UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN SIMON

FACULTAD D E CIENCIAS Y TECNOLOGIA

TEMA DE INVESTIGACIÓN:
RESPONSABLE DEL MODULO: Ing. Roció Morales Vargas
NOMBRE DEL ESTUDIANTE: Sánchez Zurita Jasiel
MATERIA: Modulo de Investigación
FECHA DE ENTREGA:

COCHABAMBA-BOLIVIA
INTRODUCCION
La quinoa es un cultivo andino extendido en Sudamérica, y labrado
principalmente en las zonas alto andinas de Perú y Bolivia. Éste pseudocereal
es tolerante al frío, sequía y salinidad, por lo tanto presenta un potencial de
cultivo en suelos degradados y en regiones con temperaturas normalmente
adversas para otros cultivos. Es un grano andino de reconocido valor nutricional.
No es un alimento excepcionalmente alto en proteínas aunque en general supera
ligeramente a cereales como el trigo, la cebada, el centeno, arroz y la avena. Sin
embargo, el verdadero valor de los granos y subproductos de quinoa está
relacionado con la calidad de sus proteínas, ya que posee mayor proporción de
aminoácidos esenciales para la alimentación humada que los cereales
tradicionales, especialmente lisina, principal aminoácido bajo en cereales.
El contenido de grasas en la quinoa es superior al arroz, sorgo, cebada, centeno
y similar a maíz, avena y otros cereales andinos. Los ácidos grasos se dividen
en dos grandes grupos los saturados y los insaturados. Estos lípidos cumplen
diversos roles en la alimentación humana. Son la principal fuente de reserva
energética, son constituyentes de las membranas celulares y vehiculizan
diversos compuestos como las vitaminas liposolubles. Además, numerosas
sustancias de actividad fisiológica están relacionadas con estos compuestos,
como las hormonas, vitaminas y ácidos biliares. La dieta debe proveer los ácidos
grasos esenciales, que son linoleico, linolénico (en la configuración cis reducen
los niveles de colesterol en sangre) y araquidónico (indispensable para la síntesis
de prostaglandinas).
En la región andina, se ha encontrado que el contenido de grasa en los granos
de quinua varía entre 3.67% y 8.92% con una media de 5.68%. La presencia de
ácidos grasos esenciales constituyen la mayor fracción en los lípidos de los
granos de quinua, el ácido oleico (Omega 9) se presenta entre 21.1 y 26.04%, el
ácido linoleico (Omega 6) entre 50.2 y 56.9% y el ácido linoleico (Omega 3) entre
3.9 y 7.8%.
1.
MATERIALES Y METODOS
Granos perlados de tres cultivares de quinua, INIA 415 Pasankalla, INIA 420
Negra Collana y Salcedo INIA, fueron sometidos a tres tipos de transformación:
cocción húmeda (CH), expandido por explosión (EPE) y cocción por extrusión
(CPE). El contenido de ácidos grasos en los productos de los tres procesos de
transformación y en granos perlados no procesados fueron obtenidos para cada
una de los cultivares.
-Obtención de granos perlados de quinua
Para la obtención de granos perlados se siguieron los siguientes pasos:
selección y limpieza de granos removiendo todas las impurezas, remojo de los
granos limpios durante tres minutos, escarificación por frotación manual de los
granos en agua hasta obtener espuma, enjuague de los granos con abundante
agua y secado durante tres días. Esta operación se realiza con el propósito de
remover el contenido de saponina.
-Cocción húmeda
La cocción húmeda ha consistido en someterlos granos de quinua, previamente
lavados y secados, a cocción en agua por 45 minutos, con una relación quinua-
agua de 1:4, para todas las muestras de quinua, luego los granos cocidos se
dejaron enfriar y secar bajo sombra. Los productos se envasaron y sellaron en
bolsas de polipropileno y fueron almacenados en lugar fresco y seco.
-Expandido por explosión
El expandido por explosión abarcó las siguientes etapas, hidratación de los
granos de quinua al 10%, pre-calentamiento del equipo de expandido por 30
minutos con el fin de homogeneizar la temperatura de la cámara de capacidad
de 1 kg, alimentación de la cámara del equipo con 900g de granos de quinua
hidratados, calentamiento de la cámara herméticamente cerrada hasta alcanzar
una presión de 190 lb/pulg², al alcanzar la cámara la referida presión, se retira la
fuente de calor y se abre la tapa del equipo de expandido provocando que los
granos expandidos de quinua salgan explosivamente y caigan en el dispositivo
de recepción del producto, luego se seleccionó el producto expandido,
removiendo los granos no expandidos. La quinua expandida fue envasada y
sellada en bolsas de polipropileno y almacenada en lugar fresco y seco.
-Cocción por extrusión
La cocción por extrusión ha consistido en las siguientes etapas:
acondicionamiento, en la cual los granos de quinua previamente lavados y
secados fueron hidratados añadiendo agua en una relación de 2 ml/Kg y esperar
unos 10 minutos; alimentación del equipo extrusor con la harina de quinua
hidratada;extrusión con un equipo de extrusión de doble anillo a una temperatura
de 220ºC y una presión de 80 lb/pulg², utilizando los mismos parámetros para
los tres cultivares; enfriamiento del producto extruido por 10 minutos, molienda y
envase del producto en bolsas de polipropileno, sellado y almacenamiento en
lugar fresco y seco.
-Contenido de extracto etéreo
El contenido el extracto etéreo de los productos de los tres tipos de
transformación de cada uno de los tres cultivares, INIA 415 Pasankalla, INIA 420
Negra Collana y Salcedo INIA, además de muestras de granos de quinua perlada
sin transformar, fue determinado en el Laboratorio de Análisis de la Estación
Experimental Illpa del INIA-MINAG, mediante el método gravimétrico, de acuerdo
a la Norma Técnica Peruana NTP 209.263.
-Perfil de los ácidos grasos
Los productos de los tres tipos de transformación de cada uno de los tres
cultivares, INIA 415 Pasankalla, INIA 420 Negra Collana y Salcedo INIA, además
de muestras de granos de quinua perlada sin transformar fueron sometidos a la
determinación del perfil de ácidos grasos. El método de determinación fue el de
cromatografía de gases, de acuerdo a la norma ISO 17764.
2.
EXTRACCIÓN DE LÍPIDOS
Aproximadamente 45 mg de semillas de las variedades Chadmo y Sajama,
fueron molidas en un mortero e incubadas en 1,5ml de una solución de
cloroformo-metanol (2:1) durante 10 minutos con agitación. Las muestras fueron
luego centrifugadas a 10000g durante 15 minutos a 4°C. Este procedimiento se
realizó tres veces y los sobrenadantes obtenidos fueron conservados en
oscuridad en heladera a 4°C para su posterior procesamiento.
CARACTERIZACIÓN DE ÁCIDOS GRASOS POR CROMATOGRAFÍA GAS-
LÍQUIDO
Los extractos lipídicos fueron procesados según Crane y col. para la obtención
de los metilésteres de los ácidos grasos. A cada muestra se agregó una solución
10% de NaCl en una relación de extracto lipídico-solución salina de 5:1 y se agitó
vigorosamente durante 1 minuto, se dejó reposar 60 minutos hasta finalizada la
partición (separación de fases) y se descartó cuidadosamente la fase acuosa.
Luego se evaporó todo el solvente empleando nitrógeno gaseoso. A
continuación, se agregaron 2ml de una solución fresca de 10% de KOH en etanol
96°, se gaseó con N2 para eliminar el O2 del entorno y se calentó a 80°C durante
1 hora. Para eliminar los lípidos insaponificables, se dejó enfriar a temperatura
ambiente, se agregaron 2ml de hexano y se agitó vigorosamente durante 1
minuto. Al separarse ambas fases, se descartó la fase superior (hexano). La
acidificación se llevó a cabo con el agregado de 1,5ml de HCl concentrado. Se
agregó luego 1,5ml de hexano para permitir la solubilización de los ácidos
grasos. La fase superior orgánica se recuperó y se evaporó la totalidad del
hexano con N2. A continuación se realizó la metilación de los ácidos grasos.
Para ello se agregaron 1,5ml de una solución 10% de trifluoruro de boro en
metanol y luego 1,5ml de benceno. Se gaseó con N2 y se calentó a 100°C con
agitación durante 1 hora. Luego de enfriarse a temperatura ambiente, se
agregaron 1ml de hexano y 2 ml de agua, se agitó vigorosamente durante 1
minuto y se dejaron separar las fases de manera de permitir la 84 Eventos
Implicados en la Pérdida de Viabilidad solubilización de los metil-ésteres en
hexano y la eliminación de residuos en la fase acuosa. Se descartó la fase
acuosa y se repitió el agregado de agua y la agitación dos veces más para
asegurar la pureza del extracto final. Finalmente, se evaporó el hexano y se
almacenaron las muestras en oscuridad a -20°C hasta realizar la cromatografía
gas-líquido.
Los metil ésteres de ácidos grasos fueron redisueltos en hexano y se analizaron
por cromatografía gaseosa (GLC) utilizando un equipo Hewlett Packard HP -
6890, con una columna Omegawax X250 programado para un incremento lineal
de la temperatura de 3ºC/min desde 175 hasta 230ºC. Los picos de los
metilésteres de ácidos grasos fueron identificados por comparación con el
tiempo de retención de estándares analizados en las mismas condiciones.
3.
MATERIALES Y EQUIPOS
Beackers, baguetas, tubo de ensayo, placas Petri estériles de vidrio 15 x 100
mm, pipetas estériles de 1, 5 y 10ml, fiolas 10ml, matraz Erlenmeyer 500ml, pera
de decantación 500mL, matráz Kitasato 500 ml, balón de vidrio, probeta 100ml,
viales de borosilicato, algodón, embudo simple, embudo Buchner, gradillas,
micropipetas, papel filtro, soporte universal, pinzas, mortero, papel de aluminio,
guantes de látex, mascarilla simple, lentes de protección. Equipo Soxhlet , estufa
modelo ODHG-9030, estufa acoplada a un termómetro Labor Muszeripari Muvek
(Esztergom) modelo 68-33884, campana extractora CRUMAIR, refrigeradora
Samsung Modelo ES21HKLMR, ccentrifuga SMART R17, molino de cuchillas –
Moulinex, balanza analítica Mettler Toledo AL204, cromatógrafo de gases
PERKIN ELMER AUTOSYSTEM XL, bomba de vacío VAS ÉS FÉMIPARI KTSZ
SZEGED, espectrofotómetro Thermo Scientific TM GENESYS 10S UV-Vis
Spectophotometer, lámpara ultravioleta Modelo UVL-B-40 2X20W/220V/60Hz,
cocinilla eléctrica, cromatógrafo líquido (HP 1100 series, Hewlett-Packard,
Strasse 8, 76337 Waldrdrown, Alemania: G1311ª bomba, G 1316ª horno, G
1313ª ALS inyector).
REACTIVOS Y MATERIAS PRIMAS
Cloroformo (Merck), agua destilada, etanol 96°, metanol grado HPLC (Merck),
Butanol (Sigma), DPPH (Aldrich), Trolox ® (Sigma), ABTS (Sigma), suero
fisiológico, sulfato de sodio anhidro, éter de petróleo (Merck), hidróxido de sodio,
ácido clorhídrico 2N, formol neutro (preparado en el laboratorio), gas nitrógeno,
Nhexano, solución de propanol, éter de petróleo, alcohol cetoestearilico, Esterpol
GA, palmitato de isopropilo, benzoato de sodio, EDTA disódico, Carbopol Ultrez
21, trietanolamina, glicerina, , Dow Corning 2051, Dow Corning 1501, agua
destilada, crema depilatoria, algodón, suero fisiológico, violeta de genciana,
crema antienvejecimiento de la marca Redermic
MÉTODOS EXTRACCIÓN DE LOS ACEITES DE QUINUA
Método Soxhlet
La grasa cruda se extrajo de las semillas molidas en un aparato de extracción
continua tipo Soxhlet. El solvente fue removido del extracto por evaporación y el
residuo fue pesado y reportado como grasa. Para ello las semillas molidas cada
una por separado se procedieron a su extracción con etanol:éter de petróleo (1:1)
como solventes a una temperatura entre 40 y 60 ºC por análisis, la evaporación
se realiza por rotavapor y la estimación del contenido de grasa es por peso59-
62 .
Método Bligh and Dyer
Los aceites para la cuantificación de ácidos grasos, efecto antioxidante y
elaboración de las cremas dermocosméticas se obtuvieron mediante la
extracción directa con disolventes orgánicos en frío siguiendo el método Bligh
and Dyer que se aplica a muestras de alimentos especialmente para extraer
lípidos e identificar por cromatografía de gases y prueba de rancidez. Se basa
en la homogenización de alimentos húmedos con metanol y cloroformo en
proporciones tales que forman una fase sencilla miscible con el agua en los
alimentos, que al adicionar cloroformo y agua se separan en dos fases cuya
grasa se encuentra en la capa del cloroformo. Las semillas de quinua se molieron
cada una por separado y se pasó por una malla Nº 40. Posteriormente cada
muestra de quinua (100 g) se colocó en un vaso agitador, se adicionó 100 mL de
cloroformo grado HPLC, se agitó por 30 segundos, se agregó 200 mL de metanol
grado HPLC, se agitó por 120 segundos, se volvió a agregar 100 mL de
cloroformo grado HPLC, para luego agitar por 30 segundos finalmente se
adicionó 100 mL de agua, se agitó nuevamente por 30 segundos, se dejó en
reposo y se filtró al vacío. El filtrado se pasó a una pera de decantación, se dejó
reposar por 15 minutos aproximadamente, se separó la fase clorofórmica
pasándolo a través de sulfato de sodio anhidro, se colocó en un balón y se llevó
a evaporar en rotavapor entre 60 y 65 ºC. Una vez terminado la evaporación de
los restos de reactivos, el aceite se sometió a un ambiente cargado de nitrógeno,
para evitar su oxidación, y para su posterior uso se almacenó en frascos ámbar
herméticamente cerrados y refrigerados. Identificación y cuantificación de ácidos
grasos en los aceites de quinua
En el análisis para identificar y cuantificar los ácidos grasos en los aceites de
quinua, los triglicéridos y fosfolípidos fueron saponificados y metilados a la vez
por reacción de las soluciones NaOH 2N y HCl 2N en metanol respectivamente.
Los ácidos grasos metilados son inyectados al cromatógrafo de gases con un
detector de ionización de flama de hidrogeno y una columna capilar Supercowax-
10 de sílica fundida marca Supelco de 30 m de longitud, 0,25 mm de diámetro
interno y 0,25 Ɋm de grosor donde son separados al ser arrastrados por el
hidrógeno de la fase estacionaria de la columna. Se utilizó un cromatógrafo de
gases PERKIN ELMER AUTOSYSTEM XL. La temperatura del inyector fue de
250 ºC, la temperatura del detector fue de 270 ºC, el contenido de cada uno de
los ácidos grasos se verificó por comparación con el tiempo de retención de los
estándares.
4.
DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE ÁCIDOS GRASOS POR
CROMATOGRAFÍA GC
Principio de separación por cromatografía de gases
Separación de mezclas por interacción diferencial de sus componentes entre
fase estacionaria (líquida o sólida) y una fase móvil (Líquido o gas). La GC es
aplicable para separaciones de mezclas que tengan hasta 300°C de punto de
ebullición y sean térmicamente estables. Para la determinación del perfil de AG
deben ser metilados. La metilación rompe los enlaces éster de los triglicéridos y
añade un grupo metilo a la AG. El AG metilado es más volátil y menos polar.
DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE ÁCIDOS GRASOS
El método consta de tres etapas: la metilación, extracción y cuantificación por
cromatografia gaseosa, las mismas que se describen a continuación. Para la
metilación se procedió a pesar un tubo de 70 ml, 500 mg exactamente de aceite
de quinua. Al aceite se le adicionó 10 ml de KOH O.1 M y el conjunto se colocó
en un baño maría a 70°C por una hora. Posteriormente los tubos fueron enfriados
y se adicionó 4 ml de una solución de HCl 1.2 N en MeOH (metilación), el tubo
fue agitado y colocado en baño maría a 70°C por 20 min para posteriormente
enfriar a 4 °C.
La extracción se realizó adicionando 20 mL de hexano a los tubos y enfriados,
así como 1 O ml de agua MilliQ, el conjunto se agitó en un vortex. Seguidamente,
la mezcla se colocó en refrigeración a 4°C durante una noche, luego de la cual
se observó la separación de dos fases. Se tomó 150 mL de la fase superior y se
llevó a un volumen de 1 O ml con hexano, adicionalmente esta mezcla contenía
1 ml del estándar interno C 11 :0 (metilundecanoato) a la concentración de 0.4
mg/ml para corregir el volumen de inyección, enrasar con hexano y conservar a
-20°C.
Los ácidos grasos de la muestras de aceite se convierten en metil éster, los
cuales serán separados inyectando 1 mL de la solución en un cromatógrafo de
gases Shimadzu Plus GC-2010 (Kioto, Japón) equipado con un detector de flama
de ionización y un autoinyector AOC-20i. La columna capilar utilizada fue
RESTEK Rt2560 compuesta de bis-cianopropilpolisíloxano (100 m de longitud,
0.25 mm de diámetro y 0.2 Jlm de película interior). El gas portador fue helio. El
programa de gradiente de temperatura empleado fue el siguiente:
l. Temperatura inicial: 80°C
2. Incremento de T0 (25°C/min) hasta 175°C
3. Primer nivel: 175°C durante 25 min
4. Incremento de la T0 (10°C/min) hasta 205°C
5. Segundo nivel: 205°C durante 4 min
6. Incremento de la T0 (10°C/min) hasta 225°C 7.
7. Tercer nivel: 225°C durante 20 min
8. Descenso de la T0 (20°C/min) hasta 80°C

El tiempo de corrida cromatográfica fue de 72 minutos por cada muestra. Los

ácidos grasos fueron identificados en función a los tiempos de retención, por
comparación de estándares previamente inyectados. Los resultados fueron
expresados como g de ácido graso/1 00 g de semilla, considerándose en los
cálculos los rendimientos en aceite obtenidos en la semilla.
METODOLOGÍA EXPERIMENTAL
Acondicionamiento de la materia prima
Para realizar las pruebas fue necesario acondicionar las muestras previamente:
-Limpieza.- Las muestras pasaron por un proceso limpieza para eliminar
rmpurezas como perigonios, piedras, tallos u hojas.
Selección.- Esta operación se realizó manualmente con el fm de separar
únicamente los granos pertenecientes a la variedad.
-Desamargado.- En orden a remover las saponinas las semillas fueron
sometidas a un lavado bajo flujo de agua fría por 5 min.
-Secado.- Se somete a un secado a 40°C por 4 horas. Y se conserva en bolsas
de polietileno de alta densidad con nitrógeno líquido y a -20°C en condiciones de
oscuridad.
-Molienda Las muestras fueron molidas lo más finamente posible (menos de 2
mm) con la ayuda de una licuadora y conservadas bajo condiciones de
oscuridad.
-Almacenamiento.-Se colocaron en una congeladora a -20°C y se mantuvo a
esta temperatura todo el tiempo que se realizaron los análisis.