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TRABAJO PRÁCTICO Nº 2

TEMA: MICROSCOPÍA. MANIPULACIÓN, MONTAJE Y OBSERVACIÓN.

OBJETIVOS

A. Identificar los distintos instrumentos que proporcionan información estructural y funcional de


las células.
B. Adquirir práctica virtual en la aplicación de técnicas de preparación, montaje y tinción de
preparados para observar al microscopio óptico.
C. Reconocer las principales características de distintos tipos celulares.

INTRODUCCIÓN
Para el estudio de los organismos o estructuras microscópicas biológicas fueron utilizados
diferentes instrumentos ópticos. Las lupas comunes, conocidas desde la antigüedad, tuvieron poca
aplicación en el estudio de las células. Pero basados sobre el mismo principio de una única lente, los
microscopios simples fueron los pioneros en este campo de la investigación biológica.
Con este instrumento, Anton Van Leeuwenhoek, observó en el siglo XVII una infinidad de células
diferentes, incluyendo a microorganismos, como las bacterias, algas y protozoos.
El microscopio óptico o microscopio compuesto o microscopio de luz, utilizado actualmente
consta básicamente de dos sistemas de lentes, separados por una distancia fija. La lente más cercana al
objeto se llama objetivo y la próxima al ojo del observador se llama ocular.
Ambos sistemas están montados sobre un tubo, cuyos movimientos están controlados por los
tornillos micro y macrométrico.
Cuando se gira el tornillo macrométrico, el tubo se desplaza apreciablemente y de este modo se
busca el objeto a observar. Luego el tornillo micrométrico, con movimientos menores, se ajusta a la
posición de los dos sistemas de lentes para que el objeto quede en el foco exacto.
Los microscopios actuales presentan varios objetivos intercambiables. Estas lentes por lo común,
tres o cuatro, están insertas en el revólver, el que cuando gira permite centrar el objetivo elegido para
la observación.
En este microscopio, las imágenes se forman con los rayos de luz que llegan al sistema de lente
después de atravesar el objeto. Para ello se apoya la muestra en una pequeña lámina de vidrio, el
portaobjetos, y éste sobre una placa con un agujero denominada platina.
Para iluminar la muestra se utiliza luz blanca reflejada sobre un espejo en la base del microscopio,
aunque en algunos casos el microscopio cuenta con un pequeño foco adosado al pie del instrumento.
Con el fin de que la iluminación sea eficiente es necesario concentrar los rayos de manera que la
mayor parte de ellos atraviesen el preparado y entren al sistema óptico: una lente o un sistema de
lentes ubicada debajo de la platina cumple esta misión y recibe el nombre de condensador.
Si el condensador se mueve hacia arriba los rayos se concentran en un área reducida con mayor
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intensidad, si se aleja de la platina, la zona iluminada es mayor aunque con menor intensidad.
Para eliminar los rayos periféricos que deforman la imagen se utiliza un diafragma ubicado por
debajo del condensador, el que se abre o cierra como su similar de la cámara fotográfica o pupila del
ojo. El diafragma no debe usarse para aumentar o disminuir la intensidad de la iluminación, su manejo
equivocado puede perjudicar un buen enfoque.

Aumento de las lentes

Se define como aumento de las lentes, a la relación entre el tamaño de la imagen obtenida de un
objeto y el tamaño real del mismo.
Cada lente lleva inscripto el aumento que puede alcanzarse con ella, estos valores son usualmente
5 X, 10 X, 40-45 X o bien 90-100 X (el signo X significa aumentos).

¿Cómo se forma la imagen?

La imagen aumentada producida por el objetivo, es tomada por el ocular y es aumentada


nuevamente. Por lo tanto, la imagen definitiva (que es invertida respecto del original) resulta del
producto entre el aumento del objetivo por el aumento del ocular. Este último suele ser de 5-15 X.
En consecuencia los aumentos mayores que pueden obtenerse con este instrumento son de 1000 -
1500 X. Esto significa que objetos de 1 micrón se verán como estructuras de 1 o 1,5 mm.

Poder de resolución

El poder de resolución de un instrumento es la capacidad de visualizar detalles de un objeto, o más


rigurosamente, la capacidad para distinguir como separados dos puntos que se hallan próximos.
El poder de resolución del ojo humano, en condiciones óptimas, es de 0,1 mm. Por lo que se
deduce que solo se podrán observar los puntos en los cuales exista, por lo menos 0,1 mm de distancia.
El límite de resolución es la inversa del poder de resolución y se define como la distancia mínima
que debe separar dos puntos para que se observen como distintos.

El límite de resolución del microscopio óptico es de 0,25 micrones, por lo que solo se pueden
observar:
- la morfología de las células procariontes.

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- la morfología de las células eucariontes y algunos de sus organelos: núcleo, nucléolo,
cloroplastos, pared celular, vacuola vegetal.
Se debe tener en cuenta que el espesor de las membranas es inferior al límite de resolución de este
microscopio, por lo que no se pueden visualizar la membrana plasmática ni los conjuntos
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membranosos como el Retículo o el Aparato de Golgi.
RECOMENDACIONES PARA EL USO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO O DE LUZ
1- Comience siempre las observaciones con el objetivo de aumento más bajo, esto le dará una visión
integral del preparado y le permitirá seleccionar las áreas de especial interés, que luego se
observarán con mayor aumento.
2- La iluminación debe ser homogénea y de buena intensidad, pero no excesiva. Con bajos aumentos
puede utilizarse luz natural, pero con aumentos mayores es preferible luz artificial.
3- Nunca acerque el objetivo al preparado si no está mirando por el costado del microscopio. Así
evitará la destrucción de muestras y de lentes.
4- Siempre que haga una observación, ajuste el enfoque con el tornillo micrométrico.
5- Recuerde que el microscopio proporciona imágenes invertidas del objeto. Cuando un detalle se
encuentra a la derecha del preparado, debe mover la platina a la izquierda, y si está arriba hacia
abajo.
6- Haga siempre un dibujo de las observaciones. Para ello, dibuje un círculo dentro del cual graficará
pocas células respetando las proporciones. Evite sobrecargar el esquema con detalles.
7- Cómo utilizar el objetivo de inmersión: El objetivo de inmersión tiene que colocarse muy cerca
del cubreobjeto y existe el peligro de romper éste o de dañar el objetivo mientras se trata de
enfocar, a menos que el enfoque se efectúe en la forma correcta, que es la siguiente:
- Luego de preseleccionar el área a investigarse utilizar el tornillo del ajuste grueso para elevar el
tubo del microscopio o descender la platina, según sea el caso, antes de girar el objetivo de
inmersión en posición.
- Aplicar una gota pequeña de aceite de inmersión al cubreobjetos, exactamente a la mitad del
condensador.
- Luego observando el extremo del objetivo de inmersión por un lado del microscopio, bajar
lentamente (o levantar la platina) hasta que el objetivo se sumerja ligeramente en la gota de
aceite.
- Un breve destello de luz indica cuando hace contacto con el aceite. Mirando por el ocular se
puede enfocar el corte, con el tornillo de ajuste fino. Si esto requiere más de un par de vueltas
parar y considerar que tal vez no hay una parte del corte bajo la lente del objetivo o si que la lente
del objetivo está ya por debajo del nivel correcto de enfoque.

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- Si se visualiza algún color se descarta la primera posibilidad, si la imagen se delinea con el
enfoque continuo probablemente está aún muy alta la lente del objetivo. Se aconseja proceder
con precaución hasta que se tenga alguna experiencia.

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OTROS TIPOS DE MICROSCOPIOS
En el microscopio de luz, al aumentar las magnificaciones, se disminuye el campo visual. La
cantidad de detalles visibles, aumenta con las magnificaciones. Para la microscopía de luz los cortes
tienen un grosor de 5 – 8  m (1m = 0.001 mm). El límite de resolución de la microscopía de luz es
de 0.2 m.
Para distinguir detalles de dos puntos más cercanos que lo anterior se requiere del uso del
microscopio electrónico. Existen dos clases de microscopio electrónico el de Transmisión (MET)
y el de Barrido (MEB).
El de Transmisión se utiliza ampliamente en histología. Puede dar aumentos hasta de 50.000 y
diferencia detalles tan cercanos como 1nm entre uno y otro punto (1nm = 0.001 m). Los cortes son
realizados con equipo especial para un grosor de 60 a 80 nm y se tiñen con metales pesados que
dispersan los electrones. Las partes del corte que se ven en color negro en la micrografía electrónica,
son electrodensos y todo el corte se presenta con enfoque en el mismo plano.
El diseño general del microscopio electrónico utilizado para el trabajo biológico de rutina se
comprende fácilmente cuando se compara con el microscopio de luz; puesto que en éste tipo de
microscopio electrónico el haz de electrones, como el rayo de luz en el microscopio de luz se
transmite a través del corte. De ahí que, este tipo de microscopio electrónico es conocido como
microscopio electrónico de transmisión. (MET). Para facilitar la interpretación en la figura se muestra
el trayecto del haz de electrones invertido, junto al trayecto del haz de luz del microscopio de luz.
Inicialmente los electrones emitidos por el cátodo (un filamento calentado) se aceleran en dirección
hacia el ánodo, por una diferencia de alto voltaje pasando a través de una perforación central para
conformar un haz, mediante un lente condensador electromagnético, que corresponde al mismo
condensador de un microscopio de luz.
No todos los electrones dirigidos hacia un corte para el microscopio electrónico pasan a través de
éste; sólo aquellos que no han sido dispersados por las regiones bloqueadoras de electrones
(electrodensas) del corte, son transmitidos a la lente del objetivo y se utilizan para formar la imagen.
Como en el microscopio de luz la lente del objetivo forma un imagen aumentada, la que a su vez es
amplificada por otro sistema de lentes que incluye una lente de proyección; equivalente a la lente del
ocular del microscopio de luz. Esta lente proyecta la imagen final, ya sea hacia una pantalla
fluorescente para su observación o hacia una película si se requiere una micrografía electrónica. De

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manera similar la lente ocular del microscopio de luz se emplea para proyectar la imagen final hacia
una película en lugar de hacia el ojo, cuando se requiere de una microfotografía.
MATERIALES
- Textos de Biología. 5
- Microscopio óptico.

ACTIVIDADES

Microscopio Binocular Estereoscópico (Lupa)

1- Observe el microscopio que posee en la mesa de trabajo y reconozca los distintos elementos que lo
forman, siguiendo el esquema que se presenta a continuación.

a. Brazo d. Anillo de aumento


b. Pie e. Oculares
c. Tornillo de enfoque f. Platina.

Microscopio Óptico Compuesto


2- Observe el microscopio que posee en la mesa de trabajo, reconozca y señale los siguientes
elementos.
a. Objetivo. h. Tornillo micrométrico.
b. Ocular. i. Revólver.
c. Cabezal (tubo binocular). j. Diafragma.
d. Platina. k. Pie.
e. Condensador. l. Fuente luminosa.
f. Brazo.
g. Tornillo macrométrico.
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3- Realice un cuadro comparativo entre los elementos ópticos que utilizará durante las
clases. 4- ¿Qué diferencias funcionales existen entre el M.O. y el M.E?
5- ¿Qué características tiene la imagen que observa respecto al objeto original?
6- ¿Cuáles son las unidades de medición para microscopia?
7- ¿Qué entiende por poder de resolución?
8- Indique que estructuras celulares podrá observar durante las clases prácticas de esta asignatura.

9- ACTIVIDADES DE LABORATORIO

Observación de células del epitelio bucal y de epidermis de cebolla


La célula es la unidad estructural y funcional de los seres vivos, es totalmente autónoma y
desarrolla funciones como las de cualquier ser vivo. En la siguiente actividad de laboratorio vamos
a comprobar que todos los organismos vivos están formados por células y para ello utilizaremos una
muestra del epitelio bucal y de a epidermis de cebolla.

a- Determinar las diferencias fundamentales entre células vegetales y animales.

Las células vegetales y animales son células eucariotas, ambas poseen membrana celular:
La célula vegetal cuenta con una pared celular de celulosa que le da rigidez, además posee cloroplastos
(organelos capaces de sintetizar azucares a partir de CO2, agua y luz solar (fotosíntesis) lo cual lo la hace
autótrofa (produce su propio alimento). También posee una vacuola única llena de líquido que ocupa casi
todo el interior de la célula. Estas células pueden reproducirse mediante un proceso que da como resultado
células iguales a la progenitora (asexual). Las células vegetales son autótrofas producen su propio alimento
mediante la fotosíntesis.
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Las células animales no pueden realizar la fotosíntesis poseen una membrana citoplasmática que la separa
del medio. Tiene muchas vacuolas pequeñas, este tipo de células realizan reproducción sexual donde los
descendientes no son idénticos al progenitor. Son heterótrofas, no producen su propio alimento.

b- Esquematice como se vería en un microscopio a distintos aumentos (4X y 10X) las células del
epitelio bucal y de la epidermis de cebolla. Por qué es importante colorear los preparados
microscópicos para observar las células?

El empleo de colorantes en la célula representa una gran ventaja ya que permite identificar con
mayor facilidad las estructuras básicas de la misma, siempre y cuando se empleen concentraciones
bajas, de lo contrario se convierte en problema porque si el colorante es muy concentrado no deja
diferenciar nada en la célula.
c- Explique cómo es la forma de cada tipo de célula mencionada y que estructuras se pueden
observar con el microscopio óptico.

En la célula vegetal de la cebolla, se observan varias celdas transparentes y luego con el colorante se
aprecia mejor la estructura de la célula de la cebolla en la cual solo se puedo observar la pared celular
delimitando al citoplasma que a su vez rodea al núcleo.

En las células del epitelio bucal, una visión parecida a un mosaico formado por células planas,
poligonales, irregulares; abundan las células aisladas. Se observa en cada célula unos puntos oscuros
de color azul debido al colorante, los cuales corresponden al núcleo rodeado este y delimitado por la
membrana celular.

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d- Indique para la célula animal y vegetal qué organelas no pudieron ser observados con el
microscopio de óptico y razone el por qué.
e- Explique que es el de límite de resolución y límite de detección, de un ejemplo de cada uno.

 Límite de resolución: es la distancia mínima a la que se pueden ver dos objetos separados. Viene
definido por una fórmula en la que las principales variables son la longitud de onda de la luz y la
apertura numérica del objetivo, pero en la práctica, y asumiendo la máxima calidad de las lentes, es
aproximadamente la mitad de la longitud de onda de la luz con la que se observa. En microscopía
de campo claro es 0,2 micras, el microscopio óptico de efecto túnel cuántico permite superar esta
barrera y aumentar la resolución por debajo de 0,1 micras.

 El límite de detección (LDD): se define habitualmente como la cantidad o


concentración mínima de sustancia que puede ser detectada con fiabilidad por
un método analítico determinado. Intuitivamente, el LDD sería la concentración
mínima obtenida a partir de la medida de una muestra (que contiene el analito)
que seríamos capaces de discriminar de la concentración obtenida a partir de
la medida de un blanco, es decir, de una muestra sin analito presente.
f- Qué estructuras pueden ser observadas en un microscopio electrónico de Transmisión (MET) y el
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de Barrido (MEB)?

 Microscopio electrónico de transmisión (MET): permite la observación de muestra en cortes


ultrafinos. Un TEM dirige el haz de electrones hacia el objeto que se desea aumentar. Una
parte de los electrones rebotan o son absorbidos por el objeto y otros lo atraviesan formando
una imagen aumentada del espécimen. Para utilizar un TEM debe cortarse la muestra en capas
finas, no mayores de un par de miles de ángstroms. Se coloca una placa fotográfica o una
pantalla fluorescente detrás del objeto para registrar la imagen aumentada. Los microscopios
electrónicos de transmisión pueden aumentar un objeto hasta un millón de veces.

 Microscopio electrónico de barrido (MEB): crea una imagen ampliada de la superficie de un


objeto. No es necesario cortar el objeto en capas para observarlo con un SEM, sino que puede
colocarse en el microscopio con muy pocos preparativos. El SEM explora la superficie de la
imagen punto por punto, al contrario que el TEM, que examina una gran parte de la muestra
cada vez. Su funcionamiento se basa en recorrer la muestra con un haz muy concentrado de
electrones, de forma parecida al barrido de un haz de electrones por la pantalla de una
televisión. Los electrones del haz pueden dispersarse de la muestra o provocar la aparición de
electrones secundarios. Los electrones perdidos y los secundarios son recogidos y contados por
un dispositivo electrónico situado a los lados del espécimen. Cada punto leído de la muestra
corresponde a un píxel en un monitor de televisión. Cuanto mayor sea el número de electrones
contados por el dispositivo, mayor será el brillo del píxel en la pantalla. A medida que el haz
de electrones barre la muestra, se presenta toda la imagen de la misma en el monitor. Los
microscopios electrónicos de barrido pueden ampliar los objetos 200.000 veces o más. Este
tipo de microscopio es muy útil porque, al contrario que los TEM o los microscopios ópticos,
produce imágenes tridimensionales realistas de la superficie
del objeto.
g- Respecto a las organelas propias de cada tipo celular observado mencione las principales
funciones de cada una.