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(SS una sola cadena)

PCR
REALTIME (QPCR) (CUANTITATIVA)
HIBRIDACION IN SITU (NO CUANTIFICA, ES MAS DESCRIPTIVA, PERO
PERMITE UBICAR TEMPORAL Y ESPACIALMENTE LA EXPRESION DE UN GEN
EN UN TEJIDO O ESTRUCTURA)
MICROARRELGO (MICRORAY SCANING) Y TRANSCRIPTOMICA (MAS
ROBUSTAS, PERMITEN MANEJAS DATOS MAS COMPLEJOS EN MAYOR
CANTIDAD)
CLASE 11 DE NOVIEMBRE
Microarreglos para identificar expresión y que se usa cdna para poder desarrollar el
microarreglo
Matriz sólida, que es un chip con micro separaciones y en cada micro separación hay
sondas, las sondas
Microarreglo, técnica que usa sondas de cdna que están unidas al soporte sólidos, el soporte
hace referencias a las micro cuadriculas, dentro de estas hay sondas de cdna para genes
específicos que queramos detectar (en cada sonda DIFERENTE, no en una misma sonda
pueden ser diferentes, tipo en una pten y en la otra fgf), las sondas están estabilizadas a la
matriz sólida, y la matriz solida puede ser de diferentes materiales.
Cuadricula: 1.23 micromecros cuadrado.Sonda: gen especifico.

1. Célula (muestra)
2. Rna
3. Retrotranscribo el rna a cdna
4. Marcamos el cdna con un fluorocromo
5. Tenemos condiciones de cdna (control (tejido sano) (rojo) y patológica (cáncer)
(verde))
6. Luego servimos las muestras en el microarreglo (combinamos de forma igual, para
ver quien se expresa más que el otro Y LOS ECHAMOS AHÍ)
7. En el microarreglo, en una cuadricula tengo una sonda (complementaria a la
secuencia de cdna que corresponde el gen tanto en el control como en la patológica)
con un gen que quiero identificar
8. Entonces veo que tanto expresan las muestras control y patológicas el gen
9. La muestra patológica tiene pocas copias y la muestra control tiene muchas copias,
entonces la muestra control se hibrida más, porque tiene más copias, entonces al
entrar al pozo con las sondas, van a hibridar más, van a unirse, porque son las
copias que están expresando el gen
10. Por otro lado, el patológico solo expreso dos copias
11. Entonces al agregar la sonda, se hacen un lavado del microchip, entonces los cdna
que no se unieron se van, se pierden y solo queda los genes complementarios
12. Se hace la hibridación
13. Entonces cuando se lea la hibridación (escáner laser), va a resaltar más el rojo,
porque tengo más copias del rojo, entonces hubo más expresión del rojo (control)
porque resalta mas (subexpresión)
14. Ahora por otro lado, hay sondas para otro gen, y aquí se expresó más el verde
(patológico), hubo más copias del verde y del rojo (control) hubo pocas copias, se
expresó menos, entonces el pozo se ve de color verde ya que ese se expresó más.
(sobreexpresión)
15. En caso de que ambos expresen el mismo número de copias, se ve de un color
intermedio entre ambos. (sin cambio en la expresión)
16. Si no hay ningún color, no se hibrido nada, no se expresó nada

ENTONCES:
Un chip: tiene mucha cuadriculas
Cada cuadricula: tiene sondas para un gen especifico
Cada gen: debe ser especifico en cada sonda, o sea en una sonda pten y en otra
sonda fgf, no juntas, y por eso son específicas.

EJEMPLO:
Condición experimental: a unas células le ponga un fármaco y a otra un fármaco
distinto o que a uno le pongas fármaco y a otro no, Y COMPARO.

El chip lo lee el escaner, y luego da la fluorescencia que puedo cuantificar, para


saber si hay una sobre o sub-expresión.
ESTO LO REALIZA EL SCANER LAZER (MICROARRAYIR SCANER)
(ESCANER DE MICROARREGLO)
Metes los chips como una tarjeta y el equipo escanea con un láser dependiendo con
la fluorescencia, coloco un láser para ese fluorescente. (longitud de onda) (complejo
puedes meter varios)
Hay otros mas simples (de uno solo), hay un lazer y ese inicialmente pasa por un
filtro de emisión para que dej pasar la longitud de onda dependiendo del cdna,
cuando tengo dos colores, puedo paso dos lazer, uno que estimula el rojo y otro el
verde. Pasa el rayo llega al lente por donde pasa el lazer, llega al microarreglo, lo
estimula, manda la fluorescencia desentendiendo el gen si expreso o no, pasa al
PINHOLE, que es una apertura, y ese pasa por un detector (lente) y el PMT (es un
foto multiplicador) (el equipo lee la fluorescencias y se puede ver los colores) EN
RESUMEN EN UN ESQUIPO CON LAZER DE DIFERENTES LONGITUDES
PARA PODER ESTIMULAR UNA MUESTRA Y PODER LEER EL
MICROARREGLO.
LOS COLORES DE LOS FLUOROCROMOS PUEDEN VARIAR, NO SOLO
SON ROJO Y VERDE.

TRANSCRIPTOMICA

RNAm (codificante), RNAtransferencia, RNAribosomal, Rnatransferencia,


RNAmicro, RNAdegradados. Rnampostsplicing y RNAmpresplicing (MACRO,
RNA COMPLETO, O SEA TODOS).
Primero se hace una extracción total de rna y podrías sacar solos los mensajeros
(POLIADELINACION, esfera con muchas timinas, de tal forma que la cola del
POLIA del RNAm se van a unir a las esferas con muchas TIMINAS)

TRANSCRIPTOMICA: Estudio de ese transcriptoma (UNA CELULA,


MULTIPLES CELULAS, DE UN TEJIDO) en una situación concreta.
Es muy dinámico puede variar entre un tiempo y otro (NO ES LO MISMO QUE
TENGAS UN TRANSCRIPTOMA DE TUMOR AVANZADO, MEDIO O
INICIAL) porque hay cambios de expresión en los tiempos.
El genoma es más estable en comparación con las transcriptómicas (sus respuestas
varían en el tiempo en diferentes condiciones en un tiempo específico en el que se
quiera evaluar)
Se pueden hacen comparaciones en condiciones, o la misma condición en diferentes
tiempos.
Estudio del transcriptoma de una célula en unas condiciones o situaciones concretas
en un tiempo específico donde quieras evaluar.

Pasos:
1. Extracción o aisló total del rna
2. Luego el rna es fragmentados
3. Se le hace la retrotranscripcion a cdna de doble cadena (ds) (librería)
4. Se preparan las muestras para secuenciar (varios equipos)
5. Luego tenemos unos adaptadores
6. Se hace una amplificación clonal de los pedazos
7. Luego se hace un secuenciamiento
8. Procesamiento y análisis de datos con herramientas de bioinformática
9. Validación (POR QPCR, MICROAAREGLO U OTRO)
10.
a. Puedo comparar condiciones.
b. Puedo caracterizar desde la transcriptómica un proceso (DESARROLLO
DE UN ORGANO, VER QUE GENES SE EXPRESAN POR DIAS)
entonces puedo comparar y evaluar que genes se expresan, o comparar
entre especies (león y humano) para ver diferencias en el tiempo.
c. Ver si se expresan isoformas de un mismo gen (SI HAY GENES QUE
TIENE VARIACION EN ALGUNA SECUENCIA, QUE PUEDE
GENERAR UN CAMBIO FUNCIONAL DEL GEN)

DIFERENCIAS ENTRES MICROARREGLOS Y TRANSCRIPTOMICA


(SECUENCIAMIENTO):

FACTORES PARA TENER EN CUENTA:

a. El costo (dinero)
b. Objetivo (que quieres evaluar o hacer):

I. SI QUIERES EVALUAR EXPRESION DIFERENCIAL


(Diferencias entre una condición y otra)
II. SI QUIERES HACER UNA CUANTIFICACION ABSOLUTA
III. SI QUIERES IDENTIFICAR GENES NUEVOS QUE SE
ESTEN EXPRESANDO EN UNA CONDICION EN
PARTICULAR
IV. EXPRESION DE ISOFORMAS O DIFERENCIAS DE
EXPRESION ENTRE ISOFORMAS
V. NIVELES ALTOS O BAJOS DE EXPRESION
VI. IDENTIFICAR DIFERENCIAS DE SPLICING ENTRE
CONDICIONES (ESTRUCTURA O FUNCION DE GENES)

c. SI QUIERES VER SI HAY EXPRESION DE ISOFORMAS Que


información se tiene disponible del genoma para la especie de interés
d. Experiencia en el análisis de datos de la técnica que vas a usa
e. En la conclusión encontrar una diferencia en la expresión génica (EN EL
MICROARREGLO SE PUEDE DETEERMINAR CON EL COLOR)
f. EN EL MICROARREGLO TIENES SONDAS QUE SE DISEÑAN
DEACUERDO AL INTERES (20, 30…100 O MAS GENES) EL
CDNA SOLO HIBRIDA PARA LAS SONDAS QUE MANDAS A
HACER, LO QUE SIGNIFICA QUE NO PUEDES IDENTIFICAR LA
EXPRESION DE NUEVOS GENES CON UN MICROARREGLO,
CON UN TRANSCRIPTOMA SI, ES MAS SE PUEDEN
IDENTIFICAR DIFERENTES ISOFORMAS.
g. LOS MICROARREGLOS NO PUEDEN DETECTAR VARIACIONES
ESTRUCTURALES Y TAMPOCO EN LAS ISOFORMAS, ESTA
LIMITADO
h. EL TRANSCRIPTOMA TIENES UNA INFORMCION MAS AMPLIA
QUE OBTIENES CON LA SECUENCIACION.
i. EN CUESTION DE COSTO PUEDE SER MAS CARO UN
TRANSCRIPTOMA, PERO LOS MICROARREGLOS TAMBIEN SE
PUEDEN VOLVER CAROS (1000 GENES, POR EJEMPLO)
j. EN LA SECUENCIACION NO TENGO UN CHIP Y NO NECESITO
UN ESCANER PARA LA LECTURA POR FLUORECENCIA COMO
EN EL MICROARREGLO.

SIMILUITUDES ENTRES MICROARREGLOS Y


TRANSCRIPTOMICA (SECUENCIAMIENTO):

a. Reproducibilidad muy alta, hay una gran correlación entre ambos


b. Depende de la experticia que se tenga
LA TRANSCRIPTOMICA SE BASA EN UNA SECUENCIACION, SE HACE UN
SECUENCIAMIENTO DE LOS FRAGMENTOS AMPLIFICADOS
HIBRIDACION IN SITU, PARA RNAm Y DNA
RT-QPCR/QPCR/PCR: SOLO PARA RNA

MICROSCOPIA
EQUIPOS DE SECUENCIAMIENTO
CORRELACCIONAR TECNICAS Y EQUIPOS
ANALISIS DE PROTEINAS

WESTERN BLOT: TECNICA SEMICUENTITATIVA, QUE PERMITE


CUENTIFICAR PROTEINAS, PERMITE IDENTIFICAR LA PRESENCIA DE
PROTEINAS EN UNA MUESTRA, CUANTIFICARLAS Y COMPARARLAS
ENTRE GRUPOS (ASI COMO CON LOS MICROARREGLO PUEDO
COMPARAR Y CUANTIFICARLAS LA EXPRESION DE GENES)
SI UN PACIENTE INFECTADO CON UN MICROOGANISMO O NO, PUEDO
INDENTIFICAR LA PRESENCIA DE UNA PROTEINA SI ESTA MAS EN UNA
CONDICION QUE EN OTRA.
PERMITE IDENTIFICAR LA PRODUCCION DE PROTEINAS, PRESENCIA DE
PROTEINAS, LA CANTIDAD Y SOBRE TODO IDENTIFIAR ESTADOS
POSTTRADUCCIONALES O MODIFICACONES POSTTRADUCCIONALES:
a. COMO FOSFORILACION, LA FOSFORILACION DE ALGUNAS PROTEINAS
SON INDIADORAS DE LA ACTIVACION DE UNAS VIAS DE
SEÑALIZACION Y ALGUNAS PATOLOGIAS, COMO CANCER, QUE TIENE
FOSFORILADAS ALGUNAS VIAS, COMO LA PROTEINA AKT)
b. OXIDACCION DE PROTEINAS
c. REDUCCION DE PROTEINAS
d. EVALUAR SI ESTAN UBIQUITINADAS.

COMO FUNCIONA:

1. TOMA UNA MUESTRA DE CELULAS, DOS POBLACIONES CELULARES,


UNA NORMAL Y UNA PATOLOGICA.
2. HAGO UNA EXTRACCION (AISLO) DE PROTEINAS EN AMBAS
MUESTRAS
3. LUEGO ESAS PROTEINAS LAS CUANTIFICO, LAS CUANTIFICO ANTES
PORQUE TENGO QUE HACER UN GEL DE POLICRIAMILA, VERTICAL,
SIRVO LAS MUESTRAS EN LOS POSILLOS, Y ME DEBO ASEGURAR QUE
SIRVO LA MISMA CANTIDAD DE PROTEINAS DEL GRUPO CONTROL Y
DE EL GRUPO PATOLOGICO
4. PARA QUE AL FINAL CUANDO TENGA LAS BANDAS EN EL GEL, PUEDA
DECIR CON CERTEZA (LA BANDA MAS OSCURAS TIENE MAS
PROTEINAS, LAS BANDAS QUE QUEDEN CLARAS TIENE MENOS
PROTEINA)
5. ¿Cómo CUANTIFICAR LAS PROTEINAS TOTALES DE UNA MUESTRA?:
ESPECTROMETRIA, ELECTROFORESIS (LAS PUEDO VER COMO
BANDAS Y CUANTIFICAR LAS BANDAS): LA QUE HACE EL WESTERN
BLOT, ELISA, POR COLORCITO.
LAS QUE DIJO EL PROFE:
I. REACTIVO DE BIURET (METODO DE BIURE) (SACA LAS
PROTEINAS, EXTRAE LAS PROTEINAS CON EL BUFFER DE
RIPA, Y LUEGO EL SOBRE NADANTE LO PONE EN CONTACTO
CON BIURET Y CUANTIFICA, EL VIURET DA UN COLOR
DIRECTAMENTE PROPORCIONAL A LA CANTIDAD DE
PROTEINAS.
II. BCA (ácido bacinconinico) (SOLO CON PROTEINAS)
III. METODO DE BRADFORD
IV. LOWRY

TODOS LOS METODOS PROVOCAN UNA REACCON


CROMOGENA (COLOR)

El analizador de ELISA es un espectrofotómetro


especializado, diseñado para efectuar la lectura de los resultados de
una técnica que se utiliza para determinar la presencia de
anticuerpos o antígenos específicos presentes en una muestra. La
técnica se basa en la detección de un antígeno inmovilizado sobre una
fase sólida, mediante anticuerpos que, directa o indirectamente,
producen una reacción cuyo producto puede ser leído por el
espectrofotómetro. Se le conoce también con el nombre de Lector de
ELISA.

CLASE 13 DE NOVIEMBRE
EXPLICACION LUISA CARDENAS
PODEROSA HERRAMIENTA DE ANALISIS DE EXPRESION DE GENES, DEBIDO
A QUE AL MAYOR DE SECUENCIAS QUE SE PUEDE ANALIZAR POR PRUEBA
GRANDES VENTAJAS SOBRE LA PCR, DEBIDO A QUE ESTAS TIENEN UN
NUMERO LIMITAOS DE GENES QUE SE PUEDEN ANALIZAR DE MANERA
SIMULTANEA.
MICROARREGLO: ES UNA SERIES DE SONDAS DE DNA, CON LONGITUD
VARIABLES, UNIDOS A UN SOPORTE SOLIDO EN UNA POSICION REGULAR.
SONDA: DNA FIJADO AL CHIP DEL MICROARREGLO, SECUENCIAS DE
NUCLEOTIDOS QUE CORRESPONDEN AL GEN DE INTERES QUE QUIERES
DETECTAR Y ESTA FIJADO AL SOPORTE SOLIDO, QUE UEGO SE HIBRIDAN
CON LOS GENES DE INTERES
SOPORTE: PUEDE SER NYLON, ORO, SILICON, VIDRIO
SE PUEDEN CALOSIFICAR EN DOS GRUPOS:
a. BIOMICROARREGLOS (BIOCHIPS: PUEDE ESTAR CONSTUTUIDOS POR
MATERIAL BIOLOGICO, COMO ACIDO NUCLEICO, ENZIMAS,
ANTICUERO, CELULAS, TEJIDO, ETC.)
b. MICROARREGLO QUIMICO: MOVILIZACION DE MOLECULAS DE
ORIGEN ENSERICO (¿?)
ETAPAS DE TRABAJO:
1. SELECCIÓN DEL MICROARREGLO: SABER CUAL VAMOS A UTILIZAR,
CONOCER LA SECUENCIA DE INTERES (BIBLIOTECA BIOMICA)
2. OBTENER LA MUESTRA: POR TEJIDO, SANGRE, ETC. HACEMOS UNA
PURIFICACION DEL DNA O RNA, OBTENIENDO CDNA.
3. AMPLIFICACION DEL MATERIAL GENETICO: MARCAMOS LA MUESTRA
4. HIBRIDACION DEL MICROARREGLO: SE HACE UN LAVADO Y CAPTURA
DE DATOS DEL LAVADO, DE LA SEÑAL
5. INTERPRETACION Y ANALISIS DE LA EXPRESION O VARIACION
GENETICA
EJEMPLO

USOS:

EXPRESION GENETICA: COMO SE EXPRESA UN GEN EN DIFERENTES


CONDICIONES EXPERIMENTALES: TERAPEUTICAS, FISIOLOGICAS

MICROBILOGIA: CARACTERIZAR CEPAS DE MICROORGANISMOS Y


ESTABLECER LA PRESENCIA DE FACTORES DE ILIORIENSIA EN CAPAS
DE INETRES CLINICO

TRANSPLANTE: PACIENTES CON RECHAZO DE ORGANOS, GRACIAS A


EL MICROARREGLO, SE VIO QUE LAS PERSONAS EXPRESABAN UNOS
GENES QUE HACIAN QUE RECHAZARA EL ORGANO.
TAMBIEN SE PUDO VER LA DIFERENCIA EN EL PERFIL DE EXPRESION
DE GENES DE LOS CORAZONES DE RATONES VIEJOS Y JOVENES

ONCOLOGIA: IDENTIFICAR TIPOS DE CANCER. Y EL PERFIL DE


EXPRESION DE GENES HA PERMITIDO DISEÑAR ESQUEMAS DE
TRATAMIENTO Y HACER PREDICCIONES DE LA RESPUESTA DE
TRATAMIENTO A LA TERAPIA. (DIAGNOSTICO DIFERENCIAL ATRAVES
DE MIRCRORRAY)
LOS RESULTADOS DE INTERES DE LOS TRANSCRIPTOMA, SE PUEDE
ENCONTARA QUE HAY GENES QUE SE EXPRESAN MAS QUE OTROS, X O Y
CONDICION, HAY TECNICAS QUE ADEMAS DE LA BIOINFORMATICA,
PERMITEN VALIDARLAS, COMO LA QPCR E INCLUSO LOS MICROARREGLOS,
PARA VALIDAR LA INFORMACION.
EN LA TRANSCRIPTOMICA EL ANALISIS POR SECUENCIAMIENTO DE RNA NO
SE USA MATRIZ SOLIDA, NI SONDAS PARA QUE SE UNA EL MATERIAL DE
CDNA MARCADO, POR EJEMPLO, EL RNA, SE HACE SOLO SOBRE EL
TRANSCRIPTOMA (CODIFICANTES O NO CODIFICANTES).
LOS MICROARREGLOS, LO PUEDE HACER PARA IDENTIFICAR ESTRUCTURAS
O IDENTIFICAR SECUENCIAS A NIVEL GENOMICO (NO SOLO
TRANSCRITOMICA SI NO TAMBIEN A NIVEL DE DNA GENOMICO, NO EL
CDNA, PORQUE SOLO SECUENCIA RNA)
DESVENTAJA: NO PERMITE IDENTIFICAR GENES O TRANSCRIPTOS NUEVOS,
YA QUE EL MICROARREGLO TIENE LAS SONDAS QUE SELECCIONAS PARA
LOS GENES QUE QUIERES IDENTIFICAR, CIERRA LA POSIBILIDAD DE
IDENTIFICAR NUEVOS GENES.
EN EL TRANSCRIPTOMA BASADA EN EL SECUENCIAMIENTO DE RNA,
PUEDES ENCONTRAR NUEVOS TRANSCRITOS.LA INFORMACION ES MAS
MACRO.
AMBOS PUEDEN HACER ANALISIS ESTADISTICO Y COMPARARLO, PUEDEN
EVALUAR LOS NIEVELS DE EXPRESION (EXISTA MAYOR O MENOR
EXPRESION ENTRE UNA CONDICION Y OTRA), PUEDE INDEMTIFICAR
TRANSCRIPTOS EXPRESADOS ENTRE UN GRUPO Y OTRO.
MICROARREGLO:

a. COSTO MAS BAJO


b. NO PUEDE DETECTAR VARIACIONES ESTRUCTURALES DE
SECUENCIAS.
c. NO PUEDE DETECTAR ISOFORMAR (GEN QUE PERTENECE A UNA
MISMA FAMILIA Y QUE SE PARECE A OTRO, SOLO QUE TIENE
UNA VARIACION EN PEQUEÑAS SECUENCIAS)
d. NO ES UN METODO DE CUANTIFICACION ABSOLUTA
e. SU SENSIBILIDAD ES MENOR
f. SON SONDAS ESPECIFICAS PARA GENES ESPECIFICOS QUE
DESEAMOS CONOCER (LIMITADO)

TRANSCRIPTIMICA (SECUENCIAMIENTO DE RNA)

a. MAS CARO
b. LA TECNOLOGIA QUE SE USA ES MAS ROBUSTA Y CADA VEZ
MAS NUEVOS EQUIPOS
c. PUEDE DETECTAR VARIACIONES ESTRUTURALES, COMO
FUSIONES DE GENES Y EVENTOS DE SPLICING ALTERNATIVOS
(ESTO LO PUEDE HACER EL RNA DE SECUENCIAMIENTO,
PERMITE DISCRIMINAR BASE POR BASE, PARA CONOCER LA
SECUENCIA ESPECIFICA ENTRE UN TRANSCRIPTO Y OTRO)
d. TE DA TODOS LOS GENES QUE SE PUEDEN EXPRESAR
TECNICAS DE ANALISIS DE PROTEINAS

WESTERN BLOT
PERMITE IDENTIFICAR LA PRESENCIA DE PROTEINAS Y SE TIENE LA GRAN
VENTAJA DE ESTUDIAR MODIFICACIONES POSTTRADUCCIONALES (ESTADO)
DE LAS PROTEINAS (COMO LA FOSFORILACION)
PODEMOS EVALUAR UN GRUPO NORMAL Y UN GRUPO PATOLOGICO
(QUISIERA SABER SI UNA PROTEINA ESTABA MAS FOSFORILADA EN EL
GRUPO NORMAL O EN EL PATOLOICO Y EN ESTE CASO TOCA EXTRAER LAS
PROTEINAS, SE CUANTIFICA EN AMBOS GRUPOS POR SEPARADO, LUEGO SE
CARGA EN CADA POZO)
CONDICION NORMAL: A
CONDICION PATOLOGICA: B
CUANTIFICO SUS MUESTRAS, Y SERVIRLAS EN LOS POZOS.
¿Por qué ES NECESARIO QUE CUANTIFIQUE PREVIAMENTE LAS PROTEINAS
ANTES DE SERVIRLAS EN EL GEL DE POLIACRILAMIDA?
PARA SABER CUANTA CANTIDAD DE PROTEINAS TENGO EN CADA
EXTRACCION, ADEMAS PORQUE DEBO SERVIR LA MISMA CANTIDAD EN EL
POZO A Y EN EL B, PORQUE LAS VOY A COMPARAR, Y SI YO QUIERO
COMPARAR CUAL EXPRESA MAS PROTEINAS QUE LA OTRA DEBO SERVIR LA
MISMA CANTIDAD (LA MISMA CONCENTRACION) O SERIA COMO HACER
TRAMPA.
EL WESTERN BLOT ESTA BASADO EN UN INMUNO ENSAYO (UN INMUNO
ENSAYO SE REFIERE A LA UTILIZACION DE LOS ANTICUERPOS PARA
DETECTAR UNA PROTEINA ESPECIFICA)
ENTONCES NECESITO TENER INICIALMENTE UN ANTICUERPO PRIMARIO
QUE RECONOZCA LA PROTEINA DESEADA.
1. PRIMERO CORREMOS LAS MUESTRAS, PARA QUE SE PUEDAN
SEPARAR EN EL GEL POR SU TAMAÑO, LA PROTEINA DEBO
SEPARARLA DEL RESTO DE PROTEINAS Y ESTAN EN UN GEL DE
POLIACRILAMINA, ESTO SE LLAMA UNA ELECTROFORESIS DEE
PROTEINAS, ES VERTICAL
2. LA SIRVO EN EL POZO Y ELLAS VAN A CORRER, SE SEPARAN POR SU
PESO, PARA QUE ESO SUCEDA LAS CALIENTA PRIMER (94°) LAS
DESNATULARIZA, Y EMPIEZAN A CORRER
3. UNA VEZ QUE LAS PROTEINAS CORRIERON POR EL GEL, Y LAS
PROTEINAS HAN MIGRADO EN LOS POZOS Y CLARAMENTE LA
PROTEINA DE TU INTERES TIENE UN PESO CONOCIDO
4. ENTONCES PARA VISUALIARLAS DEBO TRANSFERIR EL GEL DE
POLICARILAMINA, A UNA MEMBRANA, LO MONTO A UNA, ESTO ES
UNA MEMBRANA DE NITROCELULOSA O POLIVINILCELULOSA
5. AHORA LO QUE HAGO ES TRANSFIERO LAS PROTEINAS DE GEL A UNA
MEMBRANA (SE COLOCA UNA CORRIENTE, COMO LAS PROTEINAS
ESTAN CARGADAS Y CON EL GRADIIENTE ELECTRICO, LAS
PROTEINAS SE PASAN DDEL GEL A LA MEMBRANA) PERO AUN NO LO
PUEDO VISUALIZAR
6. LUEGO CUANDO SE PASEN A LA MEMBRANA, INCUBO LA MEMBRANA
CON UN ANTICUERPO PRIMARIO, EL ANTICUERPO RECONOCE LA
PROTEINA DE INTERES
7. HAGO UNA SEGUNDA INCUBACION Y LE COLOCO UN ANTICUERPO
SECUNDARIO QUE SE UNE AL ANTICUERPO PRIMARIO, PARA QUE LO
RECONOZCA, EL ANTICUERPO SECUNDARIO ESTA ACOPLADO (UNIDA)
A UNA ENZIMA, LA ENZIMA SE LLAMA HRP (PEROXIDAZA DE RABANO
(DEGRADA EL PEROXIDO DE HIDROGENO)) (TODO ESTO OCURRE EN
LA MEMBRANA). POR CADA PROTEINA DE INTERES HAY UN
ANTICUERPO Y UNA ENZIMA
8. PARA YO DETECTARLA Y SABER CUANTO HAY DE LA PROTEINA, LO
TENGO QUE REVELAR, EL REVELADO SE HACE MEDIANTE UNA
AUTORADIOGRAFIA EN EL CUAL VISUALIZO LAS PROTEINAS DE
MEMBRANA
9. SE VISUALIZA PORQUE LA HRP, EN PRESENCIA DEL PEROXIDO DE
HIDROGENO (SUSTRATO) MAS EL LUMINOL (QUIMIOLUMINICENTE):
H2O2+LUMINOL: GENERAN LUZ, Y AL GENERAL LUZ, ES CAPTADO POR
UN EQUIPO Y ESA REACCION DE QUIMIO LUMINICENSIA GENERA UN
REVELADO DE LA MEMBRANA.
10. EL LUMINOL SE REDUCE Y GENERA LOS MANCHONES QUE
REPRESENTA INTENSIDAD DE LA PRESENCIA DE PROTEINAS, MAS
GRUESO Y MAS INTENSO, HAY MAS PROTEINA, POR OTRO LADO, SIK
ES DELGADA Y TENUE, TIENE MENOS PROTEINA (TIENES MENOS
NIVEL DE FOSFORILACION O LO QUE SEA DE LA PROTEINA ESCOGIDA)
LA MUESTRA A, ESTA MAS FOSFORILADA, POR ESO ESTA MAS
OSCURA CON MAS INTENSIDAD, LA BANDA ES MAS GRUESA, ESO
INDICA QUE EL CONTROL TIENE MAYOR PRODUCCION DE LA
PROTEINA Y MAYOR FOSFORILACION DE ESTA.

EJEMPLO:

TRATAMIENTO DE QUIMIOTERAPIA.
LA A ES UN PLACEBO (VACIO).
LA B TIENE UN FARCAMO 3D.
LA PROTEINA QUE QUIERO IDENTIFICAR ES LA PROTEINA ERK
(QUINASA DE RESPUESTA EXTRACELULAR), QUE AL ESTAR
FOSFORILADA HACE QUE LAS CELULAS TUMORALES PROLIFEREN
MAS. CUANDO HAY MAYOR FOSFORILACION DE ERK, EXISTE UNA
MAYOR PROLIFERACION(MULTIPLIACION) DE LAS CELULAS
TUMORALES POR LO TANTO LOS TUMORES CRECEN, PORQUE LAS
CELULAS DE MULTIPLICAN.
ENTONCES LO QUE HAYE CON EL WESTERN BLOT ES QUE UANDO
AGREGUE LA QUIMOTERAPIA CON EL FARMACO 3D VOY A TENER LOS
RESULTADOS ANTERIORES DE LA BANDA.
CONCLUYO QUE EL TRATAMIENDO ES EFECTIVO. YA QUE EN ESTE
CASO B ES EL FARMACO Y SE VE MENOS PRODUCCION EN LA
PROTEINA. Y ASI NO CRECE EL TUMOR.

A TENER EN CUNTA:

EL WESTERN BLOT ES UN INMUNO ENSAYO PORQUE USA


ANTICUERPOS QUE DETECTA PROTEINAS (LLAMADA EN ESTE CASO
ANTIGENO) LA PROTEINA RECONOCE EL ANTICUERPO Y USO UN
ANTICUERPO SECUNDARIO QUE VIENE ACOPLADO CON UNA ENZIMA
HRP (QUE SIRVE PARA REVELAR LA MEMBRANA) Y PONIENDOLE
PEROXIDO DE HIDROGENO EN PRESENCIA DEL LUMINOL PUEDO
GENERAR BANDAS VISIBLES QUE CORRESPONDEN A LA
CONCENTRACION DE LA PROTEINA.
NO TODOS LOS GELES SE VEN GRISES.

FUNDAMENTO DE LA TECNICA DE REVELAD QUIMIOLUMINISCENCIA

LUMINOL (SE OXIDA) +H2O2 Y HRP (PEGADA AL ANTICUERPO


SECUNDARIO), SE LA UNA OXIDACCION DEL PRODUCTO LUMINOL Y
GENERA LUZ (DETECTADA POR EL EQUIPO DE QUIMIOLUMINICENSIA)
Y SE GENERA UNA IMAGEN.
EL EQUIPO INVITROGEN IBRIGHT IMAGING SYSTEMS, DA LA
POSIBILIDAD DE DETECTAR QUIMIOLUMINICENSIA Y GENERAR LAS
BANDAS (REVELADO DE LA MEMBRANA) TAMBIEN PUEDE LEER
DIFERENTES LONGITUDES DE ONDA (FLUORESCENCIA)

EN VEZ DE UNA REACCION DE QUIMIOLUMINICENSIA, PUEDO


REMPLAZARLA Y COMPRAR UN ANTICUERPO SECUNDARIO SIN HRP SI
NO QUE LE VAMOS A UNIR UN FLUOROCROMO DE CUALQUIER COLOR
(COMO UN ALEXA FLUOR 488 ESO EMITE UNA LONGITUD DE 520 Y ESO
DA COLOR VERDE) (ALEXA FLUOR 555 Y ESO DA COLOR NARANJA)
(ALEXA FLUOR 615 Y ESO DA COLOR ROJO TENUE) (ALEXA FLUOR 595
Y ESO DA COLOR ROJO FUERTE) Y LUEGO ESO EMITE UNA LONGITUD
DE ONDA, CUALQUIERA DE ESOS FLUOROCROMOS LOS PUEDO
ACOPLAR AL ANTICUEERPO SECUNDARIO PARA OBTENER DIFRENTES
COLORES)
ESTOS SON EJEMPLOS DE LO QUE PUEDE LEER EL EQUIPO:

SDS PAGE (PROTEINAS QUE SE CORREN EN UN GEL DE


POLIACRILAMINA, NO SE LE COLOCA NI EL ENSAYO DE
QUIMIOLUMINICENSIA NI FLUORESCENCIA, ESTOS GELES NO TIENEN
UN INMUNOENSAYO, NO ES UN WESTERN BLOT) (ES UNA GEL DE
POLIACRILAMIDA DE SDS (SODIO DUODECIL SULFATO: DETERGENTE
PARA DARLE CARGAS A LA PROTEINAS)). ENTONCES AQUÍ SE
REVELAN LOS GELES CON AZUL DE COMASSIE.

ELECTROFORESIS EN UN GEL DE AGAROSA QUE ESTAN TEÑIDOS CON


SYBER O BROMURO, AQUÍ NO SON PROTEINAS, SON GENES.

TECNICA DE INMUNOFLUORESCENCIA

IDENTIFICAR LA PRESENCIA DE PROTEINAS EN TEJIDOS.


ACTINA: HACE PARTE DEL CITROPLASMA (CITOESQUELETO)
EN ESTE EJEMPLO LA INMUNO FLUORESCENCIA DETECTO LA
PRESENCIA DE ACTINA, LO AZUL SON LOS NUCLEOS UWU
PUEDO DETECTAR EN UN TEJIDO LA PRESCENCIA DE DOS PROTEINAS
AL MISMO TIEMPO.

¿COMO FUNCIONA Y COMO SE USA?

SE CORTA EL TEJIDO, SE COLOCA EN UNA PLACA, EN ESA PLACA


HACEMOS UNA INMUNOFLORESCENCIA PARA DETECTAR LA
PROTEINA.

CUANDO USTED TIENE UN CORTE DE TEJIDO HISTOLOGICO Y QUIERE


DETECTAR LA PRESENCIA DE UNA PROTEINA.

PASOS:

1. TEJIDO, QUIERO DETECTAR UNA PROTEINA EN EL TEJIDO


2. AL TEJIDO LO CORTO CHIQUITO, LO COLOCO EN UNA LAMINA
HISTOLOGICA
3. INCUBO LA MUESTRA DE TEJIDO CON UN ANTICUERPO PRIMARIO
Y EL ANTICUERPO PRIMARIO RECONOCE LA PROTEINA QUE BUSCO
(4°)
4. LUEGO SE COLOCA UN ANTICUERO SECUNDARIO Y ESTE ESTA
ACOPLADO A UN FLUOROCROMO DE CUALQUIER COLOR
5. VUELVO A HACER LA INCUBACION, PERO CON EL SECUNDARIO (4°-
37° PARA MENOS HORAS)
6. VOY A UN MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA Y DETECTO EL
COLOR, YA QUE EXCITO EL FLOROCROMO DE UNA LUZ UV DE UNA
LONGITUD QUE PERMITE EXCITAR EL COLOR VERDE (COMO CASI
SIEMPRE 488) ESTO ENCIENDE EL FLUOROCROMO.
a. SE TIENE UNA FUENTE DE LUZ (UV, QUE PUEDO MANDAR
DIFERENTES LONGITUDES DE ONDAS, LO PUEDO MANEJAR
CON UN FILTRO)
b. LLEGA A UNA FUENTE
c. PASA POR UN ESPEJO DICROICO
d. SE REFLEJA
e. LLEGA A LA MUESTRA Y LA MUESTRA ES ESTIMULADA CON
UNA LONGITUD DE ONDA Y ESTA EMITE OTRA LONGTUD DE
ONDA MAYOR
f. PASA POR EL ESPEJO DICROICO
g. LLEGA A UN FILTRO DE EMISION: DEBO ASEGURARME DE
QUE SOLO PASE LA ONDA QUE DEBE PASAR, PARA QUE YO
PUEDA DETECTAR LA LONGITUD QUE SE DEBE
h. VISUALIZA DIRECTAMENTE DEL OCULAR, AUNQUE
TAMBIEN HAY EQUIPOS CON CAMRAS QUE CAPTAN ESO Y
LO MANDAN A LA CPU.
¿EN VEZ DE USAR UN ANTICUERPO EN VEZ DE UNO
PRIMARIO Y OTRO SECUNDARIO?

CLASIFICACION DE LA INMUNOFLUORESCENCIA

INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA E INDIRECTA:

INDIRECTA: TENEMOS UNA PROTEINA (ANTIENO) QUE


ESTOY DETECTANTO CON UN ANTICUERPO PRIMARIO QUE
LO RECONOCE, EL ANTICUERPO PRIMARIO LO INCUBO CON
UNO SECUNDARIO, ESTE ESTA ACOPLADO A UN
FLUOROCROMO.
AQUÍ PUEDO DETECTAR VARIAS PROTEINAS, CAMBIO EL
PRIMARIO Y USO EL SECUNDARIO PARA OTRAS PROTEINAS

DIRECTA: HAY UNA PROTEINA Y COMPRAS UN ANTICUERPO


PRIMARIO QUE VIENE ACOPLADO AL FLUOROCROMO (MAS
ESPECIFICO), ES MAS Caro. REDUCE EL TIEMPO.
NO SE USA CASI PORQUE ESE ANTICUERPO CON EL
FLUOROCROMO SOLO SIRVE PARA UNA PROTEINA.

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