PRÁCTICA 2.

Extraer de 5-10 mL de sangre total con Vacutainer® en

un tubo con EDTA al 10% como anticoagulante

Centrifugar a 1500 rpm por 15 minutos a temperatura ambiente.

Con ayuda de una pipeta Pasteur obtener la capa de leucocitos
de la interfase

y colocarla
Agregar 800 en un
µL de buffer detubo
lisis 1cónico defuertemente
y agitar 1.5 mL. en el
vórtex hasta disgregar el botón o resuspender con pipeta.

Centrifugar a 3000 rpm por 5 minutos a 4°C y

decantar el sobrenadante dejando únicamente
el botón en el fondo del tubo.

Repetir los pasos 4 y 5 dos veces más hasta

que se obtenga un botón

blanquecino y un sobrenadante
Resuspender el botón en 400 µL del buffer de lisis 2 y agitar
transparente.
ligeramente en elvórtex para despegar el botón.. Añadir
primero 20 µL de SDS al 10%.
Posteriormente agregar 110 µL perclorato de sodio 5M y
mezclar en el agitador por 10 minutos a 4°C. Agregar 200 µl
NaCl 5M y agitar vigorosamente en vórtex.

Centrifugar por 5 minutos a 12000 rpm a 4°C y pasar 700 µL de

sobrenadante a un tubo de 1.5 mL. Añadir al sobrenadante un volumen
igual de isopropanol frío y agitar ligeramente por inversión (observar
una hebra blanquecina de DNA).

Centrifugar por 5 minutos a 12000 rpm a 4°C y decantar el

isopropanol dejando solo en el tubo el botón de DNA.Agregar
350 μL de etanol frio al 70% y agitar suavemente

Centrifugar por 5 minutos a 12000 rpm a 4°C y eliminar el etanol

(decantando o utilizando la micropipeta) dejando únicamente el
botón de DNA en el tubo. Repetir los pasos 2 y 3 una o dos veces
más.

Dejar secar el botón 5-10 min a 37

ºC. Añadir 30 - 50 μL de H2O estéril
(previamente calentada a 37ºC)

FIN
Material de extracción de sangre:

-Aguja del vacutainer: Contenedor de Objetos Punzo-cortantes

-Material con sangre: BOLSA ROJA: Desechos biológicos

Buffer de Lisis 1: Los residuos generados se colectan en un contenedor. Ninguno

de sus componentes es nocivo para el ambiente a las concentraciones
empleadas puede desecharse en alcantarilla, previa neutralización a pH= 7.

Buffer de Lisis 2: Se colectan los residuos en un contenedor, se neutralizan a pH= 7

y se vierten en la alcantarilla.

Mezcla SDS, Perclorato de sodio e Isopropanol: Colectar en un contenedor para

su posterior disposición.

Etanol: Puede verterse en el desagüe.

Material de plástico (tubos, puntas): Se colectan en un frasco con hipoclorito de

sodio al 2%, se enjuagan con agua corriente y se depositan en el contenedor de

desechos sólidos (BOLSA NEGRA).