Técnicas de separación: Filtración, Decantación y Cromatografía

UD 6 SEPARACIÓN. TÉCNICAS.
| ESTELA GARCÍA ORDAZ
UD 6 TÉCNICAS DE SEPARACIÓN
INTRODUCCIÓN
En este tema vamos a ver las técnicas básicas que se utilizan en el laboratorio para separar los
componentes de mezclas de componentes sólidos o líquidos. Cada una de ellas se basa en una
característica diferente de los integrantes del sistema:
Característica diferenciadora Técnica de separación

Tamaño FILTRACIÓN
DIÁLISIS
Densidad DECANTACIÓN
CENTRIFUGACIÓN
Solubilidad EXTRACCIÓN
Carga-tamaño ELECTROFORESIS
Afinidad, capacidad de absorción CROMATOGRAFÍA
I. FILTRACIÓN
1. CONCEPTO
FILTRACIÓN: método de separación basado en las diferencias de tamaño entre las

partículas a separar. Consiste en hacer pasar una suspensión a través de un filtro de un
determinado tamaño de poro. Las partículas con tamaño superior al tamaño del poro no
podrán atravesarlo y quedarán retenidas en su parte superior (recibiendo el nombre de
RESIDUO, aunque no siempre es material a desechar), mientras que el resto caerán al
recipiente sobre el que se ha colocado el filtro (FILTRADO).
La filtración es una de las técnicas más utilizadas en el laboratorio. Puede tener como
objetivo recoger el filtrado, recoger el residuo o ambos. Así, por ejemplo, se utiliza para
eliminar impurezas de las disoluciones, esterilizar disoluciones, concentrar muestras eliminando
parte del disolvente, etc.
2. FILTROS
FILTROS: dispositivos porosos de diversa naturaleza, que dejan pasar partícula de tamaño
inferior al de su poro. Pueden ser de materiales muy diferentes: papel, porcelana, de vidrio
molido, de membrana (nylon, acetato de celulosa). Se ha de elegir el tipo de filtro adecuado al
tipo de filtración y a la naturaleza de las sustancias a filtrar.
Tipos de filtros
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1) Filtros de papel: papel de celulosa especial, con un tamaño de poro variable. Se

utilizan con un embudo de vidrio para darles estabilidad. Se venden ya elaborados,
pero pueden elaborarse de una manera fácil.
1.1. El filtro liso (alemán): Este tipo de

filtro se utiliza cuando lo que
interesa recoger son las partículas
que quedan en el filtro.
Se elabora de la siguiente manera:

- Se pliega un círculo de papel por
su diámetro.
- El semicírculo resultante se
pliega por la mitad.
- Se ajusta al embudo, recortando
los bordes sobrantes si es
necesario.
1.2. El filtro de pliegues (francés): ofrece una mayor superficie de filtración que el liso,
por lo que la velocidad de filtración es mayor.
Elaboración:
- Se dobla un círculo de papel por su diámetro (1)
- El semicírculo obtenido se dobla por la mitad, marcando las líneas de pliegue (2)
- Se desdobla, para dejar la forma de semicírculo (2)
- Cada sección obtenida se pliega por la mitad, llevando los vértices del semicírculo
a la línea de pliegue central > así habremos marcado 4 secciones. (3 y 4)
- Cada una de las secciones se divide en otras dos mitades, volviendo a llevar los
vértices del semicírculo a las nuevas líneas de pliegue obtenidas > marcado de 8
secciones. (5)
- El fuelle obtenido se coloca sobre el embudo de manera que adopte su forma de
cono.
2) Filtros de membrana
Son discos de acetato o nitrato de celulosa. Hay con diferente tamaño de poro. Se usan
para esterilizar disoluciones por filtración, ya que sus diámetros de poro se corresponden con
los tamaños de diferentes bacterias.
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3) Filtros de vidrio molido o placas filtrantes.

Están formados por vidrio molido y aglomerado, por lo que presentan una gran resistencia
química. También hay con diferente tamaño de poro.
3. MÉTODOS DE FILTRACIÓN LABORATORIALES
3.1. FILTRACIÓN POR GRAVEDAD
Se utiliza la fuerza gravitatoria para

hacer pasar el líquido a través del
filtro. Se suele utilizar un filtro de
papel en forma cónica (liso o de
pliegues) que debe quedar bien
ajustado al embudo y sobresalir de
éste entre 0,3-0,5 cm. El embudo se
sujeta con un aro metálico a un
soporte, ya que el proceso de
filtración puede durar un cierto
tiempo. Debajo del embudo se
coloca el recipiente para recoger el
filtrado
Una vez montado todo el sistema de filtrado se procede a la filtración, para ello se
siguen las siguientes precauciones:
- Se vierte un poco de la disolución a filtrar en el interior del filtro de forma que se
humedezcan las paredes del filtro y se peguen bien al embudo.
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- Se va vertiendo poco a poco la solución a filtrar teniendo la precaución de no

llenar más allá de 0,5cm del borde del filtro para que no rebose.
- El extremo inferior del embudo debe tocar la pared interior del recipiente en el
que se recoge el filtrado
- Toda la filtración que se encuentra en el filtro ha de quedar por encima del nivel
del líquido filtrado ya depositado en el recipiente.
3.2. FILTRACIÓN POR VACÍO O PRESIÓN REDUCIDA.
Requiere conectar el extremo final del brazo del matraz kitasato a una bomba de
vacío, de tal forma que se origine un vacío que acelere el paso del líquido a través del
filtro ya que se produce un efecto de succión. Por tanto, todos los materiales usados
deben soportar esta fuerza.
El filtro se coloca en un embudo especial de vidrio o cerámica con el fondo

agujereado o una placa filtrante montada en un embudo.
Existen sistemas de filtración al vacío de diferentes marcas comerciales.
El procedimiento de filtración al vacío consiste en los siguientes pasos:

- Se prepara el montaje:
o Se coloca el matraz kitasato sobre un soporte metálico, sujetando el cuello
del matraz con unas pinzas.
o Se acopla el embudo a la boca del matraz colocando en esta un tapón de
goma con un agujero central, que permite que el encaje sea hermético y
funcione el sistema de vacío correctamente.
o Se conecta la boca lateral del matraz kitasato al sistema de vacío mediante
un tubo de goma.
o Se coloca el filtro en el interior del embudo. Debe humedecerse un poco
con el disolvente antes de filtrar para que se adhiera bien al embudo.
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- Se procede al filtrado: se vierte el líquido a filtrar en el embudo y se conecta la

bomba de vacío. Se ha de evitar verter sobre los bordes del embudo. Finalizado el
proceso, se desconecta el sistema de vacío.
 Si el objetivo es recoger el residuo filtrado: para arrastrar todo el sólido que haya
quedado en el recipiente original en el que estaba la solución a filtrar, se añade un poco
de disolvente del que se esté utilizando (ej: agua destilada) y se vierte sobre el
embudo. Una vez que se ha filtrado toda la suspensión se lava el sólido filtrado
añadiendo más agua o el disolvente adecuado.
3.3. SISTEMAS DE PRESIÓN POSITIVA
Consisten en la utilización de una jeringa (que se carga con la solución a filtrar) a la que
se le acopla un filtro > se empuja con el embolo haciendo pasar el líquido a través del
filtro.
Estos sistemas se aplican cuando la cantidad a filtrar es muy pequeña (por ejemplo,
para esterilizar pequeñas cantidades de disoluciones). En estos casos, el sistema de
filtrado contiene un filtro de un tamaño de poro tal que impide el paso de
microorganismos. Tanto el filtro como el recipiente en el que se vierte la solución
filtrada deben ser estériles y la filtración debe efectuarse en el interior de una cabina
estéril.
II. DECANTACIÓN
DECANTACIÓN: método de separación de los componentes de una mezcla heterogénea

basado en las diferencias en la densidad y la acción de la gravedad > Si se deja reposar la
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mezcla durante el tiempo suficiente, el componente de mayor densidad queda abajo

mientras que el de menor se sitúa arriba. Una vez aisladas las dos fases, se individualizan por
diferentes métodos (aunque en el soluto siempre queda algo de disolvente):
- Vertido directo por inclinación del recipiente
- Aspirado de la fase superior con una pipeta Pasteur.
- Usando un EMBUDO DE DECANTACIÓN: para emulsiones.
III. EXTRACCIÓN
Método basado en la diferente solubilidad de diferentes componentes de una mezcla.

El procedimiento consiste en añadir a la muestra (formada por una/s sustancia/s polar/es
y apolar/es) un disolvente polar o apolar, de manera que la sustancia correspondiente
quedará disuelta en él. Después se aislarán las diferentes fases mediante otros métodos
(centrifugación, decantación...)
También pueden usarse dos disolventes opuestos a la vez.
La extracción por diferencias en la solubilidad es la base para la separación de los ácidos

nucleicos.
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IV. CENTRIFUGACIÓN
1. CONCEPTO DE CENTRIFUGACIÓN
CENTRIFUGACIÓN: método de separación de los componentes de una mezcla líquida (aunque

tenga elementos sólidos) mediante la aplicación de una fuerza giratoria (fuerza centrífuga).
Tras él, la mezcla de componentes se separa en varias fases (pueden ser más de 2).
Llamamos:
- SOBRENADANTE: a la que se queda en la superficie
- SEDIMENTO: la que se deposita en el fondo del recipiente usado.
Hay varios tipos de centrifugación, dependiendo del factor que permite que las fases se
separen:
1) CENTRIFUGACIÓN DIFERENCIAL: las fases se separan en función de su velocidad de

sedimentación. Son ampliamente utilizadas en los laboratorios clínicos, ya que son
suficientes para muchas de las actividades separativas habituales. Ej: separación de
los elementos formes de la sangre o precipitados (desproteinización, técnicas
inmunológicas), etc.
2) CENTRIFUGACIÓN ZONAL: separación en función de la masa. Usado para la separación

de proteínas séricas de distintas fracciones de globulinas; aislamiento de RNA y DNA;
separación de componentes celulares, etc.
3) CENTRIFUGACIÓN ISOPÍCNICA: por la densidad (masa/volumen, g/l). Por ejemplo, se

usa para separar partículas de tamaño similar, pero de diferente densidad, como
ácidos nucleicos u orgánulos celulares. Es útil para la separación de lipoproteínas
(cuya principal característica diferencial es la densidad); aislamiento y purificación de
ácidos nucleicos, etc.
4) MÉTODO DE BARRERA: consiste en adicionar un medio con una densidad intermedia

a la de los componentes de la muestra, de manera que al centrifugar quedará entre
esas dos fases, separándolas claramente. Se emplean para ello medios comerciales
como Ficoll-Paque, Lymphoprep y otros muchos, formados generalmente por mezclas
de Ficoll (un polisacárido sintético) y metrizamida (un compuesto sintético yodado).
Incluso hay medios específicos para obtener fracciones de células concretas (por
ej., Nycoprep 1.077 para células mononucleares, Nycoprep 1.068para
monocitos, Polymorhoprep para células polimorfonucleares, o Nycoprep 1.063 para
plaquetas). Se utiliza para la separación de células mononucleares del resto de la
sangre (separadas de los demás tipos de células).
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A nivel práctico, cada partícula tiene una VELOCIDAD DE SEDIMENTACIÓN (vS) en función de
su tamaño, densidad, forma y de las características del medio en el que se encuentra, por lo
que:
 hay que aplicar una velocidad adecuada en función de la mezcla que queramos
separar.
 La velocidad de centrifugación a la que se separa una mezcla permite identificar la
naturaleza de esos componentes.
F.
Centrifuga
Radio de
giro
Pe Peso
Eje de so Efectivo
giro
La velocidad de sedimentación o de giro se mide en revoluciones por minuto (rpm) (y debe
ajustarse en la centrífuga antes de centrifugar cada muestra).
Otra unidad de medida es la aceleración centrífuga o Fuerza Centrífuga Relativa (FCR), que
coloquialmente se llama “número de ges”, porque la unidad de medida es la aceleración de la
gravedad (“g”).
Para conseguir la misma aceleración entre dos centrífugas diferentes se debe dar/utilizar el
mismo FCR (y no a misma velocidad de giro –rpm-).
Para pasar de uno a otro, se utiliza la siguiente fórmula:

RCF = 1.12 x Radius x (rpm/1000)2
Conversor on-line: http://insilico.ehu.es/mini_tools/rcf_rpm.php
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Para caracterizar partículas en bioquímica se emplea otra magnitud relacionada: el

COEFICIENTE DE SEDIMENTACIÓN. Esta es una magnitud que tiene unidades de tiempo: el
Svedberg (1 Svedberg = 10-13 segundos).
2. LA CENTRÍFUGA
2.1. Concepto y tipos
CENTRÍFUGA: instrumento consistente en un rotor que hace girar un eje, al cual se encuentra
acoplado un soporte en el que se colocan los recipientes con el material que se va a
centrifugar. Al activar la corriente eléctrica, el rotor girará con la velocidad que hayamos
seleccionado previamente, transmitiendo esa fuerza centrífuga al soporte (o CABEZAL) que
contiene las muestras a centrifugar.
Los cabezales más frecuentes son los horizontales o basculantes y los de ángulo fijo:
 Basculantes u horizontales: Los tubos se hallan dentro de unos cestillos que
cuelgan. Estos cestillos están unidos al rotor con un eje y cuando la centrífuga
gira se quedan suspendidos en dirección perpendicular a la del rotor. Es decir,
que pasan de estar en vertical (en parada) a horizontal (en marcha).
En general este tipo de rotores no permite trabajar con aceleraciones muy altas,
aunque para las técnicas de separación con gradiente se prefiere este tipo de
cabezales.
 Ángulo fijo: los tubos se adaptan a una cavidad que presenta un ángulo entre
25° y 45° respecto al eje vertical de rotación. Durante el movimiento las
partículas chocan contra la pared del tubo, de manera que el sedimento en
bisel. Por su forma aerodinámica estos rotores permiten aceleraciones
superiores.
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En el mercado pueden encontrarse también algunos tipos de cabezales y rotores

adaptados a recipientes especiales para técnicas concretas, como los rotores para
placas de microvaloración con aceleraciones de unas 1500 rpm.
Hay diferentes modelos de centrífugas, en función de sus componentes y de la aplicación

concreta para la que están destinadas, pero el criterio básico para clasificarlas es el rango de
velocidades de giro:
A. Centrífugas de baja velocidad, de

sobremesa o clínicas. De pequeño tamaño y
sin refrigeración. Alcanzan una velocidad
máxima de 5000 rpm. Son útiles para la
separación de partículas grandes como células
o precipitados de sales insolubles.
Las CENTRÍFUGAS MICRÓFUGAS son una

variante de las anteriores que permiten llegar
a velocidades de más de 10.000 rpm, Los
volúmenes de trabajo son muy pequeños. Son
útiles en el campo de la biología molecular.
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Centrífuga especial para microhematocrito.
B. Centrífugas de alta velocidad. Alcanzan velocidades de entre 18.000

y 25.000 rpm. Tienen un sistema de refrigerado y algunas tienen sistema
de vacío para evitar el calentamiento del rotor a causa del rozamiento
con el aire. Son útiles en la separación de fracciones celulares, pero
insuficientes para la separación de ribosomas, virus o macromoléculas en
general.
C. Ultracentrífugas. Superan las 50.000 rpm, por lo que tienen sistemas auxiliares de
refrigeración y de alto vacío. Hay ultracentrífugas analíticas que permiten la obtención de
datos precisos de propiedades de sedimentación
(coeficientes de sedimentación, pesos moleculares), y
preparativas, útiles para aislar partículas de bajo coeficiente
de sedimentación (microsomas, virus, macromoléculas).
2.2. Recipientes de muestras para centrifugado

Existe en el mercado una amplia oferta de recipientes para centrifugación. Para elegir el tipo
de recipiente más apropiado hay que tener en cuenta varios factores:
a) Volumen: Desde algunos tubos tipo Eppendorf (que permiten volúmenes de 1,5 ml, e
incluso inferiores) hasta botellas de 1000 ml.
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b) Producto que se va a centrifugar:

 Para ácidos fuertes: es recomendable que los tubos estén constituidos de polímeros
como las polisulfonas y no de vidrio.
 Para bases fuertes: es recomendable el uso de algunos tipos de vidrio como el Corex,
el acero inoxidable y las polisulfonas.
 Para solventes orgánicos: vidrio
 Para sales: cualquier tubo…
c) Aceleración: No todos los materiales pueden soportar altas aceleraciones.
d) Temperatura de trabajo: hay materiales que resisten determinadas aceleraciones solo

a bajas temperaturas.
2.3. Dispositivos de seguridad y mantenimiento
a) Sistemas de refrigeración: la rotación a alta aceleración produce un aumento del

calor en el interior de la cámara en la que se encuentran las muestras, siendo
necesario mantener una temperatura controlada en ciertas ocasiones.
Actualmente las centrífugas de aceleración intermedia y alta van equipadas con
sistemas de refrigeración. Respecto a las de baja aceleración (las más usuales),
podemos disponer de equipos refrigerados o no.
b) Sistemas de vacío: Es imprescindible en las centrifugas de media y alta

aceleración, ya que permite reducir la fricción del rotor al girar y el calor que con
ello genera.
c) Control de equilibrio: Al colocar los tubos en el rotor hay que procurar que las
cargas situadas a ambos lados del eje de rotación estén equilibradas, es decir, que
sean iguales en masa y tengan el mismo centro de gravedad. Alteraciones en este
equilibrio pueden afectar el eje de rotación y provocar la rotura de los tubos e
incluso el eje. Actualmente la mayoría de centrifugas disponen de controles que
detienen el movimiento en caso de desequilibrio.
d) Freno: Muchas centrifugas vienen equipadas con freno, lo que permite disminuir
el tiempo de desaceleración. Es mejor evitar en lo posible frenados bruscos, ya
que ello puede favorecer la redisolución del sedimento y el remezclado de los
componentes ya separados.
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e) Sistemas de bloqueo de la cámara de rotación: deben existir mecanismos de

bloqueo que impidan el acceso a la cámara de rotación en el caso de que el rotor
esté en movimiento.
f) Mantenimientos programados: es importante el mantenimiento de los equipos en

condiciones adecuadas para evitar peligros, roturas y asegurar un máximo de
eficiencia.
3. PROCEDIMIENTO DE USO
a) Colocar el tubo de muestra (suspensión o disolución) en uno de los receptáculos del rotor.
b) Compensar el tubo de muestra colocando en el receptáculo diametralmente opuesto otro

tubo con un volumen de líquido de peso idéntico al de la muestra (otra muestra o SSF).
c) Cerrar herméticamente el compartimento del rotor.
d) Seleccionar la velocidad de centrifugación y el tiempo de centrifugado.

Esto se elige en función de la velocidad de sedimentación de los componentes de la muestra.
Son valores conocidos e identificativos de cada elemento (de manera que podemos
identificar los componentes de una muestra observando a qué velocidad de centrifugación
han sedimentado).
e) Poner en funcionamiento la centrífuga.

Una vez acabada la centrifugación (normalmente las centrífugas tienen un temporizador que
desconecta automáticamente el motor una vez transcurrido el tiempo programado), esperar
a que se detenga el rotor para abrir la tapa del compartimento donde está alojado – se oirá
un chasquido- y sacar el tubo de muestra -y el de compensación si es necesario-).
4. RIESGOS Y NORMAS DE SEGURIDAD
 La centrífuga ha de estar sobre una base sólida y fija.

 El rotor ha de ser compatible con la centrífuga que se quiere utilizar y ha de estar
perfectamente fijado al motor.
 La distribución de los tubos en el rotor ha de ser tal que éste esté perfectamente
equilibrado (compensado) para evitar vibraciones durante el giro y, por lo tanto, su
rotura. Si es necesario, se utilizan tubos adicionales con volúmenes de líquido de pesos
idénticos a los de las muestras.
 Los tubos han de ser compatibles con la centrífuga para evitar roturas durante el
funcionamiento de la misma.
 La tapa que aísla el rotor del exterior ha de estar bien cerrada y asegurada.
 Nunca se ha de dejar la centrífuga sin atención hasta llegar a la velocidad máxima de
giro.
 Los residuos sólidos y/o líquidos generados en estas operaciones se depositarán en los
contenedores correspondientes.
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2. CROMATOGRAFÍA
1. CONCEPTO DE CROMATOGRAFÍA
La cromatografía es una técnica física que se emplea en los laboratorios clínicos para separar
una gran variedad de sustancias para, después y mediante otras técnicas, poder cuantificarlas.
La separación es posible gracias a dos elementos o FASES que ejercen dos fenómenos
opuestos combinados:
a) FASE MÓVIL: arrastra (Desplazamiento) la mezcla a través del sistema, para hacerla
pasar a través de la fase estacionaria. Puede ser un líquido o un gas.
b) FASE ESTACIONARIA: capta (Retención) uno de los componentes de la mezcla. Puede
ser un sólido o un líquido anclado a un soporte sólido.
Como sólo uno de los dos componentes quedará retenido, el otro “saldrá” junto con la
fase móvil, quedando separados.
Podremos recuperar y cuantificar cualquiera de los dos, después de separarlos de la
fase correspondiente.
ELUCIÓN: PROCESO por el que una fase móvil atraviesa una fase estacionaria y se produce la
separación de los componentes de una muestra.
ELUYENTE: fase móvil, que permite la elución.
ELUÍDO: sustancia que se obtiene del proceso de elución, tras atravesar la fase estacionaria y
salir del sistema.
2. CLASIFICACIÓN DE LAS TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS
Existen diferentes tipos de cromatografía en función del procedimiento operativo empleado.

Los fundamentos son idénticos en todos los casos, lográndose la separación de las mezclas por
exposición de las mismas a un sistema de dos fases.
Las técnicas cromatográficas pueden clasificarse según distintos criterios: de acuerdo con el
estado físico de las fases móvil y estacionaria, según el método de contacto entre estas fases y
según los mecanismos físico-químicos de separación.
a. Según el estado físico o naturaleza de las fases
NOMBRE TÉCNICA FASE MÓVIL FASE ESTACIONARIA OBSERVACIONES

CROMATOGRÁFICA
C. LÍQUIDO- SÓLIDO LÍQUIDO SÓLIDO
(LSC)
C. GAS- LÍQUIDO (GLC) GAS LÍQUIDO NO VOLÁTIL LOS LÍQUIDOS
IMPREGNADO EN UN HAS DE SER
SÓLIDO INMISCIBLES
C. LÍQUIDO-LÍQUIDO LÍQUIDO LÍQUIDO ANCLADO A
(LLC) SOPORTE SÓLIDO
C. GAS-SÓLIDO (GSC) GAS SÓLIDO
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b. Según la disposición del soporte cromatográfico
 Cromatografía en papel: fase estacionaria = papel de filtro.

 Cromatografía en placa: fase estacionaria recubre una placa plana de vidrio, metal
o plástico.
 Cromatografía en columna: la fase estacionaria se coloca en una columna delgada
por la que se mueve la fase móvil bajo la influencia de la gravedad o la presión.
c. Según mecanismo físico-químico de separación o tipo de interacción entre

componentes de ambas fases.
 Cromatografía de adsorción: las partículas de uno de los componentes de la mezcla

quedan adheridas a la superficie de la fase estacionaria, que siempre es sólida (Ej:
alúmina, gel de sílice, carbón activo, etc.)
La retención es debida a fuerzas de atracción débiles (tipo electroestático, puentes de
hidrógeno…), por lo que es reversible > se liberan las partículas adheridas, de manera
que podemos recuperarlas.
Esta cromatografía puede realizarse en papel, en capa fina y en columna.
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 Cromatografía de intercambio iónico:

INTERCAMBIO IÓNICO: Fenómeno de cesión mutua de átomos cargados entre el
sistema y la muestra, basado en las fuerzas electrostáticas de atracción y repulsión
de los iones.
El material de la fase estacionaria presenta una carga. Al hacer pasar la muestra a su
través (mezclada con la fase móvil), las partículas de signo contrario serán atraídas y
retenidas en la fase estacionaria. Las del mismo signo serán eluidas.
La fase móvil es fundamental porque mediante ella se establece que la muestra
tenga un determinado pH y este pH hace que sus partículas adquieran una carga u
otra. Según la carga de la fase estacionaria tendremos que establecer el pH
correcto.
Este fenómeno hace que sea fácil regenerar la resina que suele usarse como
fase estacionaria, ya que, al pasar otra solución de pH diferente, las partículas
retenidas cambiarán de carga y podrán ser eluídas. A su vez, la resina quedará
libre y podrá volver a ser utilizada.
Esta cromatografía se realiza en columna. En los laboratorios clínicos, la

cromatografía de intercambio iónico se aplica para separar glicohemoglobina,
aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos, etc.
 Cromatografía de exclusión (filtración en gel)

La separación se basa en el tamaño y forma de las partículas de la mezcla.
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La fase estacionaria presenta unos poros de diferentes diámetros:

- más, grandes, por donde la fase móvil puede fluir a mayor velocidad y
- más pequeños y a modo de conductos, por los que pasa con más lentitud
La muestra contiene diferentes componentes, cada uno con un tamaño y

forma de partículas diferente. Las partículas grandes son desviadas a los poros
mayores, por lo que son eluídas con rapidez. Las partículas pequeñas cabrán
por los conductos pequeños, por lo que serán eluídas más lentamente. Así
conseguimos dos fracciones de eluído: la primera, formada por par´ticulas
grandes y la segunda, por pequeñas.
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La cromatografía de exclusión se realiza en columna y se emplea en los

laboratorios de bioquímica clínica fundamentalmente para separar sustancias
de peso molecular elevado.
 Cromatografía de afinidad
Se basa en interacciones muy específicas que tienen lugar entre unas moléculas de la
fase estacionaria (denominadas LIGANDOS) y los componentes de la muestra
(hormona-receptor, antígeno-anticuerpo…)
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La cromatografía de afinidad se realiza en columna y se emplea en los laboratorios de

bioquímica clínica para separar diferentes compuestos.
3. CROMATOGRAFIA EN COLUMNA. FUNDAMENTOS BÁSICOS
Un CROMATOGRAMA es la representación de la señal del detector en función del tiempo o

del volumen de la fase móvil que eluye.
Pico
cromatográfico
Cromatograma
Los parámetros que recoge son:

- PICO CROMATOGRÁFICO: es la porción de cromatograma que corresponde a cada
compuesto que sale de la columna.
- TIEMPO DE RETENCIÓN (t): es el que transcurre desde la introducción del soluto en la
columna hasta el máximo del pico.
- VOLUMEN DE ELUCIÓN: es el volumen de fase móvil necesario para que salga la
sustancia de la columna.
- RESOLUCIÓN: separación entre dos picos > facilidad para distinguir dos sustancias.
Puede modificarse aumentando la afinidad de los solutos con la columna.
- ANCHURA DE LOS PICOS: cuanto más anchos sean, más eficaz es la columna en la
retención de las sustancias.
El análisis de los resultados puede ser:

- Cualitativo: se valora el tiempo de retención, el volumen de elución y la posición del
pico para identificar la sustancia.
- Cuantitativo: se ha de medir el área de los picos y se compara con la de un patrón.
5. CROMATOGRAGRIA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)
A partir de la cromatografía en columna se ha desarrollado la llamada cromatografía líquida de

alta resolución o HPLC (High-Performance Liquid Chromatography). También se conoce como
cromatografía líquida de alta presión.
 La columna suele ser un pequeño cilindro de acero relleno de micropartículas, que

interaccionarán tanto con las fase móvil, como con los analitos de la muestra.
 La fase móvil (eluyente) ha de estar compuesta por reactivos con un grado de pureza
muy alto. Es impulsada a lo largo de la columna a una presión muy alta.
Permite separar y cuantificar los distintos componentes incluso en pequeños volúmenes de

muestra y de forma rápida.
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Debido a la presión generada por el sistema impulsor, el eluyente va saliendo de forma

continua y arrastrando a los distintos analitos que componen la muestra, que irán saliendo con
tiempos diferentes. Los detectores analizan ese flujo y generan una señal eléctrica
proporcional a la concentración de cada analito. Así se obtiene un CROMATOGRAMA en el
que se distinguen los diferentes TIEMPOS DE RETENCIÓN (desde que la muestra es inyectada
hasta que sale eluido cada uno de los analitos), generando los correspondientes picos.
También son calculadas las áreas de cada pico y el porcentaje que corresponde a cada uno
con respecto al total de ellos.
Ejemplo de la imagen: cromatograma por HPLC también para determinación de hemoglobina

glicosilada, donde se pone de manifiesto que el tiempo de retención para la fracción HbA1c se
sitúa muy próximo a los 2 minutos.
HbA
04-7-11 NO.063
HbA1c 8.0 % HbA1 10.3 %
HbF 1.2 %
HbA1c TIME AREA %

P1 0’49’’ 439 0.9
P2 1’00’’ 396 0.8
P3 1’12’’ 280 0.6
P4 F 1’28’’ 574 1.2
HbF P5 C 1’42’' 367 0.7
P6 A1c 2’01’’ 3587 7.3
P7 AO 3’08’’ 43783 88.5
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6. CROMATOGRAFíA DE GASES
La cromatografía de gases es una técnica de reparto líquido-gas que se realiza en una columna
rellena de un sólido, finamente dividido, que actúa como soporte.
 La fase estacionaria está formada por un líquido no volátil que impregna el soporte
 la fase móvil es un gas inerte, (nitrógeno, helio, hidrógeno o argón) que fluye por la
columna a velocidad constante.
Los principales componentes de un cromatógrafo de gases son:

 Sistema suministrador de gases
 Bloque inyector a temperatura elevada. Todos los constituyentes que se inyectan deben
ser volátiles y, como muchos compuestos no lo son, deben ser modificados
previamente. Una limitación de esta técnica es la estabilidad de la muestra.
 Horno para la columna: es esencial controlar la temperatura de la columna para
conseguir una buena separación.
 Columna: las columnas suelen ser de acero, aluminio, vidrio o cobre. Suelen ser largas
(metros) y muy finas (mm)
 Detector
 Sistema informático
En el laboratorio clínico no es una técnica de amplio uso. Es utilizada en los análisis de

confirmación de drogas de abuso y también en la valoración del test del aliento en el
diagnóstico de Helicobacter pylori.
7. CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA
Se emplea para separar aminoácidos, lípidos, ciertos glúcidos, drogas...

Consiste en:
 Soporte: placa de vidrio (también puede ser plástico o aluminio) recubierta de una capa
fina (menos de 1 mm de espesor) de un material adsorbente (sílica-gel, alúmina,
almidón…).
 Solvente: suele ser una mezcla de disolventes cuya composición dependerá de los
analitos a separar. Los solventes más usados son metanol, etanol, butanol, hidróxido
de amonio, acetona, hexano, agua, ácido acético…
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 Se aplica la muestra a unos dos centímetros del borde inferior de la placa.

 La placa se coloca en una cubeta que contiene en el fondo el solvente (fase móvil), con
una altura aproximada de un centímetro.
 Se tapa la cubeta y se espera a que el solvente vaya ascendiendo por capilaridad y
arrastrando los componentes de la muestra hasta una altura mínima de diez
centímetros, medida desde el punto de aplicación.
 Se retira la placa y se deja secar.
 Se visualiza el resultado: se observan manchas (spots) correspondientes a cada analito
(que se habrán separado según su afinidad por los disolventes usados) mediante:
o Luz UV
o Agentes reveladores: sustancias químicas que reaccionan con los compuestos
de la placa, dando colores. Los agentes más empleados son el yodo,
ninhidrina, permanganato potásico…
 Se analizan los resultados:

o De forma cualitativa: se utiliza el denominado FACTOR DE RETENCIÓN,
RECORRIDO RELATIVO O RELACIÓN AL FRENTE DEL SOLVENTE. Representa la
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relación entre la distancia desde el punto de aplicación a la mancha y la

distancia desde el punto de aplicación al frente del solvente. Identifica
sustancias por comparación con patrones. Para una misma fase estacionaria y
móvil, cada analito tiene su propio factor de retención, que lo diferencia de
otros analitos. Cuanto mayor es el factor, menor es la afinidad de la sustancia
por la fase estacionaria.
Ejemplo:
o De forma cuantitativa: raspando la zona donde se encuentra y disolviendo el

polvo del soporte que estará impregnado de la sustancia a analizar.
3. ELECTROFORESIS
1. CONCEPTO DE ELECTROFORESIS
La electroforesis es una técnica de separación de moléculas en función de su movilidad en un

campo eléctrico.
Se basa en el hecho de que las partículas cargadas se verán atraídas por el polo eléctrico de
carga opuesta y migrarán hacia él.
 Los cationes (con carga eléctrica positiva) se mueven hacia el cátodo (electrodo con
una carga eléctrica negativa).
 Los aniones (con carga eléctrica negativa) se mueven hacia el ánodo (electrodo con
una carga eléctrica positiva).
PERO, ¿EL CÁTODO NO ES POSITIVO Y EL ÁNODO, NEGATIVO?
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Depende del tipo de sistema en el que se encuentren.

 Si el sistema produce energía: el cátodo es positivo y el ánodo, negativo. Ej: pila
voltaica
 Si el sistema consume energía: el cátodo es negativo y el ánodo, positivo. Ej: celda
electrolítica.
Así, de forma muy básica, un sistema de electroforesis se compone de un recipiente al que hay
conectados dos electrodos (positivo y negativo). Dentro del recipiente hay una solución salina
(tampón) que favorece que las moléculas de la muestra que vamos a separar (por ejemplo,
proteínas) presenten una carga determinada. Introduciremos la muestra en un soporte y, al
someterlo al campo eléctrico, los componentes de la muestra cargados irán migrando hacia el
polo de signo opuesto, separándose entre sí. Cada uno migrará más o menos en función de
varios factores, como el tamaño de la molécula. Las moléculas más grandes avanzarán menos
(simplemente por la resistencia que ofrece el soporte a que pasen a su través).
Cuando acabe el proceso de migración, se teñirá el soporte, de manera que podremos

visualizar diferentes bandas, cada una correspondiente a una molécula.
Dispondremos de un patrón en el que se indica la posición que le correspondería a cada

molécula en función de su tamaño (que se indica, en el caso de las proteínas, en KDa). Como
cada proteína tiene un tamaño característico, al comparar “nuestras bandas” con el patrón
podremos determinar de qué proteína se trata.
Resultado: bandas separadas, cada una correspondiente a un tipo de molécula. EJ: diferentes
proteínas.
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Se trata de una técnica fundamentalmente analítica, aunque también se puede realizar con
fines preparativos (para aislar una proteína con la que luego queremos hacer otro tipo de
pruebas).
2. TIPOS DE ELECTROFORESIS
Se puede hablar de 2 tipos de electroforesis:
a. De frente móvil o libre: en el que el campo eléctrico se aplica a disoluciones o

suspensiones.
b. Zonal: en la que el campo eléctrico se aplica a un medio o soporte estabilizante. Son las
más comunes, siendo útiles para lograr la separación de mezclas complejas de proteínas u
otras macromoléculas capaces de cargarse eléctricamente. (Por ello, todo lo que veamos a
continuación será referido a este tipo concretamente).
3. COMPONENTES DE UN SISTEMA DE ELECTROFORESIS ZONAL
Ánodo Cátodo
(Soporte)
3.1. Fuente de alimentación

La fuente de alimentación aporta el potencial eléctrico necesario para el proceso
electroforético. De ella parten dos electrodos, el ánodo (polo positivo, rojo) y el cátodo (polo
negativo, negro) que se conectan a cada uno de los lados de la cubeta de electroforesis.
En la fuente de electroforesis se puede seleccionar los parámetros de trabajo: el voltaje, la
intensidad y el tiempo.
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¿Para qué sirve la creación de un circuito eléctrico en la electroforesis? >

DESPLAZAMIENTO DE LAS MOLÉCULAS EN UN CAMPO ELÉCTRICO: MOVILIDAD
ELECTROFORÉTICA.
CAMPO ELÉCTRICO: región en la que actúa una fuerza eléctrica generada por dos polos
eléctricos (positivo y negativo) entre los que se crea una DIFERENCIA DE POTENCIAL
ELÉCTRICO (también llamado GRADIENTE DE POTENCIAL o VOLTAJE O FUERZA
ELECTROMOTRIZ. Su unidad es el voltio).
Cuanto mayor sea la diferencia de potencial:

 mayor será la fuerza con la que se vean atraídas las partículas cargadas hacia el polo
de carga opuesta
 mejor será la resolución de las bandas que aparecen en la electroforesis.
 Mayor será el calor acumulado en el sistema: si se alcanzan temperaturas demasiado
altas se producirá la evaporación del medio líquido en el que se produce la
electroforesis –TAMPÓN- y la desnaturalización de los componentes de la muestra
(ej: proteínas).
Por ello, se tiene que aplicar un voltaje que logre la relación óptima entre todas estas
circunstancias.
Cuando las moléculas cargadas están sometidas a un campo eléctrico hay dos fuerzas que
actúan sobre ellas:
 Fuerza debida al campo eléctrico: impulsora
F=QE
Q: carga eléctrica del ión (positiva o negativa)
E: intensidad del campo eléctrico
 En otras palabras: A mayor carga eléctrica y mayor intensidad de campo,
mayor migración.
 Fuerza debida a la resistencia de la disolución: el medio ofrece resistencia al paso de

la sustancia
F´ = 6    r    
: constante
r: radio del ión
: viscosidad de la solución
: velocidad del ión
 Es decir, según esta fórmula, cuanto mayor sea el tamaño de la partícula
y mayor la viscosidad del medio, mayor resistencia.
La combinación de ambas fuerzas (que son opuestas) hace que el ión se desplace a través de
la disolución a una velocidad constante y alcance una determinada distancia. Esta velocidad
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dividida por la intensidad del campo eléctrico se conoce como MOVILIDAD ELECTROFORÉTICA
o MOVILIDAD MOLECULAR (): es un parámetro característico de cada molécula (para un
medio y un pH determinado > es decir, que podremos identificar una molécula observando
su desplazamiento electroforético.
La movilidad electroforética es:

 directamente proporcional a la carga eléctrica del ión
 inversamente proporcional a su tamaño y a la viscosidad de la solución en la que
discurre la electroforesis.
3.2. Cubeta
Cámara con dos compartimentos separados entre sí, que se rellenan con el tampón. Cada
uno de estos compartimentos contiene un electrodo (que queda sumergido en el tampón)
conectado a través de un cable a la fuente de alimentación.
Los tabiques de los compartimentos permiten montar un SOPORTE donde se colocan o
“siembran” las muestras. El soporte está embebido también en tampón y en contacto a cada
lado con el tampón de los compartimentos, de modo que se crea un circuito eléctrico cerrado:
la corriente eléctrica va desde uno de los electrodos atravesando el soporte hasta el otro
electrodo.
Como al aplicar electricidad, aumenta la temperatura del tampón, la cubeta dispone de una
tapa para minimizar la evaporación. Incluso en algunos casos lleva un sistema de refrigeración.
Son preferibles las cubetas de menor tamaño, ya que se disminuye la superficie de

evaporación y requieren menor cantidad de muestra.
3.3. Buffer o tampón:
BUFFER, TAMPÓN O DISOLUCIÓN AMORTIGUADORA: en general, es una mezcla de un ácido

(molécula o átomo que cede protones) y su base conjugada (molécula o átomo que capta
protones), por lo que tiene la propiedad de mantener estable el pH frente a la presencia de
cantidades limitadas de ácidos o bases fuertes.
HCl(aq) + H2O ↔ H3O+(aq) + Cl-(aq)
Ácido ↔ base
¿Por qué es imprescindible la presencia de un tampón en la electroforesis?

El pH del medio determina la carga neta que puede tener una molécula porque todas
presentan diferentes grupos que pueden ionizarse.
Por ejemplo, las proteínas presentan:
 GRUPO CARBOXILO (ÁCIDO DÉBIL): -COOH > -COO- + H+
 GRUPO AMINO: - NH2 + H+ > -NH3+
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A cada proteína (y a cada molécula) le caracteriza un PUNTO ISOELÉCTRICO (PI): pH al cual su

carga eléctrica neta es cero = el grupo carboxilo tendrá carga negativa y el amino, positiva.
 Si el pH del medio es inferior al punto isoeléctrico (por un exceso de protones en el

medio que provienen de las reacciones químicas que se están produciendo): el grupo
carboxilo (con carga negativa) captará esos protones para neutralizarse, quedando la
carga positiva del grupo amino > la carga eléctrica de la molécula será positiva y se
moverá hacia el cátodo.
 Si el pH del medio es superior al punto isoeléctrico (déficit de protones en el medio o

exceso de OH-): los grupos hidroxilo captarán los H+ del grupo amino para
neutralizarse, quedando la carga negativa del carboxilo > la carga eléctrica de la
molécula será negativa y se moverá hacia el ánodo.
Cuanto más cercano esté el pH del sistema al pI, más moléculas estarán en estado
neutro, por lo que menos se desplazarán > GRADO DE IONIZACIÓN de la muestra =
relación entre el número de moléculas ionizadas y no ionizadas.
Las sustancias ANFÓTERAS o ANFIPRÓTICAS son aquellas que pueden actuar tanto como
ácidos como bases, dependiendo del pH. Ej: aminoácidos, el agua…
Ejemplo del agua como sustancia anfótera:

 BASE (capta protones): H2O + HCl H3O+ + Cl-,
 ÁCIDO (cede protones) : H2O + NH3 NH4+ + OH-
En la electroforesis nos interesa que todas nuestras proteínas tengan una carga concreta
para que su migración sea la adecuada y, por tanto, nos sirva como prueba diagnóstica.
Por otro lado, los tampones están relacionados con la FUERZA IÓNICA del MEDIO (medida de
la concentración de iones de un medio y de las fuerzas de atracción y repulsión que hay
entre ellos). La diferencia de potencial que se aplique “se reparte” entre todos los iones
presentes y es lo que les “impulsa” a desplazarse. Cuantos más iones haya, más repartida
estará y, por tanto, menos se desplazarán. El tampón también está formado por iones, por lo
que la diferencia de potencial también se repartirá entre ellos. Cuanto mayor sea la
concentración del tampón (FUERZA IÓNICA DEL TAMPÓN), menor porcentaje de corriente
“será acarreada” por los iones de la muestra, y menos migrarán (cuando nuestro objetivo es
justo el contrario).
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Según todo esto, el tampón cumple una doble función:

 mantener el pH constante: con lo que proporciona una carga constante a las partículas
 transportar la corriente: cuando la concentración de tampón es superior a la requerida,
la migración de las sustancias presentes en la muestra es más lenta y peor la
separación conseguida.
3.4. El soporte
Es una porción plana de un material sobre la que se deposita la/s muestra/s a analizar y que
permite la migración y visualización de sus componentes, para lo cual debe estar sumergido en
solución tampón.
3.4.1. Los materiales más habituales son:

 papel o similares: queda sobre la superficie y avanza a lo largo de ella con escasa
fricción, por lo que el mecanismo principal de separación es la magnitud de la carga.
 “geles”, medios semisólidos o gelatinosos: están formados por polímeros que
forman una malla, matriz o red tridimensional a través de la cual deben avanzar las
moléculas de la muestra, quedando embebida en el medio de soporte electroforético,
Como consecuencia, la fricción es notable y el factor forma y tamaño adquiere una
alta relevancia en la separación.
Vamos a ver las características de cada uno por separado (en verde se destacan los más
usados):
a. Papel: sencillo y barato, pero elevada adsorción. Obsoleto en el laboratorio.
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b. Acetato de celulosa: bajo precio, fácil manejo y lectura, presenta una baja adsorción y una
mayor resolución. Es posible transparentarla (ya que es opaca) o disolverla con disolventes
orgánicos para detectar y recuperar las proteínas. Ej: Cellogel®
c. Almidón: la resolución es mayor que la que ofrecen los medios anteriores. El principal
inconveniente es la baja repetitividad de los resultados debido a la dificultad de preparar
los geles. Actualmente se utiliza poco, sustituido por la poliacrilamida.
d. Gel de agarosa:
- La agarosa es un polisacárido lineal formado por la repetición galactosas. Se extrae del

alga agar-agar (no tóxico).
- Preparación:
o se disuelve agarosa en polvo en un tampón acuoso mediante ebullición >
obtención de gel transparente líquido.
o Se vierte a molde y se deja enfriar a temperatura ambiente hasta que gelifica.
- El tamaño de poro depende de la concentración: a mayor concentración, los poros

son más pequeños. Habitualmente se utilizan concentraciones entre el 1 y el 3% >
poros grandes para separar moléculas grandes con un peso molecular de más de 200
kDa.
- La agarosa es muy frágil y las manipulaciones pueden destruirla con facilidad.
- Permiten una electroforesis rápida, pero con una resolución limitada (porque las
bandas que se forman en los geles tienen tendencia a ser difusas y a esparcirse),
debido al tamaño de los poros (aunque la resolución es mayor que la del papel o el
acetato de celulosa).
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- Uso en soportes horizontales.

- Principales aplicaciones: separación de fragmentos de ácidos nucleicos y proteínas
(PROTEINOGRAMA).
e.Gel de poliacrilamida (PAGE):

- Químicamente inerte, transparente y estable en amplios rangos de pH, temperatura y
fuerza iónica, resistente a agentes desnaturalizantes (detergentes, urea…)
- Es el gel que proporciona la mayor resolución electroforética porque se preparan de
manera que el tamaño de poro sea similar al de las proteínas > las proteínas se pueden
separar por su tamaño, pero, además, dos proteínas con el mismo tamaño se podrán
diferenciar por su carga.
- Preparación: polimerización de una mezcla de acrilamida con bisacrilamida, añadiendo
un activador. Ambos componentes determinan, en conjunto, las características físicas del gel
resultante: su resistencia mecánica, fragilidad, elasticidad, grado de reticulación (tamaño de
poro), etc.
- Inconvenientes: elaboración y manipulación complicadas, elevada toxicidad.
Los monómeros (acrilamida y bisacrilamida, ya sea en polvo o en disolución) son

neurotóxicos por absorción a través de la piel o por inhalación. Por ello, deben
manejarse en una campana extractora con guantes y mascarilla. Una vez realizada la
polimerización, la toxicidad se reduce al mínimo, pero es recomendable continuar
manipulando el gel con guantes, debido a la posible presencia de radicales libres.
3.4.2. Modos de disposición del soporte
a. Horizontal
 En papel: para aminoácidos u otras moléculas pequeñas
 En acetato de celulosa: para proteínas
 En gel de almidón o de agarosa: para proteínas y ácidos nucleicos. Casi siempre el
tampón cubre el gel para evitar que se seque por el calentamiento al paso de la
corriente), denominándose ELECTROFORESIS SUBMARINA.
La muestra se aplica depositándola (con pipeta o aplicador especifico) como una gota
sobre el soporte (papel, acetato de celulosa) o dentro de un “pocillo” creado en el gel
con un PEINE.
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Disposición horizontal del soporte
b. Vertical
Casi exclusivamente con gel de poliacrilamida (más resistente físicamente, no se

desliza), para proteínas o ácidos nucleicos.
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El gel puede rellenar tubos de vidrio (cada vez se usa menos) o estar contenido entre
dos placas rectangulares.
Igual que en el caso anterior:

 El contacto eléctrico se genera gracias al tampón que embebe el gel y llena las
cubetas o compartimentos del ánodo y cátodo.
 La muestra se deposita con micropipeta llenando un “pocillo” creado al polimerizar el
gel.
En cuanto a la composición del gel hay dos variantes:

 electroforesis continua: un tipo de gel
 electroforesis discontinua: dos tipos de gel
de composición ligeramente diferente,
dispuestos uno a continuación del otro. Esta
opción mejora la calidad de la separación.
Disposicicón vertical del soporte
RESUMEN DE LOS FACTORES QUE INFLUYEN EN LA ELECTROFORESIS
 Potencial del campo eléctrico: cuanto mayor sea, mayor movilidad, pero mayor
temperatura (incluso desnaturalización de las proteínas).
 Grado de ionización de las moléculas a separar: es el cociente entre la forma ionizada
y la no ionizada de una partícula en solución. A mayor grado de ionización, mayor es la
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carga neta.
 pH del medio: determina la carga neta de la molécula
 Fuerza iónica del medio: si la concentración de iones del medio es elevada, se
dificulta la separación electroforética.
 Tamaño y forma de las partículas a separar: en el caso de los soportes restrictivos.
 Soporte: tamaño de poro, resolución…
ETAPAS DEL PROCESO ELECTROFORÉTICO
En todos los casos, las etapas son:

 Preparación de la muestra
 Preparación del soporte
 Preparación del tampón
 Aplicación de la muestra
 Desarrollo de la electroforesis
 Revelado
 Lectura y evaluación
1) Preparación de la muestra:
Las muestras biológicas que pueden ser sometidas a electroforesis son cualquier
líquido biológico: suero, plasma, sangre total, orina, líquido cefalorraquídeo, etc.
La forma de preparar la muestra depende del tipo de muestra y el objetivo de la
electroforesis. En algunos basta con centrifugar la muestra (electroforesis de proteínas del
plasma o suero), en otros es necesario una concentración previa (electroforesis de muestras de
orina), o un proceso de extracción previa (electroforesis de ácidos nucleicos).
2) Preparación del soporte:

La elección del soporte depende de la naturaleza de la sustancia a separar.
Tipo de muestra a separar Soporte

Separación de proteínas plasmáticas Acetato de celulosa/agarosa/ electroforesis
capilar
Separación de ácidos nucleicos Agarosa
Estudios especiales e Investigación Poliacrilamida
Anteriormente ya hemos explicado cómo se prepara un gel de agarosa y de poliacrilamida.

Sólo cabe añadir que en el molde se introducen unos “peines” durante la polimerización (antes
de que solidifiquen), de manera que al quitarlos quedan unos pocillos en los que se situarán las
muestras.
3) Preparación del tampón

Existen tampones comerciales, pero también se preparan en el laboratorio, según fórmulas
establecidas.
Los tampones deben llenar por igual ambos compartimentos de la cubeta de modo que
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ambos extremos del soporte estén en contacto con el tampón durante toda la prueba.
El tampón utilizado durante la electroforesis se puede reutilizar un par de veces (si se
mantiene en refrigeración), pero suele contaminarse con facilidad.
4) Aplicación de la muestra:
Para la aplicación de la muestra en el soporte se puede aplicar las siguientes técnicas:
- Aplicación sobre la superficie del soporte: (por ejemplo, el suero se deposita sobre
la superficie de la tira de acetato de celulosa).
- Introducir la muestra en los pocillos de los geles: para asegurar que la muestra
queda dentro del pocillo y para visualizar el avance de la electroforesis.
Junto con la muestra problema es conveniente colocar un CONTROL POSITIVO (molécula

que se desplazará y que conocemos la posición a la que ha de llegar) Y CONTROL NEGATIVO
(no se ha de desplazar en las condiciones de la técnica, para comprobar que no hay otros
factores influyentes que no sean los de la electroforesis) con el fin de comprobar que todo el
proceso ha tenido lugar correctamente.
En la electroforesis de ácidos nucleicos se suele incorporar en uno de los pocillos un
MARCADOR DE PESOS MOLECULARES, es decir, un control que contiene diferentes fracciones
de ácidos nucleicos de pesos moleculares conocidos, que permiten identificar las fracciones
obtenidas de las muestras.
5) Proceso electroforético:
Una vez depositadas las muestras se cierra la tapa de la cubeta, se seleccionan los
PARÁMETROS ELECTROFORÉTICOS (voltaje, intensidad y tiempo) y se pone en marcha la
fuente de voltaje.
El resultado de la electroforesis es la formación de una serie de bandas correspondientes a
las fracciones separadas.
6) Revelado:
Este proceso permite visualizar las bandas obtenidas. Hay diferentes técnicas de
revelado:
3.4. Tinción de proteínas
Se pueden emplear
sustancias
coloreadas
(colorantes
inorgánicos que se
unen a las proteínas
de forma poco
selectiva) o
fluorescentes que se
unan a las proteínas
o los ácidos
nucleicos.
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Para la tinción de las proteínas tras la electroforesis, el gel se sumerge en un

recipiente con una disolución del colorante y se espera a que se impregne y así se
une a las moléculas separadas del gel. Tras lavar el gel para eliminar el exceso de
tinción no unida, se observa, fotografía o cuantifica por densitometría.
La tinción con plata es una alternativa a la tinción rutinaria de geles de proteínas (así
como de ácidos nucleicos y lipopolisacáridos) por su gran sensibilidad.
¡¡¡ATENCIÓN!!!
El BROMURO DE ETIDIO (BrEt) es una sustancia fluorescente muy usada como revelador
hasta hace poco tiempo. Se intercala entre las bases nitrogenadas de los ácidos nucleicos.
Absorbe luz ultravioleta de λ ≈ 300 nm, y emite una luz anaranjada de 590 nm, mediante la
cual se puede detectar la posición y cantidad relativa del ADN en el gel tras la electroforesis.
Tiene el inconveniente de su elevada toxicidad y poder cancerígeno, por lo que está siendo
sustituido por otras sustancias también fluorescentes como el SYBR Green.
3.5. Ensayo enzimático
Un enzima se puede detectar añadiendo sus sustratos (naturales o sintéticos) y

cofactores, de manera que lo que se cuantifica es el producto formado
(generalmente coloreado).
3.6. Autorradiografía
Tanto proteínas, como ácidos nucleicos pueden marcarse con isótopos radiactivos.
Procedimiento:
o Se marcan previamente a la electroforesis.
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o Se realiza la electroforesis.
o Se pone en contacto el soporte con una película radiográfica > la
radiactividad marcará las bandas.
o Se revela la película.
3.7. Inmunoensayo
Se trata de una prueba in vitro de detección de

ANTÍGENOS o de ANTICUERPOS en una muestra del
paciente, basándose en la especificidad de unión entre ellos
y la formación de INMUNOCOMPLEJOS (complejo de unión
antígeno-anticuerpo).
Los inmunoensayos no tienen por qué hacerse siempre
mediante electroforesis (por ejemplo, se hacen en placas de
microtitulación).
En el caso de la técnica mediante electroforesis, el gel

usado como soporte se fabrica añadiendo el anticuerpo concreto de la proteína que se
pretende detectar, de modo que quedan retenidos en él.
Después se añade la muestra del paciente y se lava.
- Si esas proteínas están en la muestra del paciente, los anticuerpos se unirán a ellas,
formando un precipitado = COMPLEJO ANTÍGENO-ANTICUERPO.
- Si no están las proteínas, en el lavado se elimina todo lo que no esté fijado al gel,
por lo que solo quedará el antígeno.
A continuación, se tiñe (con un colorante específico de los anticuerpos) y se lava el

exceso de tinción. Las bandas que aparezcan nos indicarán la presencia de esa proteína.
También se pueden poner de manifiesto con:

- sustancias fluorescentes que se observan con luz UV: FLUOROINMUNOANÁLISIS O
FPIA
- isótopos radiactivos = RADIOINMUNOENSAYO O RIA
- Con enzimas: ENZIMOINMUNOANÁLISIS O ELISA
En ocasiones, las proteínas que se buscan son anticuerpos (inmunoglobulina A, G y

M…) Por tanto, los anticuerpos que se usan para marcarlas reciben el nombre de ANTI-
ANTICUERPOS, y también serán específicos de estos.
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Los inmunoensayos se utilizan para:
 Medición de niveles de hormonas: por ejemplo la medición de niveles

de hormonas tiroideas o de estrógenos
 Medición de metabolitos en suero cuya cantidad o presencia son indicios de daño celular:
Por ejemplo la medición de marcadores biológicos miocárdicos como las troponinas
 Detección de virus: por ejemplo de los causantes de hepatitis y su individualización
 Detección del cáncer o de células tumorales: a través de sus proteínas o marcadores
tumorales, liberados en el suero de los pacientes.
 Detectar exposición a agentes infecciosos: por ejemplo de rubéola o toxoplasmosis en
mujeres embarazadas o en personas inmunosuprimidas.
 Detección de metabolitos indicadores de problemas fisiológicos, por su presencia o
cantidad excesiva, en la sangre : por ejemplo en caso de anemia se mide niveles
de ferritina.
 Medir niveles de medicamentos, drogas objeto de abuso y toxinas en sangre.
7) Lectura y evaluación:
En función de los resultados, la electroforesis puede ser:
- cualitativa (presencia o ausencia de bandas)
- cuantitativa (cantidad de sustancia que hay en cada una de las bandas obtenidas):
para conseguirlo se pueden usar varias técnicas:
a) FOTODENSITOMETRÍA: consiste en hacer pasar luz de una determinada

longitud de onda a través de las bandas obtenidas. Cuanto mayor sea la
cantidad de proteínas, más luz absorberá la banda y menos dejará pasar. Al
cuantificar la luz que llega al otro lado de la banda se puede extrapolar la
cantidad de proteínas. Los resultados se expresan en forma de gráfica, en la
que cada banda de proteína aparece representada por un pico:
o Altura: depende de la densidad de color
o Anchura: depende del ancho de la banda leída.
b) ESPECTROFOTOMETRÍA: Se recortan las bandas y se coloca cada una de ellas

en un tubo con una disolución que permita la extracción de la fracción a
determinar. A continuación, se mide la absorbancia de cada uno de los tubos
con un espectrofotómetro.
Cada proteína da una banda característica en condiciones normales (misma altura,
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anchura y posición). A su vez, hay determinadas patologías que dan un patrón

proteico concreto, de manera que su mera observación ya nos permite emitir el
diagnóstico.
Patrón normal
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ACTIVIDADES
1. Indica en qué propiedad física se basa la técnica de separación de sustancias por

filtración.
2. Cita los tipos de filtros de papel y la utilidad de cada uno de ellos.
3. ¿Qué condición deben cumplir los filtros para realizar una filtración esterilizante?
4. ¿Qué tipo de embudos se utilizan para realizar una filtración por vacío?
5. Realiza un esquema de los tipos de soportes restrictivos y no restrictivos utilizados
para electroforesis.
6. Describe los componentes de un equipo de electroforesis, indicando su función.
7. Indica los métodos para visualizar las bandas obtenidas tras la electroforesis.
8. ¿Qué utilidad tiene la fotodensitometría utilizada tras la separación electroforética?
9. Haz un cuadro comparativo entre la cromatografía y la electroforesis para que
comprendas bien en qué consiste cada una de ellas.
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Técnicas de separación: Filtración, Decantación y Cromatografía

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UD 6 SEPARACIÓN. TÉCNICAS.

| ESTELA GARCÍA ORDAZ

Característica diferenciadora Técnica de separación

FILTRACIÓN: método de separación basado en las diferencias de tamaño entre las

1) Filtros de papel: papel de celulosa especial, con un tamaño de poro variable. Se

1.1. El filtro liso (alemán): Este tipo de

Se elabora de la siguiente manera:

3) Filtros de vidrio molido o placas filtrantes.

3. MÉTODOS DE FILTRACIÓN LABORATORIALES

3.1. FILTRACIÓN POR GRAVEDAD

Se utiliza la fuerza gravitatoria para

- Se va vertiendo poco a poco la solución a filtrar teniendo la precaución de no

3.2. FILTRACIÓN POR VACÍO O PRESIÓN REDUCIDA.

El filtro se coloca en un embudo especial de vidrio o cerámica con el fondo

Existen sistemas de filtración al vacío de diferentes marcas comerciales.

El procedimiento de filtración al vacío consiste en los siguientes pasos:

- Se procede al filtrado: se vierte el líquido a filtrar en el embudo y se conecta la

3.3. SISTEMAS DE PRESIÓN POSITIVA

DECANTACIÓN: método de separación de los componentes de una mezcla heterogénea

mezcla durante el tiempo suficiente, el componente de mayor densidad queda abajo

- Vertido directo por inclinación del recipiente

- Aspirado de la fase superior con una pipeta Pasteur.

- Usando un EMBUDO DE DECANTACIÓN: para emulsiones.

Método basado en la diferente solubilidad de diferentes componentes de una mezcla.

La extracción por diferencias en la solubilidad es la base para la separación de los ácidos

CENTRIFUGACIÓN: método de separación de los componentes de una mezcla líquida (aunque

1) CENTRIFUGACIÓN DIFERENCIAL: las fases se separan en función de su velocidad de

2) CENTRIFUGACIÓN ZONAL: separación en función de la masa. Usado para la separación

3) CENTRIFUGACIÓN ISOPÍCNICA: por la densidad (masa/volumen, g/l). Por ejemplo, se

4) MÉTODO DE BARRERA: consiste en adicionar un medio con una densidad intermedia

Para pasar de uno a otro, se utiliza la siguiente fórmula:

Conversor on-line: http://insilico.ehu.es/mini_tools/rcf_rpm.php

Para caracterizar partículas en bioquímica se emplea otra magnitud relacionada: el

2.1. Concepto y tipos

En el mercado pueden encontrarse también algunos tipos de cabezales y rotores

Hay diferentes modelos de centrífugas, en función de sus componentes y de la aplicación

A. Centrífugas de baja velocidad, de

Las CENTRÍFUGAS MICRÓFUGAS son una

Centrífuga especial para microhematocrito.

B. Centrífugas de alta velocidad. Alcanzan velocidades de entre 18.000

2.2. Recipientes de muestras para centrifugado

b) Producto que se va a centrifugar:

c) Aceleración: No todos los materiales pueden soportar altas aceleraciones.

d) Temperatura de trabajo: hay materiales que resisten determinadas aceleraciones solo

2.3. Dispositivos de seguridad y mantenimiento

a) Sistemas de refrigeración: la rotación a alta aceleración produce un aumento del

b) Sistemas de vacío: Es imprescindible en las centrifugas de media y alta

e) Sistemas de bloqueo de la cámara de rotación: deben existir mecanismos de

f) Mantenimientos programados: es importante el mantenimiento de los equipos en

b) Compensar el tubo de muestra colocando en el receptáculo diametralmente opuesto otro

c) Cerrar herméticamente el compartimento del rotor.

d) Seleccionar la velocidad de centrifugación y el tiempo de centrifugado.

e) Poner en funcionamiento la centrífuga.

4. RIESGOS Y NORMAS DE SEGURIDAD

 La centrífuga ha de estar sobre una base sólida y fija.

2. CLASIFICACIÓN DE LAS TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS

Existen diferentes tipos de cromatografía en función del procedimiento operativo empleado.

a. Según el estado físico o naturaleza de las fases

NOMBRE TÉCNICA FASE MÓVIL FASE ESTACIONARIA OBSERVACIONES

b. Según la disposición del soporte cromatográfico

 Cromatografía en papel: fase estacionaria = papel de filtro.

c. Según mecanismo físico-químico de separación o tipo de interacción entre