UNIVERSIDAD AUTONOMA DE CHIAPAS

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS

CAMPUS IV

LABORATORIO DE BACTERIOLOGÍA II

PRACTICA No. 4 “PRUEBAS CONFIRMATORIAS DE STAPHYLOCOCCUS

PNEUMONIAE”

 HERNÁNDEZ HERNÁNDEZ FRIDA GUADALUPE

SEXTO SEMESTRE GRUPO “A”

MTRO. LUIS HUMBERTO ROSALES FURUKAWA

LUNES 05 DE OCTUBRE DE 2020.

 PRUEBAS CONFIRMATORIAS PARA STREPTOCOCCUS
PNEUMONIAE

Streptococcus pneumoniae fue aislado de forma independiente por Pasteur y por

Steinberg hace más de 100 años. Desde entonces, la investigación con este
microorganismo ha hecho posible una mayor comprensión de la genética
molecular, la resistencia a antibióticos y la inmunoprofilaxis con vacunas.
No obstante, la enfermedad neumocócica continúa siendo en
la actualidad una causa importante de morbimortalidad.
El neumococo es un coco grampositivo encapsulado. Las células tienen un
diámetro de 0,5 a 1,2 µm, con forma ovalada o de lanceta, y se disponen en
parejas (diplococos) o en cadenas cortas. La morfología de las
colonias es variable. Las colonias de las cepas encapsuladas suelen ser grandes
(1 a 3 m m de diámetro en agar sangre; más pequeñas en medios con chocolate o
agar sangre calentado), redondas y mucoides; las colonias de las cepas no
encapsuladas son más pequeñas y aplanadas. Todas las colonias experimentan
un proceso de autólisis con el paso del tiempo, el cual consiste en la disolución de
la porción central de la colonia que origina un aspecto de hoyuelo. Las colonias
aparecen como a-hemolíticas en agar sangre cuando se incuban en una
atmósfera aerobia, y pueden ser -hemolíticas cuando crecen en condiciones
anaerobias. El aspecto a-hemolítico deriva de la producción de neumolisina, una
enzima que degrada la hemoglobina y genera un producto verde.

AGAR GELOSA SANGRE

USO
Medio de cultivo utilizado para el aislamiento de numerosos microorganismos
aerobios y anaerobios. También puede utilizarse como medio base para preparar
agar chocolate.
FUNDAMENTO
La infusión de músculo corazón y la peptona otorgan al medio un alto valor
nutritivo que permite el crecimiento de una gran variedad de microorganismos, aún
de aquellos nutricionalmente exigentes; el NaCl mantiene el balance osmótico y el
agar es el agente gelificante. El agregado de 5-10% de sangre estéril promueve el
desarrollo de bacterias exigentes en sus requerimientos nutricionales y la
adecuada observación de las reacciones de hemólisis.

PROCEDIMIENTO
Se pesa el medio de base agar gelosa sangre en agua destilada según la cantidad
que se vaya a utilizar, se calcula. Se disuelve. Se calienta con agitación frecuente
y se hierve por 1 minuto. Se esteriliza por 20 minutos a 121 °C. Se deja enfriar a
45-50 °C y se agrega sangre humana, hay que homogeneizar y distribuir en las
placas petri en un área con asepsia pertinente. Se espera que solidifique al medio
ambiente, se pueden incubar a 4 °C en refrigerado para su uso. Se inocula el
medio por el método de siembra por estriado.
Se incuba a 37 °C para que el crecimiento bacteriano se de posteriormente.

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
1. Observar las características morfológicas de las colonias.
2. Observar a contraluz para observar las reacciones de hemólisis:
a) Hemólisis beta: en este se observa una lisis total de los glóbulos rojos. Se
observa un halo transparente y se interpreta como el más patógeno. Se puede
decir que es un Streptococcus beta hemolítico.
b) Hemólisis alfa: Lisis parcial de los glóbulos rojos, se observa un halo color
verdoso alrededor de la colonia en estudio. Esto se debe a la oxidación de la
hemoglobina a metahemoglobina (compuesto de color verdoso) debido al H2O2
generado por los microorganismos. Se puede decir que se trata de un
Streptococcues alfa hemolítico.
c) Hemólisis gamma: en este hay ausencia de lisis en los glóbulos rojos, el medio
de cultivo no presenta modificaciones de color y aspecto alrededor de la colonia
en estudio. Se trata de un Streptococcus gamma hemolítico.

El cultivo en agar sangre bovina presenta colonias lisas, pequeñas, brillantes

circundadas por halo verde de alfahemólisis

Microscopía
La tinción de Gram de las muestras de esputo constituye un método rápido de
diagnosticar una neumonía y meningitis neumocócicas. Estos microorganismos
aparecen de manera característica como diplococos grampositivos en forma de
lanceta rodeados de una cápsula que no se tiñe; sin embargo, también pueden
adoptar un aspecto gramnegativo debido a su tendencia a teñirse
inadecuadamente (especialmente los cultivos antiguos). Además, su morfología
puede distorsionarse cuando el paciente ha recibido tratamiento antibiótico.
La tinción de Gram compatible con S. pneumoniae se puede
confirmar con la reacción de quellung (del alemán «hinchazón»), En esta prueba
se mezclan anticuerpos anticapsulares polivalentes con las bacterias para
después examinar la mezcla al microscopio. La presencia de mayor refringencia
alrededor de las bacterias se interpreta como una reacción positiva para S.
pneumoniae.

SENSIBILIDAD A LA OPTOQUINA
• Objetivo: diferenciar S. pneumoniae de otros estreptococos alfa hemolíticos.
• Fundamento: se basa en la sensibilidad de S. pneumoniae a una concentración
menor o igual a 5 µg/ml de hidroxicuprina (optoquina).
• Procedimiento: estriar un cuadrante de una placa de agar sangre en varias
direcciones con una suspensión Mc Farland 0,5. Colocar luego un disco de
optoquina en el centro del área estriada. Incubar 18-24 horas a 37ºC en 5-10% de
CO2.
• Interpretación de resultados: halos de inhibición iguales o mayores a 14 mm; o
iguales o mayores a 16 mm co

Ensayos de detección de antígenos: Binax NOW S. pneumoniae®

Los métodos de detección de antigenuria se han desarrollado con la intención de
resolver los problemas diagnósticos. Se basan en que algunas bacterias presentes
en animales o seres humanos producen antígenos solubles (habitualmente
polisacáridos de la cápsula) detectables en sangre, y eliminados por la orina de
forma más concentrada que en otros fluidos. Por ello, y porque en la orina no
existen otros anticuerpos que alteren los resultados, su detección es fácil e
indicativa de la presencia bacteriana en el organismo que los excreta.
Principios del procedimiento
En una membrana de nitrocelulosa se encuentran adsorbidos el anticuerpo anti-S.
pneumoniae de conejo, la línea de la muestra, y un anticuerpo antiespecie de
control, la línea de control. La tira y un pocillo para contener el hisopo con la
muestra se montan en lados contrarios de la tarjeta de la prueba, en forma de un
librillo con bisagra.
Para realizar la prueba se sumerge un hisopo en la muestra (orina o LCR), se
saca y se introduce en la tarjeta del test. Se añade una solución buffer, se cierra la
tarjeta, poniendo en contacto la muestra con la tira reactiva. Si el antígeno
neumocócico está presente en la muestra, reacciona uniéndose al anticuerpo
conjugado anti-S. pneumoniae. Los complejos antígeno-conjugados resultantes
son capturados por los anticuerpos anti-S. pneumoniae inmovilizados, formando la
línea de la muestra.
El resultado de la prueba se interpreta por la presencia o ausencia de líneas
coloreadas rosa-moradas detectables visualmente, leído a los 15 minutos. Un
resultado positivo del test incluirá ambas líneas, la línea control y la línea de la
muestra. Un resultado negativo del test producirá sólo una línea de control,
indicando que el antígeno S. pneumoniae no ha sido detectado en la muestra. Si
no se obtiene la línea de control o ninguna línea la prueba no es válida y debe
desecharse. Si el resultado es positivo débil se recomienda considerarlo negativo,
pues así aumenta la especificidad. El test puede permanecer positivo durante
varias semanas tras la infección.
El fabricante ofrece como datos de rendimiento de la prueba utilizada en orina
para el diagnóstico de neumonía, en un estudio prospectivo en pacientes
extrahospitalarios, comparando con hemocultivos, una sensibilidad 90 % (70%-
97%), una especificidad 78% (70%-85%) y una precisión 80% (72%-86%).
Inicialmente lo fabricaba el laboratorio Binax, comprado posteriormente por Alere,
que es su único distribuidor en la actualidad, en España y en el resto del mundo.
Las pruebas se adquieren en kits de 12 o 22 unidades y el precio por prueba son
unos 15 euros aproximadamente.
 REFERENCIAS

Martínez, M.(2014). DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO DE LA ENFERMEDAD

NEUMOCÓCICA: UTILIDAD DEL TEST RÁPIDO DE DETECCIÓN DEL
ANTÍGENO NEUMOCÓCICO EN ORINA EN PEDIATRÍA.
https://www.aepap.org/sites/default/files/diag.nmc3.pdf

Rodriguez, G. Streptococcus pneumoniae.

http://higiene1.higiene.edu.uy/DByV/Streptococcus%20pneumoniae%20cap
%EDtulo%20de%20libro.pdf