PRÁCTICA 2.

GEL DE AGAROSA PARA ELECTROFORESIS

(PROCEDIMIENTO DE LABORATORIO).

PARTE 1. PREPARAR LA MUESTRA PARA ELECTROFORESIS

Consideración 1: ¿Cómo puede un fragmento de ADN ser separados

unos de otros?

El ADN es incoloro así que los fragmentos en el gel no se pueden ver durante
la electroforesis. Una muestra de tampón de carga que contiene dos colorantes
azules se le añade a la solución de ADN. La solución no sirve para teñir al
ADN, pero hace más simple para ver el progreso en la electroforesis. La banda
del tinte migra hacia la parte positiva del gel, así como los fragmentos de ADN,
los más rápidos comieran con los fragmentos de ADN de aproximadamente
500Bp, mientras que los tintes más lentos que comieran con los fragmentos de
ADN son aproximadamente son 5Kb o 5000Bp en tamaño.

1. Siguiendo la incubación obtienes tus tubos de ensayo L, P, E y H, y los

sitúas en la gradilla.
L= Uncut lambda ADN (tubo amarillo)
P= lambda ADN (tubo lila)
E= Ecori que restringe la digestión de lambda ADN (verde)
H= hindill que restringe la digestión de lambda ADN (naranja)

2. Preparar la micro pipeta digital de 2 µL y transfiere esta cantidad de

muestra tampón de tinte a cada tubo marcado L, P, E y H. Usa una
punta limpia para cada muestra para que no se contamine.

3. La muestra de ADN y la muestra de tinción de carga, deben ser bien

mezcladas antes de situar las muestras en las paredes del gel para la
electrofóresis. Esto se ejecuta fácilmente si agarras la parte de arriba del
microtubos entre el dedo índice y el dedo pulgar de la mano y golpeando
el tubo en la parte inferior para que se junten todas las gotas de la pared
del tubo.
Arrastra el líquido a la parte de abajo del tubo con los suaves golpes en tu
mesa de laboratorio. Si tienes acceso a la centrifugadora, coloca los 4 tubos
de la gradilla (esos tubos ahora tienen tinte de carga y ADN) a la
centrifugadora, asegúrate de que los tubos están en una posición de
balance en el rotor. Tienes que tener a tu profesor antes de conectarla.
Pulsa “spin” (agarra la parte de abajo unos segundos) esto fuerza a todos lo
componentes a ir hacia el fondo del tubo

4. Obtén el marcador de ADN (M) de tu profesor. Opcional: Calienta una

muestra a 65ºC durante 5minutos y luego sitúala en hielo – Esto
repercute en que las bandas de ADN se separen mejor.

PARTE 2. PREPARA LA CUBETA PARA LA ELECTROFORESIS.

1. Obtén El gel agarosa de tu profesor o si el te indica las instrucciones haz

el gel.
2. Sitúa el carril del gel en la plataforma central de la caja del gel. El pozo
debe de ser negativo (cátodo) en cada caja, donde el negro eléctrico es
conectado. Con mucho cuidado quita el peine del gel, tirando de el hacia
arriba.
3. Hecha alrededor de 275mL de la tinción de carga en la cubeta
electrolítica. Hecha suficiente tampón en la caja hasta que cubra los
pozos de gel entre 1-2mm.
PARTE 3. CARGA TU MUESTRA Y HAZLAS CORRER POR
ELECTROFÓRESIS.

1. Pipetea 10µL en cada tubo M, L, P, E y H y ponlos en pocillos diferentes

de la cubeta de gel. Usa una punta limpia para cada tubo. Los geles se
len de izquierda a derecha para mantener un orden, la primera muestra
normalmente es añadida en el pocillo de la esquina izquierda del gel.
Por ejemplo:

2. Coloca la tapa a la cubeta y conecta las clavijas a la corriente ánodo a

cátodo (rojo a rojo) y cátodo a cátodo (negro a negro). Asegúrate de que
las ambas clavijas son conectadas al mismo canal de la corriente.
3. Electroforesea a 100V durante 30-40 minutos. Poco después de que la
corriente sea aplicada, la carga de tinte se puede apreciar como se
mueve a través del gel hacia la parte positiva de la cubeta de gel.
4. Cuando la electroforesis se ha completado, apaga la corriente eléctrica,
desconecta las clavijas y quita la tapa de la cubeta.
5. Quita el carril del gel de la cubeta. El gel es muy resbaladizo. Mantén el
carril recto.
6. Hecha lo que te sobre de tampón a su contenedor original para
rehusarlo si lo deseas.