INTRODUCCION:

Las plantas poseen fotosistemas para procesar tanto la luz como fuente de energía, como
fuente de información, los cuales constan de 3 partes:
 Recepción: consiste en la absorción de longitudes de onda específicas por un
fotorreceptor específico el cual se modifica fotoquímicamente.
 Transducción: es la acción primaria del fotorreceptor, donde la energía radiante se
transforma en una forma bioquímica de energía relativamente estable: aquí se da
una amplificación de la señal transformada.
 Respuesta: modulación del metabolismo da como resultado un evento que es
observable a nivel fisiológico.
Los organismos fotosintéticos contienen pigmentos capaces de absorber la radiación visible
e iniciar las reacciones bioquímicas de la fotosíntesis, como los pigmentos fotosintéticos
que absorben u captan la energía luminosa en la “fase luminosa” iniciándose las reacciones
fotoquímicas de la fotosíntesis mediante los complejos antena que permiten captar la
energía y transferirla a los centros de reacción del fotosistema I (clorofila que absorbe a 700
nm) y el fotosistema II (clorofila que absorbe a 680 nm), dentro de estos pigmentos
fotosintéticos tenemos a las clorofilas, carotenoides y ficobiliproteinas que son insolubles
en agua y solubles en solventes orgánicos (excepto las ficobiliproteínas), también tenemos
a los pigmentos no fotosintéticos que también absorben luz pero no participan en la
fotosíntesis sino que dan color a algunas partes de la planta para atraer a los insectos y
protección a daños por luz UV, como los pigmentos antocianicos, los cuales son solubles en
agua.
En el proceso de fotosíntesis en plantas superiores, existe un transporte de electrones desde
el agua hasta el NADP+ y está ligado con la producción de O2 y la formación de ATP. La
energía necesaria para este proceso es proporcionada por dos fotoactos que actúan
secuencialmente sobre el mismo electrón, que es conducido del primer centro captador de
la luz (fotosistema II) al segundo (fotosistema I) por una cadena transportadora de
electrones en la que se encuentran varios citocromos ordenados secuencialmente, en lo que
se denomina esquema Z.
En 1937, R. Hill descubrió que cuando una suspensión de cloroplastos aislados, o
fragmentos de cloroplastos, se iluminan en presencia de un aceptor de electrones
adecuados, éste es reducido al mismo tiempo que se libera O2 , derivándose los electrones
de la cadena transportadora. Esta es la denominada reacción de Hill, y como aceptores de
electrones (los denominados oxidantes de Hill ) pueden utilizarse diversas sustancias, como
son complejos de iones férricos, benzoquinona y algunos colorantes, como los derivados
del indofenol. La estequiometría de la reacción de Hill cuando se utiliza ferricianuro como
aceptor de electrones es:
Luz
4 Fe+3 + 2 H2O -------------------> 4 Fe+2 + 4 H+ + O2 Cloroplastos
y en general:
2 [A] + 2 H2O --------------------> 2 [AH] + 2 H+ + O2
En 1950, Ochoa y Vishniac encontraron que el NADP+ podía actuar como reactivo de Hill
(aceptor de electrones [A]), según la reacción: Luz
2 NADP+ + 2 H2O --------------> 2 NADPH + 2 H+ + O2
Conocido el papel del NADPH en muchos procesos biosintéticos, parecía probable que el
NADPH fuese el reductor que, formado en la fase luminosa de la fotosíntesis, se utilizase
en la fase oscura para la reducción del CO2 a carbohidratos, con la regeneración del
NADP+ que de nuevo sería reducido en el proceso luminoso. El par NADP+ / NADPH
actuaría, pues como una coenzima entre los dos procesos, luminoso y oscuro.
El objetivo del trabajo práctico es demostrar experimentalmente el proceso de
óxidoreducción (Reacción de Hill) de la fotosíntesis, utilizando como aceptor de electrones
[A], un indicador de óxido-reducción (2,6 diclorofenol indofenol) que permitirá visualizar
la aceptación de protones por el cambio de color. En estado oxidado: azul, reducido:
incoloro.

OBJETIVOS:
 Realizar la extracción y separación de pigmentos a partir de diferentes fuentes de
organismos fotosintéticos.
 Demostrar la transferencia de electrones en cloroplastos aislados.

METODOLOGIA:
Separación de pigmentos fotosintéticos:
1. Quitar el peciolo y la nervadura principal a una hoja pequeña de espinaca.
2. Cortar los restos foliares en pequeños pedazos y colocarlos en el fondo de un tubo
de ensaye con 1 mL de acetona.
3. Macerar cuidadosamente con un agitador.
4. Tomar una alícuota del extracto con un capilar y aplicar 10 gotas de una en una en
un cromatograma de papel, previamente marcado a 0.5 cm del borde mas angosto,
secar levemente después de cada aplicación
5. Desarrollar el cromatograma en un frascoc cerrado con una mezcla de éter de
petróleo-benceno 9:1. Retirar el cromatograma y observar la separación de los
pigmentos.
6. Dibujar el cromatograma resultante e identificar los pigmentos separados.
Separación de pigmentos fotosintéticos y no fotosintéticos:
1. Cortar en trozos pequeños una hoja de Zebrina pendula
2. Colocarlos en un frasco, macerar con agitador y agregar 3 mL de acetona.
3. Decantar en un tubo de ensaye 15 mL y agregar 3 Ml de éter de petróleo.
4. Mezclar suavemente y dejar reposar 2 min. Agregar 1 mL de agua destilada.
5. Dejar reposar hasta que se separen las dos fases (orgánica y acuosa)
6. Dibujar un esquema de lo observado.
Obtención de cloroplastos:
1. Cortar en pedazos de 0-1 cm, 25 g de hijas frescas de espinacas y colocarlas en un
mortero frio, adicionar 50 mL de regulador para aislamiento frio (Tris- HCl 40 mM,
NaCl 0.35 M, pH = 8.0) y un poco de arena.
2. Moler rápidamente y filtrar el homogenizado a través de cuatro capas de gasas
3. Centrifugar filtrado a 1,000 rpm durante 4 min.
4. Desechar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 2 mL de NaCl 0.35 M,
guardar la suspensión de cloroplastos en tubos forrados con papel aluminio y en el
frio.
Reacción de Hill:
1. Cada equipo realizará el experimento de acuerdo a la siguiente tabla:
Tub Regulador de DCPIP Suspensión de Condición experimental
o fosfatos (mL) (mL) cloroplastos (mL)
1 5.0 3.0 0.1 Luz
2 5.0 3.0 0.1 Oscuridad
3 5.0 3.0 0.1 Oscuridad final
4 5.0 3.0 0.1 Ebullición (testigo -)
5 5.0 3.0 0.0 Testigo (reactivos)
6 5.0 0.0 0.1 Testigo (+)

2. El tubo 4 se prepara aplicando cloroplastos frescos a un tubo de reactivos que ya

estén en ebullición.
3. Inmediatamente después de colocar todas las soluciones para el ensayo, observando
contra una superficie de color blanco, calificar el color de los tubos de – a ++++.
4. Realizar observaciones de los tubos sometidos a los tratamientos 1, 2, 3, 4, y 5 cada
3 minutos, el tubo 3 solamente será destapado al final para observarlo y registrar los
datos en una tabla.
RESULTADOS:
Separación de pigmentos fotosintéticos:

Rf=0.96

Rf=0.96

Rf=0.52

Rf=0.2
Rf=0.24

Rf=0.08

Figura 1. Cromatografía en papel de los pigmentos fotosintéticos extraídos de una hoja de espinaca usando
como disolvente acetona, y como fase móvil éter de petróleo-benceno 9:1.
Separación de pigmentos fotosintéticos y no fotosintéticos:

Figura 2. Separación de pigmentos fotosintéticos y no fotosintéticos presentes en una hoja de Zebrina pendula.

Reacción de Hill:
Tabla 1. Disminución de color del diclorofenol indofenol (DCFIF) de la reacción de
Hill en diferentes condiciones
Tiempo Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6
(min) (-/+) (-/+) (-/+) (-/+) (-/+) (-/+)
0 + ++++ - - - +
3 ++ +++ - - - +
6 ++ +++ - - - +
9 +++ ++ - - - +
12 +++ + - - - +
15 ++++ - - - - +

DISCUSION:
En la separación de pigmentos fotosintéticos el cromatograma muestra la presencia de 3
tipos de pigmentos: uno color amarillo que puede ser una xantofila, por ejemplo, luteína
responsable del color amarillo, que presenta una polaridad similar a la fase móvil, ya que se
registró un Rf = 0.96. Un segundo pigmento, con un ligero color anaranjado, menos
hidrofóbico que el anterior, con un Rf=0.52, el cual puede pertenecer al grupo de los
carotenos, por ejemplo, el β- caroteno, el cual absorbe las longitudes de onda verdes y
azules reflejando las rojas y amarillas y que al mezclarse producen el color ligeramente
anaranjado que se observó. Y finalmente, un tercer pigmento verde, con un Rf= 0.24, pero
de mayor abundancia correspondiente a las clorofilas (a y b) presentes en la hoja de
espinaca y que por su abundancia le otorgan el color verde intenso a las hojas de ésta.
En la separación de pigmentos no fotosintéticos al final de las extracción se observan dos
fases: la fase orgánica (superior) que contiene los pigmentos fotosintéticos, clorofila
principalmente, ya que por su estructura son hidrofóbicos y se observan de color verde; y
una fase acuosa (inferior), la cual contiene a los pigmentos no fotosintéticos, en este caso
particular, los pigmentos antociánicos que presenta Zebrina pendula, los cuales son
solubles en agua y pH neutro se observan morados.
En la reacción de Hill se simuló la primera fase luminosa de la fotosíntesis y se observó el
efecto que ciertos factores tienen sobre esta teniendo los resultados presentados en la tabla
1, donde el tubo 1, que presenta suspensión de cloroplastos y DCFIF en presencia de luz, se
observa que desaparece por completo el color del DCFIF, lo que demuestra una reducción
total de este en presencia de luz, al igual que se nota la presencia de pequeñas burbujas,
correspondientes al oxígeno producido por la fotolisis del agua activada en contra de un
gradiente de potencial redox por los cloroplastos presentes. Los tubos correspondientes a
oscuridad muestran un gradiente de reducción del DCIF proporcional al tiempo de
exposición a la luz, por lo que al momento de la lectura la reducción era prácticamente
nula, y conforme se exponían a la luz, comenzaba a reducirse el DCFIF, demostrando que
la presencia de luz es indispensable para iniciar la transferencia de los electrones, lo cual se
confirma con el tubo 3 donde la oscuridad constante no permitió la transferencia de los
electrones del agua al DCFIF, por lo que este permaneció oxidado (azul). En el tubo 4, el
cual fue puesto en ebullición no se presenta reducción del DCFIF debido a que se
desnaturalizan las proteínas encargadas de la fotólisis del agua en la fase luminosa, por lo
que resulta imposible la transferencia de electrones. El tubo 5 corresponde a nuestro testigo
de reactivos, ya que no presenta suspensión de cloroplastos, y nos sirve para demostrar que
la respuesta del DCFIF es causada por un proceso llevado a cabo por los cloroplastos.
Finalmente, el tubo el nuestro testigo +, que demuestra la actividad normal de un
cloroplasto.
Conjuntando ambos resultados, se puede decir que los pigmentos fotosintéticos presentes
en los cloroplastos funcionan como cosechadores de energía o como centros de reacción en
los cuales al incidir la luz se inicia la fase luminosa, en la cual se favorece la fotólisis del
agua en contra de un potencial redox, transportándose los electrones del agua hasta un
aceptor de electrones, DCFIF, el cual se reduce volviéndose incoloro, produciendo oxígeno
gaseoso.
CONCLUSIONES:
Los pigmentos fotosintéticos en una hoja de espinaca son del grupo de los carotenos y
clorofilas, altamente hidrofóbicos y se pueden aislar con disolventes orgánicos.
Los pigmentos no fotosintéticos extraídos de una hoja de Zebrina pendula fueron
antocianinas, polares y solubles en agua.
La luz es indispensable para iniciar la fotolisis del agua. En oscuridad este proceso no se da.
En ebullición se desnaturalizan las proteínas encargadas de la fase luminosa por lo que no
hay transporte de electrones.
BIBLIOGRAFÍA:
Reacción de Hill. Consultado el día 14 de abril de 2019. Extraído de:
http://www.fca.uner.edu.ar/files/academica/deptos/catedras/fisiologiaveg/m_didactico/man
ual_practicas/HillED.pdf
Speer, B.R. (9 de julio de 1997) Photosynthetic pigments (Pigmentos fotosintéticos). En
Glosario Ucmp. Extraído de:
http://www.ucmp.berkeley.edu/glossary/gloss3/pigments.html.