2. METODO DE DIFUSION CON DISCO EN AGAR Fernando García, PhD 2.1. Fundamento de la prueba.

Una suspensión de la bacteria en estudio se inocula sobre la superficie de una placa de agar Mueller-Hinton. Posteriormente se colocan sobre la superficie del agar discos de papel de filtro impregnados con cantidades estandarizadas de agentes antimicrobianos. Luego del período de incubación se mide el diámetro de la zona de inhibición alrededor de los discos (ver Figura 2.1). El tamaño de la zona de inhibición es inversamente proporcional a la concentración inhibitoria mínima (MIC) de la bacteria (ver Figura 2.2) y mediante el uso de tablas de referencia (ver anexos 2.1., 2.2., 2.3. y 2.4) se prepara un reporte cualitativo (sensible, intermedio o resistente). A B

Figura 2.1. Principio de la técnica de difusión con disco en agar. La concentración del antibiótico decrece conforma mayor sea la distancia desde el borde del disco (A). En el área en donde la concentración del antibiótico sea insuficiente para inhibir el crecimiento, se observará un margen a partir del cual ocurrirá un crecimiento confluente(B).

2. Materiales. ¾ Cultivos frescos de 18-24 horas en medio sólido de la bacteria a probar. En este caso. ¾ Tubos conteniendo solución salina (0. Ejemplo de un análisis de regresión para determinar la relación entre la CIM y los puntos de quiebre en la prueba de difusión con disco.2. ¾ Discos de 6 mm de diámetro impregnados con agentes antimicrobianos. zonas de inhibición de 20 mm se interpretan como susceptible con una MIC de 8 µg/ml. mientras que zonas de inhibición de 11 mm se interpretan como resistente con una MIC de 32 µg/ml. Zonas de inhibición de 12-19 mm se interpretan como intermedio con una MIC de 16 µg/ml.2. ¾ Torundas de algodón estériles. Método de difusión con disco en agar Fernando García. 2. .85% NaCl) estéril. ¾ Placas de agar Mueller-Hinton con un espesor de 4 mm (24 ml de medio en placas de Petri de 90 mm de diámetro). PhD Resistente Intermedio Sensible ) l m g/ µ C ( MI Diámetro de la zona de inhibición (mm) Figura 2.

oxacilina. 4. 3.5. 8. debido a que la difusión de la sustancia empieza inmediatamente. ¾ Pinzas. La incubación se debe efectuar a 35ºC por 16-18 horas. 1. PhD ¾ Regla milimétrica. La turbidez de la suspensión se debe ajustar a la turbidez del estándar 0. 232. 6. 5.¾ Pipetas Pasteur estériles. Realizar la lectura de la prueba mediante determinación del diámetro de la zona de inhibición (incluyendo el diámetro del disco): ¾ La lectura de la prueba se puede realizar solamente si hay crecimiento confluente. ¾ Colocar la placa sobre una superficie negra pero bien iluminada (luz directa a 45º). Introducir la torunda de algodón en la suspensión y rotarla contra las paredes internas del tubo para remover el exceso de inóculo. con . 2. ¾ Una vez colocados los discos. 2. Si se prueban especies de Staphylococcus con penicilinas -lactamasa-resistentes (meticilina. La aplicación de los discos se debe hacer luego de 3 minutos y antes de 15 minutos de inoculada la placa. 222. ¾ Tubos conteniendo estándar de McFarland 0. PhD ¾ Una vez colocados. Permitir que el inóculo sobre la superficie del medio de cultivo se seque antes de aplicar los discos. 7.5 de McFarland (1.3. Método de difusión con disco en agar Fernando García. las placas deben ser colocadas en la incubadora antes de 15 minutos. El diámetro de los tubos debe ser igual al de los tubos conteniendo la solución salina estéril para hacer la suspensión de la bacteria. Permitir que las placas de agar Mueller-Hinton y los discos alcancen la temperatura ambiente antes de utilizarlos. Utilizar esta suspensión para inocular las placas de agar Mueller-Hinton antes de 15 minutos. Inocular con la torunda la superficie del agar en tres direcciones. Método de difusión con disco en agar Fernando García. ¾ No volver a colocar los discos una vez que han hecho contacto con la superficie del agar.5 × 108UFC/ml). Aplicar los discos a la superficie del medio de cultivo utilizando pinzas: ¾ No se deben colocar más de 6 discos en las placas que tienen 90 mm de diámetro y la distancia entre los centros de los discos no debe ser menor a 25 mm. Procedimiento. Preparar una suspensión en solución salina estéril a partir de un cultivo fresco. nafcilina) la incubación debe prolongarse adicionalmente 6-8 horas (24 horas en total) y el medio de cultivo debe contener 4% de NaCl adicional para inducir el fenotipo. Utilizar una torunda por cada placa de medio. rotando la placa aproximadamente 60º entre las inoculaciones. presionar levemente cada uno de los discos para que se adhieran a la superficie del agar.

oxacilina o nafcilina. ¾ Medir el diámetro de inhibición con una regla milimétrica al milímetro más cercano. Control de calidad. En el caso que se utilicen medios de cultivo opacos (agar Mueller-Hinton suplementado con sangre).4. 2. PhD Cultivo positivo por Escherichia coli Prueba de susceptibilidad a antimicrobianos: Ampicilina Sensible 8 µg/ml Cefazolina Sensible 8 µg/ml Gentamicina Intermedio 8 µg/ml Mezlocilina Sensible 16 µg/ml Tetraciclina Resistente 16 µg/ml ¾ Si una cepa de Staphylococcus resulta resistente a meticilina. identificadas y analizadas mediante una prueba de susceptibilidad a antimicrobianos. independientemente de los respectivos resultados de las pruebas de susceptibilidad.5) son aceptables.el fondo hacia arriba y la tapa hacia abajo.5. ¾ Si aparecen colonias individuales dentro de la zona de inhibición. todas las penicilinas. Método de difusión con disco en agar Fernando García. ¾ Cepas bacterianas para control de calidad. aeruginosa ATCC 27853 Aminoglicósidos E. se debe reportar como resistente a todos los antibióticos -lactámicos incluyendo combinaciones con inhibidores de -lactamasas. 2. aureus ATCC 25923 Pruebas de rutina No productora de -lactamasa P. colocar la placa con el fondo hacia abajo y remover la tapa para realizar la lectura. tales colonias deben ser subcultivadas. faecalis ATCC 29212 Trimetoprim-sulfametoxazole Monitoreo de concentración de timidina en el agar: altas . interpretar los diámetros de la zona de inhibición de acuerdo a los criterios dados en las tablas adjuntas y reportar los resultados de la siguiente manera (ejemplo): 242. ¾ Si los criterios de control de calidad (ver 2. todas las cefalosporinas e imipenem. Cepas bacterianas Uso Comentarios E. coli ATCC 25922 Pruebas de rutina No productora de -lactamasa S. Reporte de resultados.

trimetoprim y sulfonamidas. Inóculo muy denso o muy liviano. 9 Si el control de calidad se realiza diariamente. 9 Errores en los equipos. 9 Errores clericales al transcribir los resultados. PhD 9 Los diámetros de las zonas de inhibición deben estar dentro de los límites establecidos. Pérdida de potencia de los discos por mal almacenamiento. no deben darse más de un resultado de 20 fuera de los límites establecidos (límite de confidencialidad del 95%). . ¾ Limitaciones del procedimiento. 9 Errores técnicos en la realización de la prueba: Lectura errónea de las zonas de inhibición.6. incluyendo los medios de cultivo y los discos impregnados con antibióticos. 9 Debe ser realizado diariamente y cada vez que se adquiere un nuevo lote de cada uno de los materiales. 9 Errores en los materiales: Variabilidad en la preparación de las placas de agar Mueller-Hinton. Consideraciones generales sobre el método de difusión con disco. coli ATCC 35218 Combinaciones de -lactámico con inhibidor de -lactamasas Productora de -lactamasa ¾ Frecuencia del control de calidad. Método de difusión con disco en agar Fernando García.concentraciones antagonizan la actividad de trimetoprimsulfametoxazole. 252. ¾ Errores frecuentes. mala manipulación o discos defectuosos. 2. Contaminación de los materiales utilizados. E.

uprm. Antimicrobiano Disco (µg) Zona de inhibición (mm) http://www. 9 Algunas cepas de Staphylococcus resistentes a meticilina pueden no ser detectados mediante esta técnica. 9 Numerosos factores influyen el resultado de la prueba.netropica. Interpretación de las zonas de inhibición para especies de la familia Enterobacteriaceae. el contenido 262. algunas especies de Streptococcus.edu/biology/profs/massol/manual/p4-nmpenumeracion. la tasa de crecimiento.pdf NUMERO MAS PROBABLE: http://www. Enterococcus. PhD del disco.google.com. la formulación y el pH del medio. por lo que es fundamental adherirse estrictamente al procedimiento. 272.pdf http://aprendeenlinea.edu.9 Esta técnica está estandarizada para bacterias no fastidiosas de crecimiento aerobio rápido. incluyendo el inóculo. Método de difusión con disco en agar Fernando García.co/books?id=Z6onofK2ToEC&pg=PA52&dq=COMO+SE+HACE+UN+ANTIB IOGRAMA+GENTAMICINA&hl=es&ei=aDc7TcuQIMXflgfkrMjqBA&sa=X&oi=book_result&ct=book- . incluyendo especies de la familia Enterobacteriaceae. Staphylococcus. Listeria monocytogenes. Método de difusión con disco en agar Fernando García.php/vitae/article/viewFile/595/503 http://books. las condiciones de incubación. la tasa de difusión de la droga y la lectura de la zona de inhibición. Pseudomonas aeruginosa y otras especies y géneros relacionados.org/bacteriologia/DifusionKB.1.udea.co/revistas/index. Acinetobacter. PhD Anexo 2. 9 Esta técnica no debe utilizarse para pruebas con vancomicina cuando se analizan especies de Enterococcus y Staphylococcus debido a la pobre difusión de la droga.

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