Capítulo 3

CROMATOGRAFÍA
Cromatografía: es un método que en sus inicios se utilizó para separar sustancias
coloreadas. A principios del siglo XX, el botánico ruso Mikhail Tswett separó
mediante Cromatografía en columna pigmentos vegetales (clorofilas y xantofilas).
Actualmente, agrupa un conjunto importante y diverso de métodos que permite
separar componentes estrechamente relacionados en mezclas complejas (gases,
líquidos o sólidos en disolución). Es una técnica en la que una mezcla química
(líquida o gaseosa) se separa en sus componentes como resultado de su distribución
diferencial entre dos fases inmiscibles, una fija o estacionaria y otra móvil.
 MATERIA
SUSTANCIAS PURAS MEZCLAS

 Composición química definida y fija  Combinación de dos o más sustancias

 Presentan propiedades físicas y químicas
constantes
 No pueden separarse por métodos físicos
 Presentan temperatura constante durante
el cambio de estado
 Composición química variable
 Presentan propiedades físicas y químicas variables
 Sus componentes puede separarse por métodos
físicos
 Se presenta temperatura variable durante el cambio
de estado

ELEMENTOS COMPUESTOS HOMOGÉNEAS HETEROGÉNEAS

 Sustancias puras  Combinación de 2 ó  Presentan una sola fase  Presentan diversas fases
simples (igual Z) más elementos en  Su composición física y  Sus propiedades dependes de
proporciones finas de
 Poseen propiedades química es constante los propiedades individuales
masa
definidas  Tienen propiedades distintas a de las fases
 Presentan propiedades la de los componentes
Ejs.: O2, Cl2, Fe, Cu, Al Ejs.: Rocas, Suspensiones,
específicas individuales Emulsiones
Ejs.: NaCl, CaCO3, H2O,
Ejs.: Aire, Agua de manantial,
Minerales
Combustible SUSPENSIONES EMULSIONES
Nubes Pinturas
SOLUCIONES Smog, Lodo Leche
Sólidas, Líquidas y Gaseosas Agua turbia Aderezo
 En las separaciones cromatográficas la muestra se disuelve en una fase móvil (gas,
líquido o fluido supercrítico).
 Con ayuda de esta fase móvil, se hace pasar la muestra a través de una fase estacionaria
inmiscible, que se mantiene fija a una columna o a una superficie sólida.
 Las fases se eligen tomando en cuenta que los componentes de la muestra se distribuyan
de manera distinta entre la fase móvil y la fase estacionaria (repartos).
 El reparto entre las fases aprovecha las diferencias entre las propiedades físicas y/o
químicas de los componentes de la muestra.
 Los componentes que son fuertemente retenidos por la fase estacionaria, se mueven
lentamente con el flujo de la fase móvil.
 Los componentes que se unen débilmente a la fase estacionaria, se moverán con rapidez
en la fase móvil.
 Debido a la diferencia en movilidad, los componentes de la muestra se separarán en
bandas o zonas discretas que pueden analizarse de forma cualitativa y/o cuantitativa,
considerando los tiempos de salida (elución) después de pasar la fase estacionaria.
Los métodos cromatográficos se clasifican de dos maneras:
1) Con base en la forma en que las fases estacionaria y móvil se
ponen en contacto.
2) Con base en el tipo de fase móvil y estacionaria, y en la clase de
equilibrios implicados en la transferencia de los solutos entre las
fases.
1.1. Cromatografía en columna: la fase estacionaria se coloca en
un tubo estrecho, a través de la cual se hace pasar la fase móvil
por medio de presión.
1.2. Cromatografía en capa (plana): La fase estacionaria se fija
sobre una placa o en los intersticios de un papel. La fase móvil se
desplaza a través de la fase estacionaria por capilaridad o por
gravedad.
2.1. Cromatografía de líquidos (HPLC): la fase móvil es un
líquido que fluye a través de una columna que contiene a la fase
fija. La separación cromatográfica es el resultado de las
interacciones específicas entre las moléculas de la muestra en
ambas fases (móvil y estacionaria).
La cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC, high-
performance liquid chromatography) no está limitada por la
volatilidad o la estabilidad térmica de la muestra.
La HPLC es capaz de separar macromoléculas y especies iónicas,
productos naturales lábiles, materiales poliméricos y una gran
variedad de otros grupos polifuncionales de alto peso molecular.
La HPLC ofrece una mayor variedad de fases estacionarias, lo que
permite una mayor gama de estas interacciones selectivas y más
posibilidades para la separación.
APLICACIONES:
• Fármacos: Antibióticos, sedantes esteroides, analgésicos
• Bioquímica: Aminoácidos, proteínas, carbohidratos, lípidos
• Productos de alimentación: Edulcorantes artificiales,
antioxidantes, aflatoxinas, aditivos
• Productos de la industria química: Aromáticos condensados,
tensoactivos, propulsores, colorantes
• Contaminantes: fenoles, pesticidas, herbicidas, PCB
• Química forense: Drogas, venenos, alcohol en sangre,
narcóticos
• Medicina clínica: Ácidos biliares, metabolitos de drogas,
extractos de orina, estrógenos
• Separación de elementos de las tierras raras (REE) en muestras
geológicas.
2.2. Cromatografía de gases: En cromatografía de gases la muestra se
volatiliza y se inyecta en la cabeza de una columna cromatográfica. La
elución se produce por el flujo de una fase móvil que es un gas inerte, y a
diferencia de la mayoría de los tipos de cromatografía, la fase móvil no
interacciona con las moléculas del analito; su única función es la de
transportar el analito a través de la columna.
La cromatografía de gases tiene la ventaja de disponer de detectores
mucho más universales (p. ej. el de ionización de llama). Además, para
numerosas aplicaciones, los métodos son más simples, más rápidos y más
sensibles que los correspondientes a la HPLC. La instrumentación
requerida para cromatografía de gases también es mucho más sencilla y
económica que la de HPLC.
En cromatografía de gases, la temperatura influye considerablemente
sobre la distribución del equilibrio, por lo que presenta limitaciones en 3
casos:
…
 Compuestos poco volátiles, generalmente los de peso molecular
superior a 300 u.m.a.
 Compuestos sensibles a una elevación moderada de la
temperatura (determinados compuestos de interés biológico).
 Compuestos que se encuentran en forma iónica (poco volátiles).

Por estas razones la cromatografía de gases se usa cuando los

componentes de la mezcla problema son volátiles o semivolátiles y
térmicamente estables a temperaturas de hasta 350–400ºC.
Cuando los compuestos a analizar son poco volátiles y/o
termolábiles, la técnica de separación adecuada es HPLC.

Normalmente la cromatografía de gases se utiliza para confirmar de

la presencia o ausencia de un compuesto en una muestra
determinada. 07102019 702
APLICACIONES:
 Medioambientales: Análisis de pesticidas y
herbicidas, análisis de hidrocarburos, semivolátiles y
volátiles, análisis del aire...
 Alimentos y aromas: fragancias y aromas, aceites, bebidas,
ácidos orgánicos, azúcares, FAMES, ésteres metílicos,
triglicéridos, alcoholes...
 Química Industrial: alcoholes, ácidos orgánicos,
aminas,aldehídos y cetonas, ésteres y glicoles, hidrocarburos,
disolventes, anilinas, gases inorgánicos...
 Biociencia: drogas, fármacos, alcoholes y contaminantes en
sangre, disolventes residuales...
 Derivadas del petróleo: gas natural, gases permanentes, gas
derefinería, gasolinas, gasóleos, parafinas, etc.
2.3. Cromatografía de fluidos supercríticos (SFC): Técnica
híbrida entre HPLC y cromatografía de gases (GC).
Temperatura crítica (TC): Es la T por encima de la cual una
sustancia no puede existir en fase líquida.
Presión crítica (PC): es la presión de vapor de una sustancia a su TC.
Fluido supercrítico (SF): es una sustancia a T y P por encima de su
TC y PC (punto crítico).
Los SF tienen propiedades intermedias (densidad, viscosidad, etc.)
entre las características de dicha sustancia en estado gaseoso y en
estado líquido.
SFC es importante porque permite la separación de mezclas en las
que no es adecuada la aplicación de la GC ni de la HPLC.
Se aplica a compuestos no volátiles o térmicamente inestables que
no pueden ser separados mediante GC, o aquellos que contienen
grupos funcionales que imposibilitan su detección en HPLC.
Comparación de Propiedades de SF con sus respectivos gases y líquidos:
Propiedad Gas Fluido supercrítico Líquido
Densidad (g/cm3) (0.6–2) x 10-3 0.2–0.5 0.6–2.0
Coeficiente de difusión (cm2/s) (1.0–4.0) x 10-1 10-3–10-4 (0.2–2)–10-5
Viscosidad (g.cm-1s-1) (1.0–3.0) x 10-4 (1–3)–10-4 (0.2–3)–10-2

Propiedades de algunos Fluidos Supercríticos:

Fluido TC (ºC) PC (Atm) Densidad en Punto Densidad a 400 Atm

Crítico (g/ml) (g/ml)
CO2 31.3 72.9 0.47 0.96
N2O 36.5 71.7 0.45 0.94
NH3 132.5 112.5 0.24 0.40
n– 152.0 37.5 0.23 0.50
Butano
Debido a las características de la fase móvil (alta presión y temperatura)
se utilizan equipos parecidos a los de HPLC, con varias diferencias:
 El empleo de un horno termostático para poder controlar con precisión
la temperatura de la fase móvil.
 El uso de un restrictor, empleado para poder mantener por una parte la
presión en el interior de la columna y por otra parte permitir la bajada
de la presión a la salida para que el fluido supercrítico (SF en
adelante) pase al estado gaseoso y pueda ser detectado adecuadamente
el analito.
Restrictor: tubo capilar entre 2 a 10 cm de longitud y un diámetro interno
menor al de la columna (1/10 del diámetro), donde a la salida el SF
expande y pasa al estado gaseoso y se puede mantener simultáneamente
la presión en el interior de la columna.
En SFC no se aumenta la velocidad de elución modificando la
temperatura, sino la presión del SF. Al aumentar la densidad se tiene
mayor interacción analito–fase móvil y disminuye los tiempos de
elución. Al principio se maneja una etapa isobárica y luego se aumenta la
presión lineal o asintóticamente hasta el final de la elución.
Igual que en GC se pueden usar las columnas capilares o de relleno, de
preferencia las primeras. Las dimensiones son parecidas en longitud, de 10 a
20 m, y el diámetro interno es bastante menor, de 0,05 a 0,10 mm. La
película interna es de siloxano entrelazado y polimerizado. Si se utilizan
columnas de relleno, su diámetro interno varía entre 0,5 y 4,6 mm, y el
grosor de la partícula de relleno es de 3 a 10 μm. En este caso, el
recubrimiento es parecido al usado en HPLC de reparto.
La fase móvil típica es el CO2, por sus excelentes propiedades:
 Apolar (disuelve una gran variedad de moléculas orgánicas grandes).
 Densidad elevada (0.5 g/ml)
Transparente a la radiación ultravioleta
 Inodoro
 No tóxico
 Fácil de obtener
 Barato
 No inflamable
 Fácil de separar el analito por evaporación del SF a temp. ambiente
El CO2 tiene la ventaja de que se puede obtener fácilmente como
fluido supercrítico. Su temperatura crítica es de 31ºC y la presión
crítica de 72.9 atm, condiciones por debajo de las que se usan en
HPLC.

Otras fases móviles probadas y utilizadas son:

 Etano
 Pentano
 Dietiléter
 Amoníaco
 Tetrahidrofurano
 Diclorofluorometano
 Óxido nitroso
APLICACIONES:
 Se utiliza frecuentemente para analizar bajas concentraciones
de compuestos y moléculas con pesos moleculares elevados,
tales como aquellos que tienen una buena cantidad de átomos
de carbono (hidrocarburos).
 Se utiliza habitualmente para el análisis de medicamentos ,
alimentos, explosivos, petróleo, polímeros y propelentes.
 Se usa para preparar el café descafeinado y para extraer la
nicotina del tabaco.
Elución: implica el transporte de una especie a través de una columna por la
adición continua de nueva fase móvil.

Durante el proceso de separación

ocurre una importante dilución del
analito en relación con la
concentración de la mezcla
agregada. Por lo tanto, se requiere
de detectores más sensibles que lo
sque se usarían para una medición
que no requiera separación alguna.

A. Cualitativo
A. Cuantitativo

a) Diagrama que muestra la separación de una mezcla de A y B por

cromatografía de elución en columna
b) Señal de salida del detector en las dos fases de elución indicadas en a)
Efecto de velocidad de migración y del ensanchamiento de la banda
sobre la resolución

Perfiles de concentración de las

bandas de los analitos A y B en dos
diferentes tiempos de migración a
través de una columna
cromatográfica.
El ensanchamiento disminuye la
eficacia de la columna
Cromatograma para dos componentes que marca los métodos para mejorar la
separación:
a) Picos solapados de los analitos A y B
b) Aumento en la separación de las bandas
c) Disminución de la anchura (dispersión) de las bandas
Velocidades de migración de los solutos

La eficacia de una columna cromatográfica para separar 2 solutos depende de:

1) Las velocidades relativas con las que eluyen las 2 especies
2) Las velocidades están determinadas por la magnitud de las constantes de
equilibrio de las especies respecto a las fases estacionaria y móvil (costantes de
distribución)

Constantes de distribución:

Transferencia del analito A entre las fases móvil y estacionaria:

Amóvil Aestacionaria
Kequilibrio = Kdistribución
Kdistribución = CS / CM
CS: concentración molar del soluto en la fase estacionaria
CM: concentración molar del soluto en la fase móvil
Kdistribución es constante en un amplio intervalo de concentraciones del soluto
teniendo que CS es directamente proporcional a CM (cromatografía lineal) y se
tienen picos gaussianos simétricos característicos y los tiempos de retención
son independientes de la cantidad del analito inyectado.

Tiempo de retención

El tiempo transcurrido después de la inyección de la muestra hasta que el pico de

concentración del analito (único soluto) alcanza el detector se denomina tg.
El pico pequeño de la izquierda corresponde a una especie que no es retenida por la
columna, cuyo tiempo tM para alcanzar el detector se denomina por lo general
tiempo muerto. La vel. Promedio de esta especie coincide con la vel. Pormedio del
movimiento de las moléculas de la fse móvil.
Solid Phase Extraction
En muchos casos la identificación de compuesto puede hacerse
aislando el pico durante la obtención del cromatograma y
analizándolo por un método complementario.
La espectrometría de masas se ha acoplado con éxito a la
cromatografía tanto de gases como líquida. La información que se
puede obtener incluye el peso molecular y la fórmula empírica,
información estructural y confirmación de la estructura.

En cromatografía en columna la señal analógica generada por el

detector se registra en la forma familiar de los picos cromatográficos.
El área bajo estos picos puede integrarse en una variedad de maneras
y los datos resultantes relacionarse con la composición de muestras
desconocidas.
 Los sistemas de datos basados en computadoras en línea
permiten una automatización completa.
 Incluyen la adquisición y reducción de datos en forma
automática y la impresión de los resultados analíticos.
 La señal cromatográfica, inicialmente analógica, se digitaliza
por medio de un convertidor digito-analógico.
 Con programas se puede detectar la presencia de picos, hacer
correcciones por la desviación de la línea de base, calcular áreas y
tiempos de retención, determinar la concentración de los
componentes utilizando factores de calibración almacenados y
generar un informe completo del análisis.
 Las cuentas del área del pico se acumulan cuando la señal
abandona la línea base. El alejamiento de la línea base se
detemina por medición de la pendiente de la señal.
 El tiempo de retención y las alturas de la señal en el máximo de
cada pico se detectan con un programa almacenado en la
memoria.
 El final del pico de un componente se establece cuando la señal
regresa a la línea base.
 Durante cromatogramas isotérmicos los programas pueden
aumentar automáticamente con el tiempo la sensibilidad a la
pendiente.
Los tres métodos principales de evaluación son:
 1) Normalizaciones del área
 2) Calibración con patrones o estándar
 3) Patrón interno. Cada uno tiene su lugar,
dependiendo de la naturaleza del análisis.
 Si se sabe que el cromatograma representa la muestra
completa, que todos los componentes se han separado y que
cada pico se ha resuelto completamente; se puede utilizar la
normalización de las áreas para la evaluación.
 Para utilizar este método, se mide el área bajo cada pico
individual. Sumando todas estas áreas de los picos se obtiene
el área total calculada.
 El porcentaje en volumen de los componentes individuales se
obtiene multiplicando el área calculada individual por 100 y
luego dividiéndola entre el área total calculada.
 El método sólo es válido si el factor de respuesta de todos los
componentes es el mismo, es decir iguales cantidades de
distintos componentes dan la misma área.
• Si se conoce el volumen de la muestra se utiliza la calibración con
estándares o patrones.
• Con ello, la ventaja es que sólo se necesita medir las áreas de los picos
de interés.
• Como requisito, cada vez se debe inyectar la misma cantidad de
muestra.
• Los estándares necesarios deben analizarse bajo las mismas condiciones
de operación que la muestra.
• En la práctica, se preparan las soluciones estándar de los componentes
de interés y se inyectan en el cromatógrafo.
• Para cada componente se obtiene la gráfica: área del pico en función de
cantidad de componente.
• Para el cálculo de una concentración desconocida, se obtiene el
cromatograma de la muestra.
 Este método permite que varíen las condiciones de
operación entre muestra y muestra y no requiere de
repetibilidad en las inyecciones.
 El patrón interno debe ser un compuesto que pueda
resolverse completamente de los picos adyacentes, que
no esté presente en la muestra problema y que no
produzca ningún efecto interferente.
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