Etapas:

1. cuantificacion del adn: espectofotometria, adn absorbe

2. pureza del adn 260/280 (longitud de onda)
3. efecto hipercromico 260
4.denaturalizacion: pH alcalino
5.efecto hipercromico por degradacion de adn con nueclasas de veneno
6. acitivad de la nucleasa con sustrato sinteico

ESPECTROSCOPIA:
*cuantificar el adn, para hallar y relacionar con la concentracion
y a la vez hallar la calidad, puro o no
*todas las moleculas tiene capacidad de absorcion, maxima en luz UV ADN
*libera energia debido a que electrones vienen del fotón
*UV 100 400nm
*Cromóforo: moleculas con capacidad de absorcion de luz
contienen anillos aromaticos y enlaces dobles conjugados
le permiten absorción: b caroteno, fenol, bases nitrogenadas,aa aromáticos
*las moleculas absorben en el rango 180 400 nm (UV)

LEY DE LAMBERT-BEER:
*A=Elc
A=absorbancia; E: coeficiente de absorcion molar (1/Mcm)
l: longitud del paso óptico (cm); c= concentración de la solucion (moles/litro)
E es característico de una sustancia
ESPECTRO DE ABSORCION DE NUCLEOTIDOS
*se trataba calcular el pico máximo de absorción
*abosrben las bases nitrogenadas, bases puricas (A) son los picos mas altos
*pirimidinicas, el uracilo tiene mayor pico de absorción
*por lo tanto ARN absorbe más todo a 260 nm

1.ESPECTRO DE ABSORCION DE ADN Y PROTEINAS:

*va de 240 a 320 nm, existen diferentes puntos, para calcular le pico máximo
*ADN con buen método de extracción es a 260nm la absorción
*en proteinas el pico más alto es 280 nm (aa aromaticos: triptofano y tirosina)
*pro: inician 230 el pico, se leen los enlaces peptidicos porque tiene enlace
doble
*pureza del ADN A260/A280
*cómo se relaciona: A=Elc
se despeja E=A/lc o c=A/El .......... l= 1 cm
E= A1/c1=A2/c2
Adn en estado nativo en estado duplex de doble cadena (dsDNA)

1.0 (una unidad de absorbancia)A260=50ug/ml dsDNA

1.0 (una unidad de absorbancia)A260=33ug/ml ssDNA
1.0 (una unidad de absorbancia)A260=40ug/ml RNA

c(muestra problema)=Amp x 50ug/ml x factor dilución

*no se utiliza muy concentrada el ADN, se diluye probando

2. DETERMINACION DE LA PUREZA DEL ADN: RELACION A260/A280

*A260/A280<1.8 entonces ADN contaminado con proteinas

*A260/A280 = 1.8 - 1.9 (2)entonces ADN puro

*A260/A280 > 1.9 entonces ADN contaminado con RNA

*(1.55xA260) - (0.76xA280) = mg/ml Proteina (cuánto de proteina ha

contaminado)
 decidir qué método de purificación del ADN por la cantidad de proteina
contaminante

una absorcion a 230 nm significa contaminación con carbohidratos, peptidos,

fenoles
compuestos aromticos u otras sustancias (en muestras ambientales, los suelos
tienen mucho fenol
y compuestos aromaticos; el pellet es oscuro, es ADN con contaminantes)
entonces lecturas altas a 230nm
y se decide qué metodo se utiliza (A260/A230= 2.2 aprox es normal, si sale
más es contaminante)

3.EFECTO HIPERCRÓMICO: MAYOR A260

*Se espera tener un ADN nativo, pero a veces se desnaturaliza
*Se induce para que se denaturalice, rompa pte H y forme cadenas de una sola hebra
*La molecula ADN absorbe a 260, en estado nativo las BN no están expuestas, la
absorcion será menos
en ADN denaturalizado expone las BN e incrementa la absorbancia
*Temperatura de Melting (Tm): donde la mitad del ADN es nativo y la otra es de
hebra simple
depende de los enlaces G y C tienen triple enlace, depende entonce de eso

NUCLEASAS: Enzimas fosfodiesterasas, cortan el enlace fosfodiester

hay de 2 tipos:exonucleasas cortan de 3' a 5', pero pueden cortar de 3'a 5'
*Algunas endonucleasas (reconocen la secuencia y hacen el corte) son de
restriccion, con corte específico para transferencia de genes, pej

USO DEL SUSTRATO bis-P-nff es cromogénico, se lee porque se produce una actividad
en este sustrato
*no tiene color, pero con actividad alcalina se ve el producto amarillo
(paranitrofenol)
y a través de esto se utiliza la actividad de la enzima

VIDEOS: CONTAMINANTES:
*fenol: por el anillo aromatico y el doble enlace es absorbido y medido (pico
270nm)

SI EL INCREMENTO A260 ES > O IGUAL 30%, entonces el ADN se encuentra estado nativo
si es A260<30%, el ADN es denaturado o persiste ARN en la solucion

EJERCICIOS:

1.