[editar]
Los inhibidores enzimáticos pueden ser encontrados en la naturaleza, pero también son
diseñados y producidos como parte de la farmacología y la bioquímica.
Los venenos naturales son a menudo inhibidores enzimáticos que han evolucionado para
defender a una planta o animal contra sus depredadores. Estas toxinas naturales incluyen
algunos de los compuestos más venenosos conocidos hasta hoy. Los inhibidores artificiales
son a menudo usados como medicamentos, pero también existen algunos utilizados
como insecticidas (como el malathion), herbicidas (como el glifosato) o desinfectantes,
(como el triclosán).
Fármacos[editar]

Estructura del sildenafil (Viagra).

Comparación de la estructura del ácido fólico, un coenzima (izquierda), con la estructura

del metotrexato, un fármaco anti-cancerígeno (derecha).

Estructura tridimensional del complejo formado por la penicilina G unida a

la transpeptidasa de Streptomyces. Generado mediante PDB 1PWC.
Los inhibidores enzimáticos son utilizados principalmente como fármacos en el
tratamiento de diversas enfermedades. Muchos de estos inhibidores son capaces de actuar
sobre enzimas humanas y así corregir determinadas patologías. Sin embargo, no todos los
fármacos son inhibidores enzimáticos. Algunos de ellos, tales como los fármacos anti-
epilépticos, alteran la actividad enzimática de forma indirecta, aumentando o
disminuyendo la síntesis de dicha enzima. Estos efectos son denominados inducción e
inhibición enzimática y consisten en alteraciones en el patrón de expresión génica, lo cual
no está relacionado con el tipo de inhibición enzimática discutido aquí. Otras drogas

18
interactúan con otras dianas celulares que no son enzimas, como los canales iónicos o
los receptores de membrana.2829
Un ejemplo de inhibidor enzimático terapéutico es el sildenafil (Viagra),
utilizado como tratamiento de la disfunción eréctil. Este compuesto es un potente inhibidor
de la fosfodiesterasa-5 (IPDE-5) específica de GMPc, una enzima que degrada una
molécula de señalización celular, el GMPc.30 Esta molécula de señalización es la
responsable de la relajación del músculo liso y permite el flujo de sangre hacia el interior
de los cuerpos cavernosos del pene, lo cual causa la erección. El sildenafil inhibe la
actividad de la enzima que degrada la señal, el GMPc, uniéndose al mismo sitio que éste
debido a su similitud estructural. Esto permite que el GMPc no sea degradado y pueda
permanecer activo durante períodos más largos de tiempo.30
Otro ejemplo de similitud estructural entre inhibidores y sustratos enzimáticos
es que el que se muestra en la figura de la derecha, entre el metotrexato, un fármaco, y
el ácido fólico, un coenzima. El ácido fólico es la forma oxidada del sustrato de
la dihidrofolato reductasa, una enzima implicada en la biosíntesis
de timidina, purinas y aminoácidos. El metotrexato es un potente inhibidor de esta enzima
que, al estar relacionada con la síntesis de nucleótidos, presenta una toxicidad específica
de aquellas células con una rápida tasa de crecimiento. Por ello, el metotrexato se utiliza a
menudo como fármaco anticancerígeno en quimioterapia.31
Otro tipo de inhibidores enzimáticos son utilizados con el fin de inhibir aquellas enzimas
necesarias para la supervivencia de patógenos. Por ejemplo, las bacterias presentan una
gruesa pared celular compuesta principalmente de
un polímero denominado peptidoglicano. Ciertos antibióticos como la penicilina y
la vancomicina inhiben a la enzima responsable de la producción y el entrecruzamiento de
las hebras de peptidoglicano,32 lo cual da lugar a una pérdida de fuerza de la pared celular
y, por consiguiente, a la lisis de la célula, incapaz ahora de resistir la elevada presión
osmótica. En la figura se puede apreciar una molécula de penicilina unida a su diana,
la transpeptidasa de la bacteria Streptomyces R61 (la proteína se muestra en un formato de
cintas y la penicilina en un formato de esferas y barras). También se utilizan otro tipo de
toxicidades selectivas mediante antibióticos que aprovechan las diferencias presentes en la
estructura de los ribosomas o en la síntesis de ácidos grasos. El diseño de fármacos se ve
muy facilitado en estos casos en los que la enzima diana es esencial para la supervivencia
del patógeno y no está presente o es muy diferente en humanos.32
Control metabólico[editar]
Los inhibidores enzimáticos son también importantes a nivel del control
metabólico. Muchas de las rutas metabólicas que tienen lugar en la célula son inhibidas
por metabolitos que controlan la actividad enzimática mediante procesos de regulación
alostérica o inhibición por sustrato. A modo de ejemplo cabe destacar la regulación
alostérica de la glucólisis. Esta ruta catabólica consume glucosa y
produce ATP, NADH y piruvato. Una de las etapas clave en la regulación de la glucólisis
es la reacción catalizada por la fosfofructoquinasa-1 (PFK1). Cuando los niveles de ATP
aumentan, el ATP se une a un sitio alostérico de la PFK1, con lo que se reduce la actividad
de la enzima, la glucólisis se inhibe y los niveles de ATP se reducen de nuevo. Este control
por retroalimentación negativa (feedback negativo) ayuda a mantener los niveles de ATP
constantes en la célula. Sin embargo, las rutas metabólicas no están únicamente reguladas
por medio de la inhibición, la activación enzimática es igualmente importante. La enzima
PFK1 presenta activadores alostéricos, como son la fructosa 2,6-bifosfato y el ADP.33
La inhibición enzimática fisiológica también puede ser producida por inhibidores proteicos
específicos. Este mecanismo se puede observar en el páncreas, donde se sintetizan multitud
de precursores de enzimas digestivas denominadas zimógenos. Muchos de ellos son
activados por la tripsina, una proteasa, por lo que es muy importante inhibir la actividad de

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la tripsina en el páncreas con el fin de prevenir fenómenos de autodigestión. Uno de los
mecanismos para mantener la tripsina inactiva es la producción de un potente y específico
inhibidor de tripsina en el páncreas. Este inhibidor se une con una alta afinidad a la tripsina,
previniendo así su actividad.34 Aunque el inhibidor de tripsina es una proteína, no
es hidrolizado por la propia tripsina, ya que elimina las moléculas de agua de su centro
activo y desestabiliza el estado de transición.35 Otros ejemplos de inhibidores enzimáticos
fisiológicos son el inhibidor barstar, cuya función es inhibir la actividad de
una ribonucleasa bacteriana denominada barnasa,36 y los inhibidores de las protein-
fosfatasas.37
Inhibidores artificiales[editar]

Con el fin de disuadir a los depredadores de semillas, las legumbres incorporan inhibidores
de tripsina, que interfieren con la digestión.
Inhibidores de la acetilcolinesterasa[editar]
La acetilcolinesterasa (AChE) es una enzima que se encuentra en los animales, desde
los insectos hasta los humanos. Es esencial en la actividad que desempeñan las neuronas,
ya que su función consiste en la ruptura del neurotransmisor acetilcolina en sus
constituyentes, acetato y colina.3839 Es un caso único entre los neurotransmisores, ya que
la mayoría de ellos, como la serotonina, la dopamina o la noradrenalina, son reabsorbidos
en la brecha sináptica. Existe un amplio número de inhibidores de la AChE que son
utilizados tanto en el campo de la medicina como en el campo de la agricultura. Algunos
de estos inhibidores son reversibles, como el edrofonio, la fisostigmina, y la neostigmina,40
los cuales son utilizados en el tratamiento de la miastenia gravis y en la aplicación
de anestesia. Los pesticidas del tipo carbamato son otro ejemplo de inhibidores reversibles
de la AChE. Como ejemplo de inhibidores irreversibles de la AChE caben destacar
los insecticidas organofosforados, como el malathion, el paratión y el clorpirifós.40
Herbicidas[editar]
El glifosato es un herbicida no selectivo de amplio espectro, desarrollado para la
eliminación de hierbas y arbustos, en especial de aquellos de naturaleza perenne. Es
absorbido por las hojas y no por las raíces. Se puede aplicar a las hojas, inyectarse a troncos
y tallos, o asperjarse a tocones como herbicida forestal. La aplicación de glifosato mata las
plantas debido a que suprime su capacidad de generar aminoácidos aromáticos. Su modo
de acción se basa en la inhibición de la enzima 5-enolpiruvil-siquimato-3-fosfato sintetasa
(EPSPS), enzima responsable de la síntesis de los aminoácidos
aromáticos fenilalanina, tirosina y triptófano. Esta ruta bioquímica no se encuentra
presente en animales pero es consumo en humanos.41
Desinfectantes[editar]
El triclosán es un potente agente antibacteriano y fungicida, actuando como
biocida a nivel de diversas dianas en el citoplasma y la membrana celular.42 No obstante, a
bajas concentraciones, el triclosán actúa como agente bacteriostático principalmente a nivel
de la inhibición de la síntesis de ácidos grasos. El triclosán se une a la proteína
transportadora enoil‐acil reductasa (ENR), codificada por el gen FabI. Esta unión aumenta
la afinidad de la enzima por el NAD+, lo cual desemboca en la formación de un complejo
ternario estable de ENR-NAD+-triclosán incapaz de participar en la síntesis de ácidos
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grasos (moléculas imprescindibles en la construcción y mantenimiento de las membranas
celulares). El ser humano no posee la enzima ENR, de modo que no se ve afectado por el
triclosán.42
Venenos naturales[editar]
Tanto algunos animales como algunas plantas son capaces de sintetizar una amplia gama
de sustancias venenosas de diverso origen: metabolitos secundarios, péptidos y proteínas,
que pueden actuar como inhibidores enzimáticos. Las toxinas naturales suelen ser pequeñas
moléculas orgánicas con tanta diversidad que probablemente existan inhibidores para la
mayoría de los procesos metabólicos.43 Dicha inhibición puede producirse a diferentes
niveles en la célula: inhibición de receptores de membrana, de canales iónicos o de
proteínas estructurales. Por ejemplo, el paclitaxel (taxol), una molécula orgánica obtenida
del tejo (Taxus), se une con una elevada afinidad a los dímeros de tubulina, impidiendo así
el proceso de polimerización de los microtúbulos, crucial, entre otras cosas, en la división
celular.44
Muchos de estos venenos naturales actúan como neurotoxinas capaces de
causar parálisis que pueden llevar a la muerte, pudiendo ser utilizados como estrategia
defensiva frente a los depredadores o como sistema de caza en la captura de presas.
Algunos de estos inhibidores naturales, a pesar de sus características tóxicas, son muy
valorados por sus potenciales usos terapéuticos cuando son administrados en dosis
adecuadas.45 Como ejemplo de neurotoxina cabe destacar los glicoalcaloides, obtenidos a
partir de las plantas pertenecientes a la familia Solanaceae (entre las que se incluyen
la patata, el tomate y la berenjena), que son inhibidores de la acetilcolinesterasa. La
inhibición de esta enzima causa un aumento descontrolado de los niveles del
neurotransmisor acetilcolina, lo que conlleva parálisis muscular y muerte. La
neurotoxicidad también puede ser el resultado de la inhibición de receptores, como en el
caso de la atropina, obtenida a partir de la especie Atropa belladonna, que funciona como
un antagonista competitivo de los receptores muscarínicos de acetilcolina.46
Aunque muchas de las toxinas naturales son metabolitos secundarios, algunas son péptidos
o proteínas. Como ejemplo cabe destacar a la toxina peptídica alfa-amanitina, encontrada
en los hongos de la especie Amanita phalloides, que es un potente inhibidor enzimático
capaz de impedir la actividad de la ARN polimerasa II en la transcripción del ADN.47 Otra
toxina peptídica es la microcistina, encontrada en ciertas algas y capaz de inhibir
ciertas protein-fosfatasas.48 Esta toxina puede contaminar las reservas de agua si las algas
que la producen alcanzan determinados niveles de concentración. Se ha demostrado su alto
potencial carcinogénico y su capacidad de causar hemorragia hepática aguda y muerte tras
una exposición a altas dosis.49
Las proteínas también pueden llegar a ser venenos naturales, como es el caso
del inhibidor de tripsina (discutido anteriormente) encontrado en algunas legumbres.
Menos comunes son las enzimas tóxicas. Este tipo de enzimas actúan como inhibidores
irreversibles de dianas enzimáticas que modifican químicamente sus sustratos enzimáticos.
Un ejemplo es el ricino, una proteína tóxica extremadamente potente, que se encuentra en
la planta Ricinus communis. Esta enzima es una glicosidasa que inactiva a los ribosomas.
Como el ricino es un inhibidor catalítico irreversible, esto permite que tan solo una
molécula de ricino pueda matar una célula.50

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