BIOMASA CON LABORATORIO

DR. FRANCISCO CHRISTIAN MARTINEZ TEJEDA

ALUMNO: CRUZ NÚÑEZ JESÚS ALBERTO

TRABAJO

Ensayo de Evaluación de la mejora de la biodegradabilidad de los sustratos

en las Cogestión usando un enfoque metabólico basado en la

quimiometría.

E-10601

16/ JULIO/ 2020

 ¿QUÉ HICIERON?

La digestión anaeróbica (DA) es un proceso sostenible de varios pasos para el

tratamiento de residuos orgánicos utilizados para reducir la cantidad de materia
orgánica sólida resultante de la gestión de las aguas residuales y, en consecuencia,
los costes de la manipulación de los residuos. Además,este genera energía
renovable en forma de biogás por la acción de los microorganismos digiriendo la
materia orgánica (Madigou et al., 2019).La producción de biogás en los digestores
anaeróbicos depende en gran medida de la estabilidad de la comunidad microbiana
que crece en los digestores anaeróbicos (Calusinska et al., 2018). Una clave es la
relación carbono/nitrógeno (C/N). Las relaciones C/N bajas, que se encuentran por
ejemplo en los lodos de aguas residuales, pueden dar lugar a bajas tasas de
digestión y a una baja producción de biogás(Li et al 2011). Para aumentar la
relación C/N y estimular la digestión de los lodos, los residuos se digieren con otros
sustratos más ricos en carbono. Este enfoque se conoce como codigestión (AcoD),
y se considera muy eficiente desde el punto de vista ecológico ya que varios tipos
de los residuos pueden ser procesados simultáneamente (Borowski y Kubacki,
2015). En este trabajo, tenemos exploró el efecto de mezclar el lodo activado de las
aguas residuales (WAS) con el césped del jardín (GG) o residuos de pescado (FW)
como co-sustratos. En la digestión de los residuos orgánicos, los polímeros
complejos (carbohidratos, proteínas,ácidos nucleicos y grasas) se descomponen en
compuestos más simples (azúcares, aminoácidos, ácidos nucleicos bases, glicerol y
ácidos grasos) que son finalmente convertidos en metano y CO2 por el comunidad
microbiana que vive en las EA (Chatterjee y Mazumder, 2019; Meegoda et al (2018).
A pesar del curso metabólico de la EA, la evolución de la digestión es típicamente
evaluados con mediciones indirectas del rendimiento de los digestores (es decir, el
pH y la bioquímica demanda de oxígeno (Meegoda et al., 2018)), o estudiando la
dinámica microbiana por el ARN y Secuenciación de ADN (De Vrieze et al., 2018).
Alternativamente, los metabolitos específicos o los reguladores compounds can also
be analyzed to look for underlying metabolic mecanismos (Vanwonterghem et al.,
2014). Por último, hasta donde sabemos, sólo unos pocos estudios han empleado
enfoques metabolómicos para explorar la dinámica metabólica global en las EA
(Yang et al., 2014; Beale y otros, 2016; Murovec y otros, 2018).La metabolómica es
el estudio de las pequeñas moléculas (metabolitos) dentro de los extractos
celulares,tejidos y organismos vivos (Patti et al., 2012), y se ha utilizado
ampliamente para evaluar la respuesta metabólica dinámica de los sistemas
vivos a los estímulos fisiopatológicos y genéticos modificaciones (Klassen et al.,
2017). La metabolómica también se ha utilizado para estudiar la metabolitos de las
comunidades microbianas (la llamada "metabolómica de la
comunidad&quot(Llewellyn y otros, 2015). Los estudios de metabolómica de la
comunidad sobre la EA son todavía muy escasos (Jones et al., 2016), ya que su
aplicación ha sido difícil debido a la muy grande gama de metabolitos de los que hay
un conocimiento a priori limitado (Vanwonterghem et al 2014).
 ¿CÓMO LO HICIERON?
PREPARACIÓN DE LA MATERIA PRIMA Y MONTAJE EXPERIMENTAL
Los lodos de aguas residuales (WAS) se recogieron de una planta de tratamiento de
aguas residuales industriales(Valenton, Francia), GG era del césped del Instituto
IRSTEA, y FW se obtuvo de un mercado de pescado. GG y FW fueron triturados por
separado y los sólidos picados resultantes se almacenaron a 4°C durante dos días.
Las características químicas de WAS, FW y GG se dan en la tabla A.1. El inóculo se
obtuvo de un digestor anaeróbico mesófilo a escala real que trataba lodos primarios
en la planta de tratamiento de aguas residuales de Valenton (Francia). Para
preparar el inóculo antes de su uso, se dejó en condiciones anaeróbicas a 35°C
durante dos semanas para digerir el residuo la materia orgánica que queda en el
inóculo. Para el montaje experimental, 27 lotes anaeróbicos se utilizaron
biorreactores que consistían en botellas de vidrio de 1 L. Se prepararon nueve
mezclas diferentes mezclando el sustrato WAS con co-sustratos FW o GG en
diferentes proporciones (100% FUE, 75% FUE/25% GG, 50% FUE/50% GG, 25%
FUE/75% GG, 0% FUE/100% GG, 75% WAS/25% FW, 50% WAS/50% FW, 25%
WAS/75% FW, y 0% WAS/100% FW) de gramos de Demanda Química de Oxígeno
(gCOD). Cada tipo de mezcla de sustrato se utilizó en tres reactores (triplicados). La
biomasa correspondiente a 12 gCOD (Tabla A.1) se añadieron en cada biorreactor.
Entonces, los 27 biorreactores fueron inoculados con 1,2 gCOD de anaerobio.Todos
los digestores se complementaron con un amortiguador de potencial
bioquímico(Norma internacional ISO 11734 (1995) (Organización Internacional de
Normalización, Ginebra, 1995)) hasta un volumen final de 700 mL. Los biorreactores
fueron sellados con un tapón de rosca y un tabique de goma y los espacios de la
cabeza fueron lavados con N2 (pureza > 99.99 %, gas de LindeSA), y incubado
durante 4 semanas a 35°C en la oscuridad sin agitación.

MUESTREO
Se utilizó un diseño experimental de muestreo particular para centrarse en el
metabolismo huella dactilar asociada a la producción de biogás. Para cada digestor
que contenga FW o GG, se monitorearon tres puntos: uno al inicio de la co-digestión
(día 0), y los dos muestras más cercanas en el tiempo (antes y después) a la mayor
producción de metano (días 14 y 21 para los digestores GG, y los días 21 y 28 para
los digestores FW) (Cardona et al., 2019). Finalmente, para digestores que sólo
contienen lodo, se vigilaron los 4 puntos temporales (días 0, 14, 21 y
28).Considerando los triplicados, en total se recogieron 84 muestras. El muestreo
fue realizado por recogiendo 6 mL de fase líquida del digestor a través del tabique
con una jeringa. Luego, las muestras se centrifugaron a 10.000 g durante 10
minutos para recoger los sobrenadantes, que fueron luego se congelan en nitrógeno
líquido y se mantienen a -20ºC antes del análisis metabolómico.
 ANÁLISIS METABÓLICO
Se realizó un análisis metabólico de todos los sobrenadantes recolectados. Antes
de la inyección, las muestras se diluyeron a 1/10 en agua de MilliQ. La
instrumentación consistió en un Accela 1250 sistema de bomba conectado a un
espectrómetro de masas LTQ-Orbitrap XL (Thermo Scientific, MA, US) operaba en
modo de ionización positiva de electro-spray (ESI+). La detección se realizó en un
escaneo completo en un rango de m/z de 50 a 500 a una resolución de 100.000. El
análisis era de 50 × 2,1 mm de diámetro interior, 1,7 µm Syncronis C18 (Thermo
Scientific, MA, EE.UU.). Las dos fases móviles eran el acetonitrilo 0,05% ácido
fórmico (fase A) y el H2O 0,05% ácido fórmico (fase B). Para cada muestra, se
inyectaron 10 µ L en el sistema analítico. El la tasa de flujo se fijó en 0,4 mL min-1, y
el método cromatográfico consistió en una gradiente de los disolventes A/B
cambiando de 10:90 a 80:20 en 23 minutos, seguido de un fase de estabilización de
5 minutos para volver a la condición inicial.Para eliminar los posibles efectos del
lote, se inyectaron muestras en orden aleatorio. Además,Se inyectaron controles de
calidad (QC) compuestos por un conjunto de todas las muestras cada 5 muestras,y
se inyectaron muestras en blanco cada 10 muestras. En total, se inyectaron 116
muestras (84 muestras experimentales, 21 muestras QC y 11 muestras en blanco).

PREPROCESAMIENTO DE DATOS DE HPLC-MS

Los datos crudos de HPLC-MS fueron convertidos en archivos de formato mzXML
usando MSConvert (ProteoWizard 3.0). Luego, la lista de características
cromatográficas (regiones de interés, o ROI) de cada muestra se extrajeron
utilizando el paquete R de XCMS (versión 1.52.0) (Smith et al, 2006). Las ROI se
generaron con el método centWave, utilizando un umbral de error m/z de 10 ppm y
un ancho de pico entre 20 y 50 segundos. Los ROI encontrados en diferentes
muestras se agruparon usando el método de grupo con un ancho de banda de 30
segundos. Los tiempos de retención del retorno de la inversión de la misma Los
grupos de retorno de la inversión se unificaron en las muestras utilizando el método
obiwarp (Prince y Marcotte, 2006). Se realizó una segunda agrupación utilizando un
ancho de banda de 25 segundos. Luego, las muestras con ROI faltantes se llenaron
usando el método de FillPeaks. A partir de este análisis, una tabla de picos
intensidades compuesta de 116 filas (una por muestra) y 476 columnas (una por
ROI) fue obtenido. Esta tabla fue luego importada como una matriz en el Matlab
R2009b (Mathworks, Inc.,MA, US) para la deriva de la intensidad y las correcciones
de los lotes. Se corrigieron las desviaciones de la intensidad de la señal usando
LOESS (Dunn et al., 2011; Rusilowicz et al., 2016). Diferencias dentro de los
lotes(entre triplicados) y entre lotes (diferentes mezclas de sustratos y puntos de
tiempo) fueron minimizado con el método de normalización del PQN (Frank Dieterle
et al., 2006), utilizando el mismo como en Puig-Castellví (Puig-Castellví et al., 2016).
 ANÁLISIS DE DATOS QUIMIOMÉTRICOS
Primero, la matriz compuesta por los datos metabolómicos de los 84 experimentos
Las muestras se escalaron automáticamente (van den Berg et al., 2006) y fueron
investigadas por el Director Análisis de componentes (PCA (Bro y Smilde, 2014)).
Con este método, un preliminar se obtuvo una visión general de los datos.Con el fin
de identificar los procesos metabolómicos subyacentes que rigen las diferentes
dinámicas biológicas que ocurren en los digestores que contienen GG y FW, los
datos se organizaron en dos matrices (una por cada co-sustrato). Las muestras
incluidas en la primera se obtuvieron de las dos monodigestiones (WAS y GG), y de
la comatriz la digestión de WAS y GG, y recogidas en los días 0, 14 o 21. Las
muestras en la segunda matriz eran de las mono y co-digestiones análogas de WAS
y FW. En este segundo caso, se recogieron muestras en los días 0, 21 y 28. Así
pues, cada matriz está compuesta por 45 muestras (3 muestras por condición y por
tiempo, con 5 condiciones de sustrato y 3 puntos de tiempo). Estas dos las matrices
se denominarán "conjunto de datos GG" y "conjunto de datos
FW", respectivamente.Cada conjunto de datos se centró y se escaló a escala
de norma (Bylesjö et al., 2009) y fue investigado por Análisis de Componentes
Comunes (CCA) (Bouhlel y otros, 2018; Rutledge, 2018). El CCA es un método
quimiométrico no supervisado que estima una serie de componentes ortogonales
comunes(CCs) que son combinaciones lineales de las variables originales, con
fuertes ponderaciones para variables fuertemente correlacionadas que presentan la
misma dispersión de las observaciones.Análogamente a PCA, para cada CC, se
calculan las puntuaciones y los vectores de carga. Las cargas dan información
sobre el perfil metabólico (o composición de los metabolitos) de las muestras
analizadas, mientras que las puntuaciones muestran la importancia relativa de estos
perfiles metabólicos para cada muestra. Además, en la CCA, un vector de pesos
(llamado saliencias) que corresponde a la importancia de la variable para cada CC
también se calcula iterativamente. El número óptimo de CC puede ser evaluada
trazando la suma de salientes de cada componente, de la misma manera que la
evaluación del número óptimo de componentes en un PCA con la prueba de Scree
(Ledesma etal., 2015) o aplicando la Medida de Adecuación del Muestreo de
KaiserMeyer-Olkin (KMO) a las matrices de residuos para detectar el momento en
que sus líneas y/o columnas ya no están suficientemente correlacionados para
merecer un análisis factorial adicional (Rencher, 2002). Para cada CC, las variables
(por ejemplo, ROI) asociadas a los valores de carga más allá de 2 estándar Se
seleccionaron las desviaciones (± 2 × SD) (Bouhlel et al., 2018) y se asignaron
provisionalmente si es posible.
 IDENTIFICACIÓN DE METABOLITOS
La identificación provisional de los metabolitos de los ROI seleccionados se realizó
sobre la base de la comparación de la masa molecular exacta medida por HPLC-MS
con la calculada exacta masa. La fórmula molecular de los candidatos se estimó
primero usando el paquete Rdisop R-package (Böcker y otros, 2009). Este paquete
permite el cálculo de todas las posibles fórmulas para una masa exacta dada, dentro
de una ventana de error delta en ppm (diferencia entre la masa experimental y la
masa del aducto), y utilizando un número limitado de elementos. En este buscamos
todas las fórmulas moleculares dentro de 10 ppm que coincidieran con
CcHhNnOoPpSsNanaKkCaca. Entonces, por cada masa molecular precisa, se
propone una las fórmulas fueron filtradas usando heurística (Kind y Fiehn, 2007), y
por último, las fórmulas moleculares se seleccionó la fórmula asociada al valor delta
más bajo. Finalmente, los nombres compuestos fueron dado a las fórmulas
moleculares seleccionadas después de la inspección de las posibles estructuras en
HMDB (Wishart et al., 2018), LipidMaps (Fahy et al., 2007), y PubChem (Kim et al.,
2019) bibliotecas compuestas. 2.7 Evaluación de la degradabilidad metabólica
durante la AcoD en este documento, proponemos cuantificar la biodegradabilidad
metabólica (MB) de los diferentes el correspondiente experimento de
monodigestión.MB0→i se define como el cambio observado en la composición
general del metabolismo durante la EA entre el punto de tiempo inicial (t0) y ti .
Dado que los puntajes CC representan la importancia relativa de los distintos
perfiles metabólicos, MB puede ser aproximado como la distancia entre los dos
puntos de muestra en un gráfico de puntuaciones obtenido de un análisis CCA de
un conjunto de datos de metabolómica. Para un Modelo CCA de dos componentes
(CC1 y CC2), esta expresión puede generalizarse como la ecuación. (1):MBs,O→i =
ƒ(1, s,ti - 1, s,tO)2 + (2,s,ti - 2,s,tO)2 eq.En la ecuación (1), uCC1, s,t0 y uCC1 ,s,t0
representan los valores de las puntuaciones CC1 asociadas a un sustrato dado
composición s en los dos puntos de tiempo, t0 y ti ; y uCC2,s ,t0 y uCC2 ,s,t0 El
correspondiente CC2 obtiene valores para la misma composición de sustrato y
tiempos. Como gráfico ejemplos, el MB0→i para 50% GG, 100% GG, 50% FW, y
100% FW están Entonces, la tasa de biodegradabilidad metabólica (MBR) puede
ser calculada utilizando la ecuación. (2) de la siguiente manera:Mezcla_de_sustrato
MBR (%) = Mezcla_de_sustrato MBR 100eq(2)donde MBsubstrate_mixture es el
valor de MB obtenido para cada sustrato probado, y MBpure El sustrato es el valor
de MB para los co-sustratos puros (en este estudio, 100%GG o 100%FW 15
dependiendo del sistema de AcoD estudiado) en el último punto temporal, ya que se
presume que este último tienen el mayor número de MB observados. Finalmente, el
factor de sinergia en la co-digestión (FSC) puede ser estimado a partir del MBR.El
Por otro lado, el FSC es la relación entre el RBM observado y el teórico para un
determinado comezcla de digestión:Mezcla de sustratos del FSC =
MBRsubstrate_mixture, eq.(3) donde el MBR teórico es la suma ponderada del MBR
del sustrato y el co sustrato por sus correspondientes proporciones relativas ωs:Por
ejemplo, si el 100% de WAS tiene un MBR del 20% y el 100% de GG tiene un MBR
del 100%, entonces el El MBR teórico del 50% WAS/50% GG será del 60%.
 ¿QUE OBTUVIERON?
La tasa de biodegradabilidad metabólica (MBR) de la monodigestión de GG no
mejoró en una cantidad estadísticamente significativa desde el día 14 (89%±14%)
hasta el día 21 (100%±9%,). Para la mono-digestión WAS, el MBR fue de 18%±8%
en el día 14, y de 20%±1% en día 21. Cuando los dos sustratos se utilizaron en la
mezcla, la mejor mejora en la Se encontró MBR para el 50% WAS/50% GG AcoD
después del día 14, con casi el 11% de los observados sinergia en la degradación
(FSC = 1.11). 25% WAS/75% GG AcoD también mostró un efecto de sinergia en la
degradabilidad (FSC = 1.08). Sin embargo, en el día 21, todos los ensayos mezclas
presentaron un FSC por debajo de 1, indicando que las vías de degradación
desencadenadas por La mezcla de los dos sustratos son menos eficiente que la
empleada durante el WAS y el GG.
Se demostro que la metabolómica se puede utilizar para evaluar la co-digestión de
lodos con un co-sustrato usando dos sistemas diferentes de AcoD.Este Por lo tanto,
se puede aplicar la metodología para investigar la mejora de la codigestión asociado
a otros co-sustratos. Por último, cabe señalar que esta metodología es
potencialmente fácil de extrapolar a la industria de la gestión de residuos, ya que no
se limita sólo a la HPLC- Datos de EM, y cualquier técnica de alto rendimiento
basada en la metabolómica, incluyendo RMN y GC.La esclerosis múltiple, puede ser
usada para el mismo propósito.

CONCLUSIÓN
Una estrategia metabolómica basada en la quimiometría para determinar la huella
metabólica de la AcoD y para evaluar la degradabilidad de los sustratos durante la
AcoD se desarrolló.Por un lado, en lo que respecta a los dos sistemas estudiados
por el AcoD, una visión completa de la se lograron los procesos metabólicos que se
estaban produciendo. Observamos que la mayoría de los procesos metabólicos Las
alteraciones a lo largo del tiempo que ocurrieron durante la AcoD estuvieron
vinculadas al co-sustrato,el compuestos en el co-sustrato siendo más
biodegradables que los de la WAS. Para GG AcoD,estas alteraciones estaban
principalmente vinculadas a los procesos de degradación de las proteínas. Para FW
AcoD, los dos los grupos más importantes de compuestos que se biodegradan con
el tiempo son los aminoácidos y las aminas biogénicas.Por otra parte, en lo que
respecta a la evaluación de la AcoD, la adición de residuos verdes en la AD no
mejoró el MBR de los lodos de aguas residuales, mientras que un efecto sinérgico
en el El MBR se observó cuando se utilizaron los desechos de pescado. La MBR
más mejorada en la co-digestión de peces fue encontrado cuando el WAS fue
mezclado con un 25% de FW.