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BIORREMEDIACIÓN DE AGUAS CONTAMINADAS CON NUTRIENTES Y FÁRMACOS MEDIANTE MICROALGAS

BIORREMEDIACIÓN DE AGUAS CONTAMINADAS


CON NUTRIENTES Y FÁRMACOS
MEDIANTE MICROALGAS
Departamento de Química y Física Aplicadas
Instituto de Medio Ambiente, Recursos Naturales y Biodiversidad
Universidad de León

Carla Escapa Santos


Carla
Escapa León, 2017
Santos

UNIVERSIDAD DE LEÓN
INSTITUTO DE MEDIO AMBIENTE, RECURSOS NATURALES Y
BIODIVERSIDAD
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA Y FÍSICA APLICADAS


TESIS DOCTORAL

BIORREMEDIACIÓN DE AGUAS CONTAMINADAS CON


NUTRIENTES Y FÁRMACOS MEDIANTE MICROALGAS

Bioremediation of contaminated waters


with nutrients and pharmaceuticals by microalgae



Dirigida por: Presentada por
Dra. Ana Isabel García Pérez Carla Escapa Santos
Dra. Marta Otero Cabero para optar al grado de Doctor

León, 2017
Tesis Doctoral por compendio de publicaciones

Nutrients and pharmaceuticals removal from wastewater by culture and harvesting of


Chlorella sorokiniana

Escapa C, Coimbra R.N, Paniagua S, García A.I, Otero M

Bioresource Technology, 185 (2015): 276‐284

Paracetamol and salicylic acid removal from contaminated water by microalgae

Escapa C, Coimbra R.N, Paniagua S, García A.I, Otero M

Journal of Environmental Management, (2016) doi: 10.1016/j.jenvman.2016.06.051

Comparison of the culture and harvesting of Chlorella vulgaris and Tetradesmus obliquus
for the removal of pharmaceuticals from water

Escapa C, Coimbra R.N, Paniagua S, García A.I, Otero M

Journal of Applied Phycology, (2016) doi: 10.1007/s10811‐016‐1010‐5

Comparative assessment of diclofenac removal from water by different microalgae strains

Escapa C, Coimbra R.N, Paniagua S, García A.I, Otero M

Algal Research, 18 (2016): 127‐134

Ability of microalgae bioremediation systems to reduce the toxicity of pharmaceuticals


contaminated waters. Toxicity assessment with zebrafish (Danio rerio) embryo bioassays

Escapa C, Torres T, Neuparth T, Santos M.M, García A.I, Otero M

Enviado a Water Reseach (marzo de 2017)


Agradecimientos

Quiero expresar mi agradecimiento más sincero a mi directora de tesis, Ana Isabel García,
por haber confiado en mí y ofrecerme la oportunidad de realizar esta tesis; a mi directora
Marta Otero, por transmitirme su pasión por la investigación y por su incondicional apoyo; y a
todas aquellas personas que bien desde el ámbito profesional o desde el personal han hecho
posible el desarrollo de esta investigación.

A todos ellos, gracias.


Financiación

Esta tesis se ha podido desarrollar gracias a la concesión de una beca del Programa de
Formación de Profesorado Universitario (FPU) del Ministerio de Educación, Cultura y Deporte
(FPU12/03073). Dentro del desarrollo de la beca se realizó una estancia en el centro de
investigación Interdisciplinary Centre of Marine and Environmental Research en el laboratorio del
Dr. Miguel Alberto Fernandes Machado e Santos (Porto, Portugal). Además, se ha contado con la
financiación de la Universidad de León a través de la concesión del proyecto MICROTRAT
(proyecto UXXI2016/00128).
Tabla de contenido

Tabla de contenido ............................................................................................................................. IX 

Resumen .............................................................................................................................................XIII 

Abstract ............................................................................................................................................. XV 

Capítulo 1. Introducción general ......................................................................................................... 1 

1.1. Justificación de la unidad temática ................................................................................................. 3 

1.2. Presentación de las publicaciones ................................................................................................... 4 

Capítulo 2. Antecedentes ................................................................................................................... 7 

2.1. La problemática de las aguas residuales ......................................................................................... 9 

2.2. Los contaminantes emergentes ...................................................................................................... 10 

2.3. Los fármacos como contaminantes emergentes ............................................................................. 13 

2.4. Efectos y riesgos de la presencia de fármacos en el medio ambiente ............................................ 16 

2.5. Sistemas de tratamiento en la eliminación de contaminantes emergentes del agua .................... 18 

2.5.1. Sistemas convencionales ......................................................................................................... 18 

2.5.2. Tratamientos avanzados ......................................................................................................... 20 

2.5.3. Tratamientos alternativos ....................................................................................................... 24 

2.6. Utilización de las microalgas en el tratamiento de aguas residuales .............................................. 26 

2.6.1. Implementación en los sistemas de tratamiento de aguas residuales convencionales .......... 28 

2.6.2. Mecanismos de eliminación de nitrógeno y fósforo ................................................................ 31 

2.6.3. Mecanismos de eliminación de contaminantes emergentes .................................................. 32 

2.6.4. Separación de la biomasa ....................................................................................................... 33 

2.7. Referencias bibliográficas ................................................................................................................ 34 

Capítulo 3. Objetivos .......................................................................................................................... 51 

3.1. Objetivos .......................................................................................................................................... 53 

IX
Capítulo 4. Artículo I ........................................................................................................................... 55 

Nutrients and pharmaceuticals removal from wastewater by culture and harvesting  

of Chlorella sorokiniana .......................................................................................................................... 57 

Capítulo 5. Artículo II .......................................................................................................................... 71 

Paracetamol and salicylic acid removal from contaminated water by microalgae ................................ 73 

Capítulo 6. Artículo III ......................................................................................................................... 87 

Comparison of the culture and harvesting of Chlorella vulgaris and Tetradesmus obliquus  

for the removal of pharmaceuticals from water .................................................................................... 89 

Capítulo 7. Artículo IV ......................................................................................................................... 105 

Comparative assessment of diclofenac removal from water by different microalgae strains ............... 107 

Capítulo 8. Artículo V .......................................................................................................................... 115 

Ability of microalgae bioremediation systems to reduce the toxicity of pharmaceuticals  

contaminated waters. Toxicity assessment with zebrafish (Danio rerio) embryo bioassays ................. 117 

Capítulo 9. Resumen de resultados y discusión ................................................................................... 135 

9.1. Crecimiento de las microalgas durante la biorremediación de aguas contaminadas  

con fármacos ..................................................................................................................................... 137 

9.1.1. Efectos del paracetamol sobre el crecimiento ......................................................................... 137 

9.1.2. Efectos del ácido salicílico sobre el crecimiento ...................................................................... 138 

9.1.3. Efectos del diclofenaco sobre el crecimiento ........................................................................... 139 

9.2. Eliminación de nutrientes durante la biorremediación de aguas contaminadas  

con fármacos ..................................................................................................................................... 142 

9.2.1. Eliminación de nutrientes bajo la presencia de paracetamol .................................................. 142 

9.2.2. Eliminación de nutrientes bajo la presencia de ácido salicílico ............................................... 144 

9.2.3. Eliminación de nutrientes bajo la presencia de diclofenaco .................................................... 146 

X
9.3. Eliminación de fármacos durante la biorremediación de aguas contaminadas .............................. 149 

9.3.1. Eliminación de paracetamol .................................................................................................... 150 

9.3.2. Eliminación de ácido salicílico ................................................................................................. 151 

9.3.3. Eliminación de diclofenaco ...................................................................................................... 152 

9.3.4. Eliminación de altas concentraciones relativas de paracetamol y ácido salicílico .................. 156 

9.4. Coagulación‐floculación como sistema de separación de la biomasa de microalgas  

del agua tratada ................................................................................................................................ 158 

9.4.1. Coagulación‐floculación mediante sales metálicas ................................................................. 158 

9.4.2. Coagulación‐floculación mediante polielectrolitos sintéticos ................................................. 161 

9.4.3. Coagulación‐floculación mediante chitosan ........................................................................... 164 

9.5. Efectos sobre el desarrollo embrionario del pez cebra (Danio rerio) para evaluar  

la toxicidad de los efluentes .............................................................................................................. 166 

9.5.1. Bioensayos con paracetamol .................................................................................................. 167 

9.5.2. Bioensayos con ácido salicílico ................................................................................................ 169 

9.5.3. Bioensayos con diclofenaco ..................................................................................................... 170 

9.6. Referencias bibliográficas ................................................................................................................ 172 

Capítulo 10. Conclusiones ....................................................................................................................177 

10.1. Conclusiones .................................................................................................................................. 179 

10.2. Conclusions .................................................................................................................................... 181 

XI
Resumen
La presente tesis se centra en el estudio de la aplicación de las microalgas como sistema de
biorremediación de aguas contaminadas por nutrientes y fármacos. Para ello se determinó la
influencia de la presencia de fármacos sobre el crecimiento de las especies Chlorella sorokiniana,
Chlorella vulgaris y Scenedesmus obliquus. Estas especies fueron cultivadas en fotobiorreactores
tipo columna de burbujeo bajo condiciones controladas en modo discontinuo y semicontinuo.
Tanto las curvas como los parámetros de crecimiento correspondientes mostraron que la
presencia de fármacos no afectó negativamente al desarrollo de los cultivos, presentando, en la
mayoría de los casos, un incremento significativo de la concentración de biomasa.

La eficiencia en la eliminación de nitratos y fosfatos de las especies de microalgas antes


referidas se evaluó en función de los valores alcanzados al final del cultivo discontinuo y durante
el estado estacionario del cultivo semicontinuo. La presencia de los fármacos estudiados no
interfirió con la eliminación de nutrientes en ningún caso. Al final del cultivo discontinuo se
alcanzó en todos los casos una eliminación casi completa de ambos nutrientes. Sin embargo,
durante el estado estacionario del cultivo semicontinuo, fue S. obliquus la especie que alcanzó las
mayores eficiencias de eliminación de nutrientes.

Para abordar la eficiencia de eliminación de los fármacos paracetamol, ácido salicílico y


diclofenaco mediante las microalgas aquí presentadas, se estudió la cinética de eliminación
durante el cultivo discontinuo así como la tasa de eliminación durante el estado estacionario del
cultivo semicontinuo. Los resultados obtenidos indican la viabilidad de la utilización de las
microalgas aquí estudiadas como sistema de biorremediación. Comparando los tres fármacos, el
ácido salicílico fue el fármaco eliminado con una mayor eficiencia, mostrando C. sorokiniana y
S. obliquus los mejores resultados. Contrariamente, el paracetamol fue el fármaco que se eliminó
con una peor eficiencia. Además, ha quedado demostrada no solo la resistencia, sino también la
capacidad de eliminación de altas concentraciones relativas de paracetamol y ácido salicílico
mediante C. sorokiniana.

Con el objetivo de proponer una opción para la separación de la biomasa del efluente
tratado, se evaluaron las eficiencias de diferentes agentes floculantes y dosis en la recuperación
de la biomasa de las especies C. sorokiniana, C. vulgaris y S. obliquus. Los floculantes estudiados
fueron sales metálicas (AlCl3 y FeCl3), polielectrolitos sintéticos (CH‐35 y CH‐15) y un floculante
orgánico (chitosan). A pesar de que los polielectrolitos permitieron recuperaciones de la biomasa
prácticamente inmediatas (1 minuto), la viscosidad del flóculo generado apuntó hacia las sales
metálicas como la mejor opción.

XIII

Finalmente, con el fin de evaluar la capacidad de las microalgas en la disminución de la


toxicidad de los efluentes tratados, se realizaron bioensayos de desarrollo embrionario del pez
cebra (Danio rerio), estudiando los efectos producidos sobre la mortalidad y las anomalías
morfológicas en diferentes estados de desarrollo. La eficiencia de las microalgas en la disminución
de la toxicidad se evaluó comparando dichos efectos con aquellos producidos por la dosis inicial
del fármaco. Así se pudo comprobar que los sistemas de biorremediación mediante C. sorokiniana,
C. vulgaris y S. obliquus no solo fueron capaces de reducir la concentración de fármacos en el agua
tratada, sino también su toxicidad. Por lo tanto, la eliminación de paracetamol, ácido salicílico y
diclofenaco mediante estas especies de microalgas no dio lugar a productos de transformación
tóxicos, lo que es de suma importancia de cara a su aplicación en la biorremediación de aguas
contaminadas con fármacos.

XIV

Abstract

The present thesis is focused on the study of the ability of microalgae as bioremediation
system of contaminated waters by nutrients and pharmaceuticals. For this purpose, the influence
of pharmaceuticals in the growth of the strains Chlorella sorokiniana, Chlorella vulgaris and
Scenedesmus obliquus was determined. These microalgae strains were cultivated in bubbling
column photobioreactors under controlled conditions in batch and semicontinuous mode. Growth
curves and parameters pointed out that the culture was not negatively affected by the presence of
pharmaceuticals, showing in most of the cases a significant increase of the biomass concentration.

The efficiency in the removal of nitrates and phosphates by the microalgae strains
aforementioned was evaluated according to the values obtained at the end of the batch culture
and at the steady state of the semicontinuous culture. The presence of the studied
pharmaceuticals did not interfere in the removal of nutrients in any case. At the end of the batch
culture, the removal of nutrients was nearly complete in all cases. However, at the steady state of
the semicontinuous culture, S. obliquus was the strain that reached the highest efficiencies in the
removal of nutrients.

To address the removal efficiency of the pharmaceuticals paracetamol, salicylic acid and
diclofenac by the microalgae here considered, the removal kinetics during batch culture as well as
the removal rate during the steady state of the semicontinuous culture were determined. The
results obtained pointed to the feasibility of the microalgae here studied as bioremediation
system. Among the three pharmaceuticals, salicylic acid was the most efficiently removed, and the
best results were obtained with C. sorokininana and S. obliquus. Contrary, paracetamol was the
poorest efficiently removed. Furthermore, the robustness and the removal efficiency of
C. sorokiniana under relative high concentrations of paracetamol were proved.

After treatment, aiming to find out a way to separate the microalgae biomass from the
treated effluent, the efficiencies of different flocculants and doses were evaluated in the recovery
of the biomass of the strains C. sorokiniana, C. vulgaris y S. obliquus. Metal salts (AlCl3 and FeCl3),
synthetic polyelectrolytes (CH‐35 and CH‐15) and an organic flocculant (chitosan) were assessed.
In spite of polyelectrolytes being able to recover biomass almost immediately (1 minute), the floc
viscosity pointed to metal salts as the best option.

XV

Finally, in order to assess the ability of microalgae to reduce the toxicity of the treated
effluents, embryonic development bioassays of zebrafish (Danio rerio) were performed, studying
the effects over the mortality and morphological abnormalities in different developmental stages.
The microalgae efficiency in the toxicity reduction was evaluated by comparing these effects with
those produced by the initial concentration of pharmaceuticals. In this way, it was verified that
bioremediation systems by C. sorokiniana, C. vulgaris and S. obliquus not only reduced the
pharmaceutical concentration but also the toxicity of the effluents. Therefore, the removal of
paracetamol, salicylic acid and diclofenac by these microalgae strains did not result in toxic
transformation products, which is utmost important for their application in the bioremediation of
pharmaceutical contaminated waters.

XVI


Capítulo 1

Introducción general


Introducción general

1.1 JUSTIFICACIÓN DE LA UNIDAD TEMÁTICA

En los últimos años se ha despertado una gran preocupación social y científica tras la
detección de nuevos contaminantes en diferentes matrices ambientales de los que se desconocen
los potenciales efectos adversos que pueden generar sobre la salud humana y el medio ambiente.
Estos contaminantes emergentes incluyen una amplia variedad de productos de uso diario con
aplicaciones tanto industriales como domésticas. Entre ellos, los fármacos han recibido una especial
atención debido a que su presencia en el medio ambiente puede ocasionar respuestas fisiológicas
en organismos para los que no fueron destinados. El hecho de que hayan sido detectados en aguas
superficiales, subterráneas, marinas e incluso en aguas potables, está relacionado con la
incapacidad de las estaciones de depuración de aguas residuales (EDARs) para eliminar estos
compuestos. A esta ineficaz eliminación, se suma la falta de regulación en cuanto a las
concentraciones máximas admisibles en el medio ambiente para la gran mayoría de los
contaminantes emergentes.

La preocupación por la presencia de productos farmacéuticos en el medio acuático ha llevado


a la reciente consideración de estos compuestos en la normativa europea en la Directiva Marco del

Agua (2000/60/CE) . Fue en la Propuesta de la Comisión Europea de 31 de enero de 2012 , cuando se


propuso la inclusión en la lista de sustancias prioritarias de tres fármacos, diclofenaco, 17‐beta‐

estradiol (E2) y 17‐alfa‐etinilestradiol (EE2). Finalmente, la Decisión de la UE 2015/495 , incluyó


estos compuestos, junto con la estrona (E1) y tres antibióticos (azitromicina, claritromicina y
eritromicina), en la primera lista de observación, formada por aquellas sustancias que deben
vigilarse en todos los Estados miembros para respaldar futuras revisiones de la lista de sustancias
prioritarias.

Directiva 2000/60/CE del Parlamento Europeo y del Consejo, de 23 de octubre de 2000, por la que se establece un
marco comunitario de actuación en el ámbito de la política de aguas. Diario Oficial de las Comunidades Europeas,
22‐12‐2000, L327/1‐L327‐73.
Propuesta COM(2011) 876 final de Directiva del Parlamento Europeo y del Consejo, de 31 de enero de 2012, por la
que se modifican las Directivas 2000/60/CE y 2008/105/CE en cuanto a las sustancias prioritarias en el ámbito de
la política de aguas. https://ec.europa.eu/transparency/regdoc/rep/1/2011/ES/1‐2011‐876‐ES‐F1‐1.pdf.
Decisión de la Ejecución (UE) 2015/495 de la Comisión, de 20 de marzo de 2015, por la que se establece una lista
de observación de sustancias a efectos de seguimiento a nivel de la Unión en el ámbito de la política de aguas, de
conformidad con la Directiva 2008/105/CE del Parlamento Europeo y del Consejo. Diario Oficial de la Unión
Europea, 24‐3‐2015, L78/40‐L78/42.

3
CAPÍTULO 1

Los sistemas biológicos han surgido como una alternativa sostenible y económicamente
rentable en el tratamiento de aguas residuales para la eliminación de contaminantes emergentes.
Entre ellos, la biorremediación con microalgas, a pesar de poco estudiada, ha sido presentada como
una opción prometedora. Las microalgas se caracterizan por tener altas eficiencias fotosintéticas,
altas tasas de crecimiento, una amplia adaptabilidad a diferentes condiciones de cultivo y una gran
capacidad para eliminar nutrientes inorgánicos del agua. La principal ventaja del uso de microalgas
en la eliminación de nutrientes en los sistemas convencionales de tratamiento del agua, es que
permite reciclar el nitrógeno y fósforo asimilado en la biomasa, además de originar un efluente con
elevada concentración de oxígeno disuelto. Sin embargo, a pesar de que la capacidad de las
microalgas en la eliminación de nutrientes del agua ya ha sido demostrada, el conocimiento sobre
la capacidad de eliminación de contaminantes emergentes, y más aún en fármacos, es un campo de
reciente investigación.

1.2. PRESENTACIÓN DE LAS PUBLICACIONES

La presente tesis es un compendio de cinco publicaciones en las que se estudian diferentes


aspectos sobre la aplicación de las microalgas en sistemas de biorremediación de aguas
contaminadas por nutrientes y fármacos.

En el Capítulo 4 (Artículo I) “Nutrients and pharmaceuticals removal from wastewater by


culture and harvesting of Chlorella sorokiniana”, se estudia la capacidad de C. sorokiniana para la
eliminación de paracetamol y ácido salicílico del agua. Además, se estudia la eliminación simultánea
de nitratos y fosfatos del medio. Finalmente, se propone la floculación como sistema de cosechado
de la biomasa, estudiando diferentes agentes coagulantes‐floculantes y dosis.

En el Capítulo 5 (Artículo II) “Paracetamol and salicylic acid removal from contaminated
water by microalgae” se evalúa la viabilidad de la microalga Chlorella sorokiniana, como sistema de
tratamiento para la eliminación de paracetamol y ácido salicílico de aguas con altas
concentraciones relativas de dichos fármacos.

En el Capítulo 6 (Artículo III) “Comparison of the culture and harvesting of Chlorella


vulgaris and Tetradesmus obliquus for the removal of pharmaceuticals from water” se comparan las
especies C. vulgaris y T. obliquus como sistema para la eliminación de paracetamol y ácido salicílico
del agua. Así mismo, se determina la influencia de la presencia de dichos fármacos en la eliminación
de nutrientes mediante microalgas. Finalmente, se comparan ambas especies respecto a su
capacidad de floculación con el objetivo de recuperar la biomasa.

4
Introducción general

En el Capítulo 8 (Artículo IV) “Comparative assessment of diclofenac removal from water


by different microalgae strains” se evalúa la eliminación de diclofenaco del agua mediante
microalgas. Además, considerando la aplicación de las microalgas en el tratamiento de aguas
residuales, se estudia la influencia de la presencia de este fármaco en la eliminación de nutrientes.
Para llevar a cabo este estudio, se seleccionaron las especies Chlorella sorokiniana, Chlorella
vulgaris y Scenedesmus obliquus, con el objetivo de comparar las eficiencias obtenidas por las
diferentes especies.

En el Capítulo 9 (Artículo V) “Ability of microalgae bioremediation systems to reduce the


toxicity of pharmaceuticals contaminated waters. Toxicity assessment with zebrafish (Danio rerio)
embryo bioassays” se evalúa la disminución de la toxicidad del efluente obtenido tras la
biorremediación de fármacos mediante microalgas. Los bioensayos sobre el desarrollo embrionario
de Danio rerio permiten evaluar los efectos generados por las concentraciones residuales de
diclofenaco, paracetamol y ácido salicílico tras la biorremediación con Chlorella sorokiniana,
Chlorella vulgaris y Scenedesmus obliquus; y compararlos con los efectos que producirían sin el
tratamiento mediante microalgas.

5

Capítulo 2

Antecedentes
Antecedentes

2.1. LA PROBLEMÁTICA DE LAS AGUAS RESIDUALES

El rápido desarrollo humano y económico, junto con el uso inadecuado del agua, han
generado un preocupante deterioro de la calidad del medio ambiente acuático. Durante décadas,
toneladas de sustancias biológicamente activas han sido vertidas sin reparar en las posibles
consecuencias. Las aguas residuales urbanas, industriales y las de origen agrícola o ganadero son
las principales vías de contaminación del medio acuático. Además, el incremento en el consumo
del agua y el descubrimiento de nuevos contaminantes deja patente la necesidad de investigar en
aquellas áreas que puedan contribuir a proteger la salud humana y el medio ambiente, además de
conseguir un uso sostenible del agua.

En la actualidad, las EDARs tienen que hacer frente por una parte, a una mayor
concentración de contaminantes convencionales y por otra parte, a la aparición de nuevos
contaminantes. La Directiva 98/15/CE de 27 de febrero, que modifica la Directiva 91/271/CE de 21
de mayo en su Anexo I, establece los requerimientos para las descargas de EDARs en áreas con
riesgo de eutrofización, estableciendo el límite en 2 mg l-1 la concentración de fósforo total y en
15 mg l-1 la concentración de nitrógeno total. Además, la Directiva 91/271/CE de 21 de mayo,
sobre el tratamiento de aguas residuales urbanas, establece los límites en Demanda Biológica de
Oxígeno (DBO5) en 25 mg l-1 O2, Demanda Química de Oxígeno (DQO) en 125 mg l-1 O2 y Sólidos
Suspendidos Totales (SST) en 35 mg l-1. Por otra parte, ciertos compuestos como son los
hidrocarburos aromáticos policíclicos, los plaguicidas y algunos metales han sido evaluados para
el cumplimiento de los criterios sanitarios de la calidad del agua de consumo humano en
cumplimiento de la Directiva 98/83/CE de 3 de noviembre. Otros, como es el caso de los
contaminantes emergentes se encuentran en reciente fase de control. Algunos de ellos han sido
incluidos en la lista de sustancias prioritarias (Directiva 2008/105/CE), otras se encuentran tan
solo en una fase de evaluación, formando parte de una lista de observación (Decisión de la
Ejecución (UE) 2015/495 de la Comisión).

A pesar de que progresivamente se han ido adoptando medidas legislativas para reducir la
contaminación del agua y los riesgos derivados, es necesario seguir investigando en todas
aquellas áreas que puedan contribuir a proteger la salud humana y la del medio ambiente.

9
CAPÍTULO 2

2.2. LOS CONTAMINANTES EMERGENTES

El reciente desarrollo de nuevos y más sensible métodos analíticos, ha permitido identificar


y cuantificar nuevos contaminantes en el agua, cuya presencia en el medio ambiente no es
necesariamente nueva. A pesar de que estos compuestos han sido detectados en concentraciones
de µg l-1 o ng l-1 en aguas naturales, se ha despertado una creciente preocupación social y científica
debido a los potenciales efectos adversos que estos contaminantes pueden generar sobre la salud
humana y el medio ambiente. Además, debido a su elevada producción y consumo, su
introducción en el medio ambiente es continua, lo hace que no necesiten ser persistentes para
encontrarse en el medio ambiente y ocasionar efectos negativos (Petrovic et al., 2003).

Entre los contaminantes emergentes se incluyen una amplia variedad de productos de uso
diario con aplicaciones tanto industriales como domésticas, como son compuestos farmacéuticos,
productos de cuidado e higiene personal, drogas de abuso, plaguicidas, aditivos industriales, etc.
(Tabla 2.1). Muchos de estos compuestos han sido detectados en las aguas residuales de plantas
de tratamiento y también en aguas superficiales, subterráneas, marinas e incluso en aguas
potables (Benotti et al., 2009; Bester et al., 2001; Bono-Blay et al., 2012; Brausch and Rand, 2011;
Deblonde and Cossu-Leguille, 2011; Kuster et al., 2008; Pal et al., 2010).

La presencia de estos contaminantes en aguas naturales está relacionada principalmente


con la incapacidad de las EDARs de eliminar estos compuestos y los metabolitos y/o productos de
degradación originados, que pueden ser incluso más tóxicos que los compuestos
originales (Petrie et al., 2015). A esta ineficaz eliminación, se suma la falta de regulación en cuanto
a las concentraciones máximas que se pueden verter en el medio ambiente para la gran mayoría
de los contaminantes emergentes.

A pesar de haberse registrado más de 10.000 sustancias potencialmente peligrosas en la


Unión Europea, en la actualidad tan solo 45 compuestos han sido identificados como prioritarios
por la Directiva Marco del Agua y recogidos en las Normas de Calidad Ambiental según la
Directiva 2008/105/CE, en la que se fijan las concentraciones máximas admisibles en el agua.
Otros, se encuentran actualmente en fase de evaluación para su posible inclusión en la lista de
sustancias prioritaria en futuras revisiones, formando parte actualmente de la primera lista de
observación.

10
Antecedentes

Tabla 2.1 Principales contaminantes emergentes (García-Navas, 2013).

Antibióticos, analgésicos, antiinflamatorios, antidepresivos,


Productos farmacéuticos ansiolíticos, reguladores de lípidos, β- bloqueadores, medios de
contraste para rayos X

Drogas de abuso Cocaínicos, anfetamínicos, cannabinoides, opiáceos, alucinógenos

Hormonas esteroideas Estradiol, estrona, estriol, dietilestilbestrol

Fragancias, nitropolicíclicos, macrocíclicos, parabenos,


Productos de cuidado personal
antimicrobianos

Agentes para la protección solar Benzofenona, metilbenzilideno

Repelentes N N-dietil-toluamida

Antisépticos Triclosán o clorofeno

Agentes de limpieza y detergentes Alquifenoles y carboxilados alquifenoles

Retardantes de llama Éteres polibromados

Agentes y aditivos industriales 2-cloroetilfosfato

Aditivos para la gasolina Éteres de aquilos o éter metil-t-butilo

Subproductos de la desinfección Bromoácidos, bromoacetonitrilos, bromatos

Otras sustancias Nicotina, cafeína

En las últimas décadas, muchas organizaciones de reconocida relevancia han tomado


conciencia del problema, teniendo entre sus líneas de investigación prioritarias la problemática
de los contaminantes emergentes, como la Organización Mundial para la Salud (OMS), la Unión
Europea (EU), el Programa de Naciones Unidas para el Medio Ambiente (OMS, PNUMA), la
Agencia para la Protección medioambiental de Estados Unidos (EPA) o el Programa Internacional
de Seguridad Química (IPCS). Por ello, la comunidad científica ha realizado un gran esfuerzo para
determinar la presencia y la concentración de los contaminantes emergentes en las complejas
matrices ambientales, para evaluar los posibles efectos en la salud y el medio ambiente y para
investigar sobre tratamientos alternativos de aguas residuales capaces de eliminar estos

11
CAPÍTULO 2

contaminantes de los vertidos. Prueba de ello es la publicación en los últimos años, de numerosos
artículos y revisiones bibliográficas en este área de investigación (de Wilt et al., 2016; García-
Rodríguez et al., 2014; Gupta et al., 2015; Luo et al., 2014; Matamoros et al., 2016; Norvill et al.,
2016; Tiedeken et al., 2017). La investigación sobre contaminantes emergentes pretende
promover medidas que permitan mejorar la calidad de las aguas, optimizar la explotación de los
recursos hídricos y proteger la salud del hombre y del medio ambiente. En este sentido, se pueden
distinguir tres líneas principales de investigación que se plantean a seguir.

El primer paso para dar respuesta a la problemática que plantean los contaminantes
emergentes ha sido desarrollar nuevos y más sensibles métodos analíticos que permitan la
determinación de estos contaminantes en las complejas matrices ambientales, tales como las
aguas superficiales y subterráneas, las aguas residuales y los suelos. La cromatografía líquida y
gaseosa acoplada a espectrometría de masas simple o en tándem, son las técnicas analíticas
actualmente utilizadas para este propósito, las cuales permiten detectar estos compuestos a muy
bajas concentraciones, del orden de partes por billón o partes por trillón. Además, es necesario el
desarrollo de protocolos para la toma de muestras y preparación previa al análisis. En el caso de
los fármacos, su utilización y consumo resulta en la excreción del propio fármaco inalterado junto
con subproductos del metabolismo, en proporciones muy variables según el fármaco, la dosis, el
individuo, etc. La identificación analítica de los subproductos de eliminación del metabolismo tras
el consumo del fármaco, resulta muy difícil debido a la escasez de patrones y a las técnicas de
identificación, lo que hace necesario disponer de protocolos que permitan su identificación,
además de determinar su toxicidad.

El siguiente paso, comprende la evaluación del destino y biodisponibilidad de estos


contaminantes en el medio ambiente, ya que es necesario conocer la concentración de estos
compuestos que llega a los tejidos sobre los que tienen efecto. Además, es necesario investigar
sobre el tipo de transformaciones que experimentan los contaminantes emergentes en los
procesos de depuración de aguas residuales así como en el propio medio ambiente acuático.
Así mismo, resulta imprescindible estudiar los efectos potenciales de estos compuestos sobre el
medio ambiente y la salud. Estos estudios de toxicidad deben comprender los metabolitos y
productos de degradación, además de los compuestos originales.

Por último, otra de las líneas de investigación prioritarias se centra en el estudio de


tratamientos de aguas residuales alternativos que permitan reducir su introducción en el medio
ambiente por esta vía, ya que en la actualidad constituye la principal fuente de los contaminantes
emergentes en el medio ambiente (Chaukura et al., 2016; Hwang et al., 2016; Karaolia et al., 2017;
Philippe et al., 2016; Rozas et al., 2016; Wang and Wang, 2017; Wang et al., 2016).

12
Antecedentes

2.3. LOS FÁRMACOS COMO CONTAMINANTES EMERGENTES

Entre los contaminantes emergentes, los que probablemente han suscitado una mayor
preocupación y estudio en los últimos años son los fármacos. El consumo de fármacos se está
incrementando en un 3-4% cada año, por lo que miles de toneladas de fármacos se vierten al agua
anualmente (Figura 2.1) (OECD, 2017).

Las primeras evidencias de la presencia de fármacos en el agua se remontan a los años 70


con la detección de ácido clofíbrico en las aguas residuales de EEUU, utilizado para disminuir los
niveles de lípidos en sangre. Sin embargo, no fue hasta principios de la década de los 90 cuando la
preocupación sobre los efectos en el medio ambiente y la salud tomó un mayor peso en la
sociedad, como demuestran los numerosos artículos publicados desde entonces (Halling-
Sorensen et al., 1998; Hom-Díaz et al., 2015; Sanderson et al., 2004; Villaescusa et al., 2011).
Actualmente, en la Unión Europea se han cifrado en 3.000 los distintos tipos de fármacos
disponibles en el mercado (Kümmerer, 2003).

60000
Dosis diaria/ 1000 habitantes día

50000

40000

30000

20000

10000

Figura 2.1 Tendencia en el consumo de fármacos de los países europeos pertenecientes a la OECD (adaptación de
Organisation for the Economyc Co-operation and Development, datos actualizados en octubre de 2016).

Con el objetivo de afrontar el riesgo que suponen estas sustancias, la Comisión Europea
propuso la inclusión de tres fármacos en la lista de sustancias prioritarias, siendo éstas el
antiinflamatorio diclofenaco y los estrógenos 17-β-estradiol (E2) y 17-α-etinilestradiol (EE2), a
través de la Propuesta Directiva (COM(2011)876 final). Sin embargo, esta propuesta fue rechazada
y, finalmente, mediante la Decisión de la Ejecución (UE) 2015/495 de la Comisión, estos fármacos
fueron incluidos, junto con otro estrógeno y tres antibióticos, en la primera lista de observación en
el contexto de la Directiva Marco del Agua (Directiva 2000/60/CE).

13
CAPÍTULO 2

La entrada de contaminantes de tipo farmacológico al medio acuático puede deberse a los


residuos derivados del uso terapéutico en medicina humana (doméstico u hospitalario), los
residuos derivados del uso terapéutico veterinario y los residuos generados en la industria
farmacéutica (Figura 2.2). A estos residuos de difícil control, se suma la inadecuada eliminación
de fármacos caducados o sobrantes a los residuos domésticos o directamente al agua.

Cada fármaco, una vez administrado, puede ser excretado sin sufrir ninguna
transformación, o bien ser metabolizado mediante reacciones de oxidación, reducción, hidrólisis y
alquilación, o bien formar conjugados más polares e hidrofílicos que son excretados por la orina o
la bilis (Heberer, 2002a). Los fármacos utilizados en medicina veterinaria pueden ser excretados
al suelo, o directamente a las aguas superficiales, por lo que su control es difícil. En el caso de la
ganadería intensiva, estos medicamentos son susceptibles de entrar al medio ambiente a través
del suelo en su uso agrícola mediante la incorporación de estiércol y como abono líquido. Por otra
parte, los medicamentos suministrados en las piscifactorías son, normalmente, liberados
directamente a las aguas superficiales (Halling-Sorensen et al., 1998). La mayoría de estos
compuestos y sus metabolitos son solubles en agua, en donde, entre el 55-80% de la cantidad
total suministrada es excretada a través de la orina (Heberer, 2002a).

Por otra parte, las aguas residuales procedentes de la industria farmacéutica se


caracterizan por presentar una gran variabilidad en cuanto a caudal y composición. Estos
parámetros van a depender del régimen de producción, la elaboración concreta que se esté
llevando a cabo, del tipo de actividad que esté generando el residuo, etc. Todas estas variables
hacen que la contaminación del efluente final pueda ser muy diversa y variable en el tiempo. El
volumen más importante se produce durante el lavado de los equipos al finalizar el proceso de
producción. Según la Directiva 91/271/CEE, los vertidos industriales que se hagan al sistema de
depuración de aguas residuales urbanas, deberán asegurar un tratamiento previo.

En función de las propiedades físico-químicas de los fármacos, metabolitos y/o productos


de degradación, y las características de los suelos, estas sustancias pueden llegar a alcanzar las
aguas subterráneas o bien quedar retenidas y acumularse en el suelo, pudiendo afectar al
ecosistema y a la salud humana a través de la cadena trófica.

14
Antecedentes

Figura 2.2 Principales vías de entrada de los fármacos al agua (fuente: elaboración propia).

Recientes estudios han demostrado que los sistemas de tratamiento convencionales


resultan ineficaces en la eliminación de fármacos de las aguas, habiendo sido detectada una
amplia variedad de estos compuestos y sus metabolitos en los sistemas acuáticos (Drewes et al.,
2001; Jones et al., 2005; Ternes, 2001). Por ejemplo, sustancias como la carbamazepina, atenolol,
metropopol, trimetoprim y diclofenaco, solo son eliminadas en las EDARs en porcentajes
inferiores al 10% (Ternes, 1998). Así mismo en publicaciones recientes, se indica que países como
España, Alemania, Canadá, Brasil, Grecia y Francia generan descargas al agua de
aproximadamente 500 toneladas/año en analgésicos, donde el ácido salicílico y el diclofenaco
alcanzan concentraciones de 0,22 a 3,02 µg l-1 (Heberer, 2002b) en los efluentes de EDARs. A
pesar de que las concentraciones detectadas en aguas superficiales y en aguas subterráneas se
sitúan normalmente en niveles traza, lo que ha despertado una mayor preocupación ha sido el
hallazgo de algunos de ellos (como el ibuprofeno, el diclofenaco, la carbamazepina o el ácido
clofíbrico) en aguas potables (Bedner and MacCrehan, 2005; Ternes et al., 2002).

15
CAPÍTULO 2

Además de que los tratamientos de aguas residuales convencionales no hayan sido


diseñados para la eliminación de fármacos, el hecho de que se trate de sustancias complejas de
muy diversa naturaleza, con grandes diferencias en su estructura y comportamiento físico-
químico, dificulta aún más su eliminación. Su persistencia en el medio ambiente puede ser mayor
de un año para fármacos como la eritromicina, ciclofosfamida, naxopreno, sulfametoxazol, y de
varios años para otros, como el ácido clofíbrico, que puede acumularse alcanzando niveles
biológicamente activos (Coimbra et al., 2015). Tras su administración, las moléculas son
absorbidas, distribuidas y, además, sujetas a reacciones metabólicas donde la estructura química
de la molécula activa puede ser modificada.

Los fármacos que se han detectado en el ambiente acuático, ya sea directamente o sus
metabolitos, incluyen los siguientes grupos terapéuticos (Hernando et al., 2006):

• Antiinflamatorios y analgésicos. Dentro de este grupo, los compuestos más


empleados son el paracetamol, ácido acetilsalicílico, ibuprofeno y diclofenaco.
• Antidepresivos. Los más frecuentes son las benzodiacepinas.
• Antiepilépticos. El más común es la carbamazepina.
• Antilipemiantes. Se aplican fundamentalmente, para bajar los niveles de colesterol
en sangre en personas con arterioesclerosis. Los fármacos más frecuentes son los
fibratos.
• β-bloqueadores. Utilizados principalmente para el tratamiento de los transtornos
del ritmo cardíaco. Los más utilizados son el atenolol, propanolol y metopropol.
• Antiulcerosos y antihistamínicos. Comúnmente, se emplean la ranitidina y
famotidina.
• Antibióticos. Entre los más importantes se encuentran las tetraciclinas, macrólidos,
β-lactámicos, penicilinas, quinolonas, sulfonamidas, fluoroquinolonas, cloranfenicol
y derivados imidazólicos.

2.4. EFECTOS Y RIESGOS DE LA PRESENCIA DE FÁRMACOS EN EL MEDIO AMBIENTE

Los fármacos, una vez liberados al medio ambiente, pueden tener efectos adversos aún
desconocidos sobre organismos vivos. Estos compuestos han sido desarrollados para actuar sobre
mecanismos metabólicos y moleculares en personas y animales. Al introducirse en el medio
ambiente, pueden actuar a través de los mismos mecanismos en animales que tengan órganos,
tejidos, células o biomoléculas similares. Sin embargo, en organismos inferiores los modos de
acción pueden sucederse de muchas otras formas. Además, algunos de estos fármacos tienen la

16
Antecedentes

capacidad de acumularse en los tejidos animales, siendo ejemplo de ello las concentraciones de
gemfibrozil, diclofenaco e ibuprofeno encontradas en el hígado, riñones y plasma de diversos
peces (Brown et al., 2007; Mimeault et al., 2005; Schwaiger et al., 2004).

En la actualidad, los efectos de la presencia de fármacos en el medio ambiente no son bien


conocidos. Las concentraciones detectadas en aguas naturales, no suelen presentar toxicidad
aguda sobre los organismos acuáticos (Kyungho et al., 2008). Sin embargo, el hecho de que
puedan sufrir una exposición prolongada a estos compuestos, despierta un gran interés sobre la
toxicidad crónica. Además, este riesgo se ve incrementado ya que, normalmente, estos
contaminantes se encuentran mezclados en el medio, provocando efectos combinados o
sinérgicos (Quinn et al., 2009). El uso de bioensayos permite evaluar la calidad de las aguas de
cara a la problemática ambiental asociada a los contaminantes emergentes en general y a los
fármacos en particular, ofreciendo información sobre biodisponibilidad y efectos conjuntos de
muestras ambientales completas en la biota. El uso de embriones de pez se ha utilizado en
recientes investigaciones para analizar posibles efectos ecotoxicológicos de los contaminantes en
el medio ambiente acuático (Caminada et al., 2006; Coimbra et al., 2015; Ribeiro et al., 2015;
Scholz et al., 2008; Soares et al., 2009; Torres et al., 2016). El pez cebra (Danio rerio) es una de las
especies más empleadas en estudios de ecotoxicidad y desarrollo genético (Ribeiro et al., 2015;
Soares et al., 2009; Torres et al., 2016). Estos bioensayos permiten la exposición prolongada a
contaminantes, evaluando los efectos causados en las distintas etapas del desarrollo embrionario,
así como en la edad adulta, mediante observación directa o mediante el empleo de biomarcadores
de daño. Además, no solo permiten evaluar la disminución de la toxicidad en el efluente tratado
por reducción de la concentración del fármaco, sino también verificar si existen productos de
transformación tóxicos tras el tratamiento.

Si aún no son bien conocidos los efectos en el ambiente, aún más compleja resulta la
identificación de los posibles efectos adversos que los contaminantes emergentes y,
específicamente los fármacos, pueden causar en la salud humana a través de su consumo en el
agua potable. Como ya se mencionó anteriormente, los contaminantes emergentes no necesitan
ser persistentes para encontrarse en el medio ambiente y ocasionar efectos negativos, ya que sus
altas tasas de transformación se ven compensadas por el continuo consumo e introducción en el
medio ambiente (Petrovic et al., 2003). Para la mayoría de este tipo de compuestos no existe
información sobre su incidencia, contribución al riesgo y efectos ecotoxicológicos, de tal manera
que es difícil predecir posibles riesgos para la salud humana.

17
CAPÍTULO 2

2.5. SISTEMAS DE TRATAMIENTO EN LA ELIMINACIÓN DE CONTAMINANTES


EMERGENTES DEL AGUA

Las plantas de tratamiento de aguas residuales han sido diseñadas para la eliminación de
un amplio rango de sustancias, como materia orgánica, nutrientes, patógenos y partículas en
suspensión. Sin embargo, tras la detección de nuevos contaminantes en las aguas y la entrada en
vigor de la Directiva 2008/105/CE, por la que se fijan las Normas de Calidad Ambiental para
algunos contaminantes emergentes clasificados como prioritarios, surgió la necesidad de valorar
la eficiencia de eliminación de estas sustancias mediante los sistemas de tratamiento
convencionales de aguas residuales.

Los contaminantes emergentes poseen propiedades químicas muy diversas, que hacen que
su grado de eliminación por los tratamientos convencionales pueda ser muy distinto, persistiendo
muchos de ellos inalterados en los efluentes de las plantas depuradoras. Por esta razón, es
importante identificar y evaluar tecnologías de tratamiento de aguas, que permitan una
incorporación segura de las aguas tratadas al medio acuático y eviten efectos adversos sobre el
medio ambiente y la salud humana.

2.5.1. Sistemas convencionales

Los sistemas de tratamiento de aguas residuales convencionales constan de tratamientos


físicos, químicos o biológicos según su modo de actuación; o de pre-tratamientos, tratamientos
primarios, secundarios, terciarios, etc. según el orden de actuación sobre el agua residual.

Los pre-tratamientos constan de operaciones mecánicas y físicas para la separación de


aquellas materias que por su naturaleza o por su tamaño puedan ocasionar problemas en etapas
posteriores (obstrucción de tuberías y bombas, depósitos de arena, rotura de equipos, etc.) Estas
operaciones constan habitualmente de una separación de grandes sólidos, desbaste, tamizado,
desarenado y desaceitado-desengrasado, mediante los cuales tan solo una pequeña fracción de
algunos contaminantes emergentes será eliminada, como son los compuestos liposolubles o los
que queden adsorbidos en la fracción sólida (Carballa et al., 2004).

Los tratamientos primarios tienen por objeto eliminar sólidos en suspensión y coloides. Los
sólidos en suspensión se podrán separar según su naturaleza por gravedad, flotación o filtración.
Sin embargo, debido a la naturaleza de las partículas coloidales, serán necesarios procesos de
coagulación-floculación para romper su estabilidad en el agua, y la posterior separación de los
agregados por decantación o flotación. La eliminación de contaminantes emergentes que pueda
ocurrir en esta etapa será de aquellos contaminantes adsorbidos sobre los lodos de la decantación

18
Antecedentes

primaria (Ternes et al., 2004). Carballa et al. (2004) alcanzaron una eliminación eficiente de
fragancias como galaxolide y tonalide durante el tratamiento primario (40%). El disruptor
endocrino nonilfenol monoetoxilado tan solo fue eliminado en un 13%, y el bisfenol A en un 43%
(Stasinakis et al., 2013). En el caso de fármacos y hormonas, la eliminación durante el tratamiento
primario solo alcanzó el 28% para el diclofenaco y el estriol, y no se observó ninguna reducción
para ibuprofeno, naproxeno, sulfametoxazol y estrona (Carballa et al., 2004). Por ello ha sido
afirmado que los tratamientos primarios no resultan efectivos en la eliminación de la mayoría de
los contaminantes emergentes (Carballa et al., 2005).

Los tratamientos secundarios consisten en diversos tratamientos biológicos que tendrán


por objeto degradar la materia orgánica biodegradable. Entre ellos se encuentran diferentes
sistemas como los lodos activos, los lechos bacterianos o los contactores biológicos rotativos
(biodiscos y biocilindros). Durante el tratamiento secundario los contaminantes emergentes
pueden sufrir diversos procesos y su eliminación generalmente se refiere a la pérdida del
compuesto parental debido a transformaciones químicas o físicas, biodegradación o adsorción
(Jelic et al., 2010). La biodegradación/biotransformación y la adsorción son los principales
mecanismos de eliminación en el tratamiento secundario, mientras que la volatilización ocupa
una menor fracción (Verlicchi et al., 2012). Salgado et al. (2012) observaron una baja
biodegradabilidad del diclofenaco (< 25%), mientras que el ibuprofeno y keroprofeno mostraron
una biodegradabilidad mucho mayor (> 75%). Por otra parte, los antibióticos no son fácilmente
biodegradables (Verlicchi et al., 2012).

Sin embargo, la configuración convencional de las EDARs no permite la eliminación


eficiente de estos nuevos contaminantes. En el caso particular de los fármacos, muchos de ellos no
son metabolizables por los microorganismos e incluso pueden llegar a inhibir su actividad. Por
otra parte, en los sistemas de cloración como tratamiento para la desinfección del agua, se ha
observado que en la eliminación del paracetamol se produce una reacción con cloro para formar
un gran número de subproductos, dos de los cuales han sido identificados como tóxicos (Bedner
and MacCrehan, 2005; Glassmeyer and Shoemaker, 2005). Por lo tanto, la mayor parte de estos
contaminantes no se eliminan eficientemente durante el tratamiento secundario, constituyendo la
principal vía de entrada de la contaminación de los medios acuáticos (Tabla 2.2).

19
CAPÍTULO 2

Tabla 2.2 Eficiencias medias de eliminación de fármacos detectados tras el tratamiento de las aguas residuales de
varias EDARs basadas en tratamientos convencionales (adaptación de Prados-Joya 2010).

Eficiencia de eliminación
Tipo de fármaco Sustancia detectada
media (%)

Ketoprofeno 29,5

Naproxeno 0
Analgésicos y
Ibuprofeno 48,5
antiinflamatorios
Diclofenaco 14,0

Paracetamol 79,4

Bezafibrato 56,5

Antilipemiantes Clofibrato 61,1

Gemfibrozil 22,6

Antiepilépticos Carbamazepina 2,4

Antiácidos Ranitidina 28,2

Azitromicina 36,8

Metronidazol 46,3
Antibióticos
Sulfametoxazol 33,9

Trimetoprima 75,3

Atenolol 1,3

β-bloqueadores Sotalol 9,7

Propanolol 42,1

2.5.2. Tratamientos avanzados

Los tratamientos avanzados buscan mejorar la calidad del agua mediante la eliminación de
la carga orgánica residual así como contaminantes no eliminados en el tratamiento secundario,
como son los nutrientes inorgánicos (nitrógeno y fósforo). A pesar de que el uso de estos
tratamientos está extendido en la eliminación de contaminantes específicos de los efluentes
industriales, su inclusión no resulta habitual como tratamientos terciarios en las EDARs. Estos
tratamientos pueden basarse en ósmosis inversa, electrodiálisis, destilación, coagulación,
adsorción mediante carbón activo, filtración, oxidación química, precipitación o nitrificación-

20
Antecedentes

desnitrificación. Además, los procesos como la desinfección con cloro, luz ultravioleta u ozono
permiten reducir el número de organismos vivos presentes en el agua.

Como se ha expuesto, los sistemas convencionales no resultan adecuados para la completa


eliminación de la gran variedad de contaminantes emergentes presentes en las aguas residuales.
Los procesos avanzados resultan una buena opción en el tratamiento de contaminantes
emergentes, sin embargo, la mayor parte de ellos presentan como desventaja su elevado coste y
dificultad de operación. Utilizándolos como tratamiento terciario en la configuración
convencional de las EDARs, permiten mejorar la biodegradabilidad de los contaminantes y
contribuir así a su eliminación. Sin embargo, el pH y la temperatura tienen una gran influencia en
su eliminación ya que influyen en la fisiología de los microorganismos y en la solubilidad de los
contaminantes en el agua (Cirja et al., 2008). Sin embargo, en la actualidad, no hay disponible
ningún tratamiento que asegure la completa eliminación de la mezcla de contaminantes
emergentes de las aguas residuales, por lo que se continúa investigando sobre diferentes
alternativas para lograrlo.

Coagulación-floculación

Los procesos de coagulación-floculación, a pesar de no ser un sistema nuevo, constituyen


una alternativa en su utilización como pre-tratamiento o como tratamiento terciario en los
sistemas convencionales de tratamiento de aguas residuales. En general, estos procesos no
resultan efectivos en la mayoría de los contaminantes emergentes, sin embargo, Suárez et al.
(2009) utilizaron sales de hierro y aluminio como pre-tratamiento sobre efluentes hospitalarios,
alcanzando eliminaciones elevadas para tonalide y galaxolide (< 79%), medias para diclofenco y
naproxeno (< 32%) y bajas para ibuprofeno, carbamazepina y sulfametoxazol (< 12%).
Matamoros y Salvadó (2013) aplicaron la coagulación-floculación a los efluentes del tratamiento
secundario obteniendo eficiencias medias (24-50%) para tonalide, celestolide, trilosan y
octilfenol; y bajas o inapreciables para ibuprofeno, kentoprofeno, carbamazepina, galaxolide,
dimetoxipropano (2-19%).

Sistemas de membranas

La eliminación de contaminantes mediante sistemas de membranas se logra a través de la


exclusión por tamaño, adsorción sobre la membrana y mediante cargas de repulsión (Luo et al.,
2014). La eliminación dependerá de diversos factores como las características de la membrana,
las condiciones de operación, las características propias del contaminante y de los fenómenos de
ensuciamiento de la membrana (Schäfer et al., 2011). Los sistemas de membrana comprenden
procesos a baja presión, como la microfiltración y ultrafiltración; y procesos a alta presión, como

21
CAPÍTULO 2

la nanofiltración y ósmosis inversa. Los sistemas de microfiltración y ultrafiltración no


presentaban eficiencias aceptables en la eliminación de contaminantes emergentes ya que el
tamaño de poro de la membrana no es capaz de retener estas moléculas (Luo et al., 2014). Sin
embargo, estos microcontaminantes pueden ser eliminados por adsorción a la membrana y por
interacciones con la materia orgánica del agua residual (Jermann et al., 2009).

Por otra parte, los sistemas de ósmosis inversa y nanofiltración son muy efectivos en la
separación física de contaminantes emergentes del agua (Bellona et al., 2008; Wei et al., 2015).
Ambos sistemas son utilizados en la industria para obtener agua de reutilización debido a sus
altas eficiencias, sin embargo sus membranas aún son permeables para algunos contaminantes
(Steinle-Darling et al., 2010). Así mismo, los procesos de electrodiálisis utilizados en las plantas de
desalinización, han comenzado a utilizarse en el ámbito de los contaminantes emergentes,
permitiendo que la corriente eléctrica que pasa a través de la membrana separe ciertos
compuestos del agua residual (Gabarrón et al., 2016; Guedes et al., 2016).

A pesar de que algunas técnicas de filtración a través de membrana a alta presión resultan
muy eficientes, implican altos costes operativos y de inmovilizado (Acero et al., 2010). Además,
presentan las desventajas de que las moléculas de bajo peso molecular continúan sin ser
retenidas y de que se genera una salmuera con una elevada concentración de fármacos. Para
solucionar el primero de estos problemas, se han realizado diversos estudios sobre la
combinación de procesos de filtración con membranas con procesos de coagulación o adsorción,
que permitan eliminaciones adicionales al aumentar el tamaño de aquellos compuestos con bajo
peso molecular que no serían retenidos por la membrana operando por sí sola (Acero et al., 2012;
Ang et al., 2016).

Reactores biológicos de membrana

Los reactores biológicos de membrana se consideran una mejora al tratamiento biológico


secundario, ya que combinan el proceso de los lodos activados con los sistemas de membranas.
Este sistema permite eliminar un amplio rango de microcontaminantes, ya que las membranas
son capaces de retener los lodos sobre los que los contaminantes han sido adheridos. En función
del tamaño de la membrana también podrá retener algunos de estos compuestos por sí mismas.
Además, al tener un mayor tiempo de retención del lodo, se logra una mayor degradación por
parte de los microorganismos (Spring et al., 2007). Por otro lado, presentan la ventaja de generar
una baja carga de lodos y mejor separación de la población microbiana. Sin embargo, presentan
una gran desventaja económica, lo que limita su aplicación.

22
Antecedentes

Trinh et al. (2012) alcanzaron una alta eliminación (<90%) mediante los sistemas de
membrana biológica para la mayoría de los contaminantes detectados. Sin embargo, algunos
fueron eliminados de forma incompleta (24-68%), entre los que se encontraban el diclofenaco,
carbamazepina, diazepan, gemfibrozil y omeprazol.

Adsorción mediante carbón activo

El carbón activo es comúnmente utilizado en el control del olor y sabor del agua potable.
Sin embargo, este método se ha evaluado como tratamiento terciario para la eliminación de
contaminantes emergentes por diversos autores (Campinas et al., 2016; Matamoros et al., 2009),
obteniendo eliminaciones superiores al 90% para diclofenaco, carbamazepina, propanolol,
triclosan, trimethoprim. La utilización del carbón activo en los procesos de adsorción presenta la
ventaja de no generar subproductos, evitando así el riesgo de formar productos de
transformación más contaminantes. Sin embargo, requiere grandes consumos de carbón activo,
que tiene un alto coste, y su eficacia disminuye en gran medida en presencia de materia orgánica
debido a la obstrucción de los poros por parte de esta última.

Los sistemas de adsorción con carbón activo combinados con ultrafiltración son tecnologías
prometedoras para el tratamiento de agua. En este sistema se suman los beneficios aportados por
la adsorción y la retención de partículas de alto peso molecular, por lo que permite la retención de
partículas de menor peso molecular que no serían eliminadas por la ultrafiltración por sí sola
(Acero et al., 2012).

Procesos de oxidación avanzada

Los procesos de oxidación se basan en la ruptura de las moléculas mediante el ataque a


grupos funcionales. La ozonización y los procesos de oxidación avanzada han demostrado ser
tecnologías eficientes por presentar altas tasas de degradación y por no ser selectivos, además de
presentar la ventaja de tener efectos desinfectantes (Hernández-Leal et al., 2011). Sin embargo,
presentan el inconveniente de suponer elevados costes de operación. Además, en el caso de los
contaminantes emergentes, y más aún en el de los fármacos, esto puede dar lugar a la
transformación de los contaminantes en otros compuestos de los que se desconocen sus efectos
sobre el medio ambiente y la salud humana (Evgenidou et al., 2015; Fatta-Kassinos et al., 2011).

Los procesos de oxidación avanzada implican la formación de radicales hidroxilo, altamente


reactivos, que actúan como iniciadores del proceso de oxidación. Entre estos procesos se
encuentra la fotocatálisis (empleando luz UV o solar en presencia de catalizadores
semiconductores) y los procesos Fenton (usan reacciones entre iones de hierro y peróxido de

23
CAPÍTULO 2

hidrógeno). Además, se ha investigado la eliminación de contaminantes emergentes mediante la


utilización de varios procesos de oxidación avanzada, como la combinación de ozono, radiación
UV y/o peróxido de hidrógeno, mejorando la degradación de fármacos polares y sus metabolitos
(Petrovic et al., 2003). Se ha comprobado que los procesos de fotocatálisis son capaces de eliminar
eficazmente diversos compuestos farmacéuticos, incluyendo los estrógenos (de la Cruz et al.,
2012; Deegan et al., 2011; Prieto-Rodríguez et al., 2012).

2.5.3. Tratamientos alternativos

En la Unión Europea ya se asumió la necesidad urgente de abordar el problema de la


contaminación por contaminantes emergentes y de desarrollar e implementar estrategias sostenibles y de
bajo coste para la remediación de aguas contaminadas por este tipo de compuestos (Barbosa et al.,
2016). Por ello, y en respuesta a los elevados consumos energéticos y costes operacionales de los
tratamientos avanzados, han surgido los llamados tratamientos alternativos, entendiendo como
tales aquellos que suponen bajos costes y son respetuosos con el medio ambiente.

Adsorbentes alternativos

Como ya ha sido referido, el carbón activado es un material altamente poroso debido a su


elevada área superficial, siendo el adsorbente más utilizado para el tratamiento de aguas.
El principal inconveniente de los carbones activados es su elevado precio. Aunque a nivel
industrial su utilización pueda ser factible, en el caso de las aguas residuales urbanas, debido a los
grandes volúmenes que es preciso tratar, los costes asociados a un tratamiento terciario de
adsorción utilizando carbón activado serían muy elevados. Por esta razón, en los últimos años,
han sido realizados numerosos estudios sobre la producción de adsorbentes alternativos y/o de
bajo coste a partir de bioresiduos y su utilización para la eliminación de fármacos de las aguas
(Bernardo et al., 2016; Coimbra et al., 2016; Ferreira et al., 2017; Tapia-Orozco et al., 2016).
Al igual que la adsorción sobre carbón activado, la eliminación de fármacos utilizando estos
adsorbentes alternativos tiene la ventaja de no llevar asociada la generación de productos de
transformación.

Fotodegradación con luz solar

La utilización de procesos de oxidación avanzada como tratamiento terciario en la


eliminación de fármacos presenta el inconveniente de elevados costes energéticos y
operacionales, además de poder formar productos de degradación tóxicos durante la oxidación
con ozono (Verlicchi et al., 2012). Como alternativa ha surgido la fotodegradación solar, que a
pesar de las variaciones estacionales, geográficas y climatológicas, presenta las ventajas de

24
Antecedentes

utilizar una fuente natural de oxidación, sostenible y de bajo coste (Kanakaraju et al., 2016). La luz
solar puede actuar directamente sobre los contaminantes o actuar de forma indirecta mediante la
formación de radicales (Mathon et al., 2016). Además de llevarse a cabo en los fotorreactores
solares, la fotodegradación solar puede tener lugar de forma simultánea a los tratamientos
biológicos. Norvill et al. (2017) estudiaron la eliminación de tetraciclinas de aguas residuales
mediante microalgas, resultando el principal mecanismo la fotodegradación. De la misma manera,
la fotodegradación solar tuvo un importante papel en la eliminación de contaminantes
emergentes en humedales artificiales (Ávila et al., 2015)

Tratamientos biológicos

Los sistemas biológicos de tratamiento de aguas residuales constituyen una alternativa


sostenible y económicamente rentable respecto a otros sistemas alternativos. Los sistemas de
tratamiento avanzados (procesos de oxidación avanzada, tecnología de membranas, etc.) suponen
un elevado consumo energético, elevados costes de construcción y mantenimiento y un efluente
de menor calidad ecológica que el obtenido mediante tratamientos biológicos (García-Rodríguez
et al., 2014).

Los sistemas de tratamiento de aguas residuales biológicos simulan la habilidad natural de


los ecosistemas para atenuar la contaminación del agua mediante procesos físicos
(adsorción/absorción, fotodegradación, volatilización y sedimentación), químicos (degradación e
hidrólisis) y biológicos (biodegradación y fitorremediación) (García-Rodríguez et al., 2014). Estos
mecanismos de eliminación se verán afectados por diversos factores, como la actividad de la
planta de tratamiento, la composición del agua residual, la acumulación de materia orgánica y los
cambios ambientales (García-Rodríguez et al., 2014).

Entre los tratamientos biológicos alternativos más importantes se encuentran los


humedales artificiales, las lagunas de estabilización y las lagunas de alta carga.

Los humedales artificiales se basan en estanques, lechos o zanjas de poca profundidad, que
contienen vegetación emergente propia de humedales que va a eliminar la contaminación por
mecanismos de biodegradación, fitorremediación, fotodegradación y adsorción a la matriz sólida.
En los últimos años han surgido numeras investigaciones sobre la eliminación de contaminantes
emergentes orgánicos mediante este sistema, variando en gran medida las eficiencias obtenidas
en función de factores como las dimensiones, tipo de vegetación, tiempo de retención hidráulica y
tipo de matriz sólida. Así las eficiencias detectadas por diversos autores varían entre 21-99% en
diclofenaco, 52-99% ibuprofeno, > 94% ácido salicílico, > 95% paracetamol, 65-99% bisfenol A,
< 28% carbamazepina, 45-99% naproxeno, 68% estrona, 84% β-estradiol y 75% 17-α-

25
CAPÍTULO 2

etinilestradiol (Ávila et al., 2013, 2010; Matamoros et al., 2009; Song et al., 2009; Zhang et al.,
2012a, 2012b).

Las lagunas de estabilización constituyen un sistema completo de depuración de aguas


residuales, constando de un estrato superior formado por algas y bacterias aerobias, uno inferior
constituido por bacterias anaerobias, y uno intermedio con la presencia de bacterias facultativas.
Los mecanismos de eliminación comprenden la fotodegradación, biodegradación y la adsorción
sobre la materia orgánica. Hijosa-Valsero et al. (2010) observaron una eliminación entre el 70 y
90% de fármacos y productos de cuidado personal (ibuprofeno, diclofenaco, ácido salicílico,
cafeína y metil dihidrojasmonato). Li et al. (2013) detectaron una mayor eliminación de algunos
de los compuestos evaluados (naproxeno, ibuprofeno, cafeína, triclosan, gemfibrocil,
sulfametoxazol) durante la estación cálida en este sistema de lagunajes, alcanzando eficiencias
entre 88-100%.

La biorremediación del agua mediante el cultivo de microalgas como alternativa a los


tratamientos convencionales, fue propuesta por primera vez por Oswald en la década de los 60
(Oswald et al., 1957). Desde ese momento, surgieron numerosas líneas de investigación en este
campo, entre las que destacan el aprovechamiento de la biomasa para la producción de
biocombustibles (Brennan and Owende, 2010; Christenson and Sims, 2011; Demirbas, 2011;
Maity et al., 2014), la eliminación de nutrientes (Arbib et al., 2013; Cabanelas et al., 2013; Gómez
et al., 2015; Morales-Amaral et al., 2015b; Posadas et al., 2015a), la eliminación de metales
pesados (Chen et al., 2012; Das et al., 2015; Fawzy and Issa, 2016; Puyen et al., 2012; Tao et al.,
2013; Vilar et al., 2009), la optimización de las condiciones de cultivo y diseño de biorreactores
(Chang et al., 2016; Imaizumi et al., 2016; Pfaffinger et al., 2016; Zheng et al., 2016); hasta su
utilización en la eliminación de contaminantes emergentes (Barceló and Petrovic, 2006; Carballa
et al., 2005; de Godos et al., 2012; Hom-Díaz et al., 2015; Matamoros et al., 2016).

2.6. UTILIZACIÓN DE LAS MICROALGAS EN EL TRATAMIENTO DE AGUAS RESIDUALES

La posibilidad de emplear microalgas para el tratamiento de aguas residuales se remonta a


los años 60, sin embargo a día de hoy, aún no se ha podido implantar como un sistema a escala
industrial ya que es necesario solventar ciertas limitaciones que impiden alcanzar la eficiencia de
los sistemas de tratamiento convencionales. Es por ello que, actualmente, no es posible plantear el
tratamiento con microalgas como un sistema de tratamiento por sí solo, sino como una etapa
dentro del sistema de tratamiento de una EDAR, bien como tratamiento secundario o bien como

26
Antecedentes

terciario, permitiendo cumplir los límites de vertido de nitrógeno y fósforo, así como la
eliminación de contaminantes emergentes.

El hecho de que las microalgas puedan ser cultivadas en agua residual se basa en la
similitud de la composición del agua residual con los nutrientes necesarios para el crecimiento de
las microalgas, siendo éstos principalmente carbono, nitrógeno y fósforo. Además, se encuentran
componentes minoritarios, como hierro, manganeso, etc. que son necesarios para la producción
de microalgas (Morales-Amaral et al., 2015b).

Una de las ventajas que presenta la utilización de microalgas en el tratamiento del agua
frente a los sistemas convencionales es la reducción de los costes energéticos, ya que a través de
la fotosíntesis se incrementa el oxígeno disuelto del agua, permitiendo reducir la aireación que
supone un 45-75% del coste total del proceso (Rosso et al., 2008). Además, permite rentabilizar el
proceso al obtener una biomasa de alto valor y destinarla a la producción de biofertilizantes,
producción de biogás y otros productos de biorrefinería. Por otra parte, las microalgas ayudan a
mitigar la emisión de gases de efecto invernadero que se producen en los tratamientos de aguas
residuales convencionales (dióxido de carbono, metano, óxido nitroso) (Acién et al., 2016).
Finalmente, como el más importante dentro del planteamiento en que se enmarca la presente
tesis, ofrece la ventaja de una eliminación efectiva de nutrientes inorgánicos (Acién et al., 2016;
Morales-Amaral et al., 2015b; Mujtaba et al., 2015), metales pesados (Das et al., 2015; Puyen et al.,
2012; Vilar et al., 2009) y ciertos contaminantes emergentes (Carballa et al., 2005; Hom-Díaz et
al., 2015; Matamoros et al., 2016), produciendo un efluente de alta calidad.

Aunque los cultivos de microalgas están formados por complejas poblaciones,


generalmente están dominados por una única especie que supone el 90% de la población de
microalgas (Acién et al., 2016). Las microalgas más empleadas en el tratamiento de algas
residuales, y que además se encuentran de forma natural, son las pertenecientes al género
Chlorella y Scenedesmus, debido a sus altas tasas de crecimiento y a su tolerancia a las condiciones
exteriores (Gómez et al., 2013). Además se han situado como uno de los géneros más tolerantes a
la contaminación en los sistemas de tratamiento de aguas residuales (Palmer, 1969).

27
CAPÍTULO 2

2.6.1. Implementación en los sistemas de tratamiento de aguas residuales


convencionales

Aunque la composición del agua residual varía en función de su localización y de las


actividades predominantes en la zona (actividad urbana, agrícola, ganadera, industrial, etc.),
contiene en todo caso materia orgánica, nutrientes, microorganismos, toxinas, metales pesados y
contaminantes emergentes (Morales-Amaral et al., 2015b). Además, aunque las aguas residuales
contienen generalmente los componentes mayoritarios para el cultivo de las microalgas (carbono,
nitrógeno, fósforo), debido a la variación en su composición y a las variaciones estacionales, es
necesario estudiar cada caso de forma individual (Christenson and Sims, 2011; Rawat et al.,
2011). Los micronutrientes como el silicio, calcio, magnesio, potasio, hierro, manganeso, azufre,
zinc, cobre y cobalto, no suelen ser un factor limitante para su cultivo, en el caso de las aguas
residuales.

El carbono a su entrada en la EDAR, estará en forma de materia orgánica, el nitrógeno


aparecerá principalmente en forma de urea, amonio, y nitrógeno orgánico; mientras que el fósforo
estará presente como fosfato y fósforo orgánico.

La composición de la biomasa de las microalgas se corresponde con un 40-60% de carbono,


4-12% nitrógeno y 0,5-2% fósforo (Cabanelas et al., 2013; Posadas et al., 2014);
correspondiéndose con una relación C/N/P que puede variar entre 100/20/3 a 100/10/1 en
función de la especie y las condiciones de cultivo. En función de la etapa del tratamiento de agua
residual convencional en que queramos implementar un sistema de tratamiento con microalgas,
se deberá tener en cuenta la limitación o exceso existente de alguno de los nutrientes que
impedirá la eficiente eliminación simultánea. La relación C/N/P del efluente del tratamiento
primario, del secundario, así como del residuo líquido procedente del filtrado de la digestión
anaerobia (Tabla 2.3), demuestran que en todos ellos hay una deficiencia de carbono que no
permitiría la completa asimilación de nitrógeno y fósforo (Acién et al., 2016). Esta limitación se
puede solventar mediante la adición de bicarbonato o la inyección de CO2 a demanda de gases de
combustión, siendo necesario además para el control del pH.

28
Antecedentes

Tabla 2.3 Composición del agua residual en carbono, nitrógeno y fósforo total en diferentes etapas de una EDAR
convencional (adaptación de Acién et al. 2016).

Tratamiento Efluente de la digestión


Concentración (mg l-1) Tratamiento secundario
primario anaerobia de lodos

Carbono 296 82 247

Nitrógeno 65 20 511

Fósforo 11 10 12

C/N/P 100/21/4 100/25/12 100/207/5

El efluente procedente del tratamiento primario contiene las proporciones adecuadas para
el cultivo de microalgas sin que sea necesario realizar modificaciones. Se han llevado a cabo
numerosos estudios en el que el consorcio microalgas-bacterias se ha propuesto como
tratamiento secundario (AlMomani and Örmeci, 2016; Lv et al., 2016; Posadas et al., 2015a).
Además, las microalgas pueden implementarse como tratamiento terciario en aquellos casos en
los que se necesite reducir aún más los niveles de nitrógeno y fósforo del tratamiento secundario
para cumplir con las estrictas regulaciones, además de eliminar contaminantes emergentes y
patógenos (AlMomani and Örmeci, 2016; Gao et al., 2016; Gómez et al., 2013; Matamoros et al.,
2015). En este caso, debido a la baja concentración de nutrientes, sería necesario usar membranas
que permitieran retener las células y aumentar el flujo de agua residual (Acién et al., 2016).
Finalmente, numerosos estudios se han llevado a cabo para el tratamiento del efluente
procedente de la digestión anaerobia de la línea de lodos (AlMomani and Örmeci, 2016; Ledda et
al., 2015; Morales-Amaral et al., 2015a; Posadas et al., 2015a; Sepúlveda et al., 2015), ya que
contendrá un alto contenido en nutrientes y contaminantes. Sin embargo, estudios recientes
(Morales-Amaral et al., 2015b) demuestran que es necesaria una dilución previa (40-50%) antes
del cultivo de microalgas ya que el exceso de amonio (> 100 mg l-1) puede inhibir su crecimiento
(Collos and Harrison, 2014). A pesar de este efluente tan solo supone el 2% del caudal total de
agua residual, su recirculación a la cabecera de la EDAR, supone un incremento sustancial de los
costes y del consumo de energía.

En todas estas etapas de tratamiento, se debe tener en cuenta la importante sinergia entre
microalgas y bacterias. Las bacterias serán las responsables de oxidar la materia orgánica para
dejar disponibles los compuestos inorgánicos a las microalgas (dióxido de carbono, amonio,
fosfatos), mientras que las microalgas a través de la fotosíntesis consumirán estos compuestos
inorgánicos para producir biomasa e incrementarán el oxígeno disuelto del agua que utilizarán las
bacterias en la oxidación de la materia orgánica (Figura 2.3). Sin embargo, este equilibrio no

29
CAPÍTULO 2

resulta tan sencillo ya que las microalgas pueden además tener un comportamiento mixotrófico,
asimilando ciertas moléculas orgánicas. Además, los metabolismos de las bacterias aerobias
heterótrofas responsables de la degradación de la materia orgánica, así como las bacterias
aerobias autótrofas nitrificantes y las bacterias anóxicas heterótrofas desnitrificantes, tendrán
lugar de forma simultánea. Debido a estas interacciones, la relación microalgas-bacterias se trata,
en realidad de un complejo sistema cuyas interacciones continúan siendo estudiadas para poder
construir un modelo (Broekhuizen et al., 2012; Karya et al., 2013).

Figura 2.3 Esquema simplificado de la relación microalgas-bacterias en el tratamiento de aguas residuales


(fuente: elaboración propia).

A pesar de las numerosas ventajas que ofrece el cultivo de microalgas en el tratamiento de


aguas residuales y las altas eficiencias obtenidas en la eliminación de nutrientes (Cabanelas et al.,
2013; Gómez et al., 2013; Morales-Amaral et al., 2015b) y contaminantes emergentes (de Godos et
al., 2012; de Wilt et al., 2016; Matamoros et al., 2016), es innegable admitir que existen diversas
limitaciones que deben ser mejoradas para poder sustituir los sistemas de tratamiento
convencionales. Sin embargo, constituyen una alternativa viable como tratamiento
complementario. Estos factores limitantes comprenden la susceptibilidad de las microalgas a la
variación de la composición del agua residual (principalmente metales pesados y contaminantes
emergentes) y a las variaciones en las condiciones ambientales. Además, es necesario reducir el
tiempo de retención hidráulica desde 7-11 días a los 0,3 días utilizado en los procesos
convencionales y reducir el consumo de energía por debajo de 0,5 kWh/m3 (Acién et al., 2016).

30
Antecedentes

2.6.2 Mecanismos de eliminación de nitrógeno y fósforo

Las microalgas pueden asimilar el nitrógeno en forma de NO3-, NO2- o NH4+, siendo todas las
formas reducidas a amonio antes de ser incorporados en aminoácidos (Figura 2.4). Por lo tanto,
las formas de nitrato y nitrito serán consumidas tras el agotamiento del amonio, teniendo
preferencia por esta última forma de nitrógeno ya que requiere un menor consumo de energía
(Cai et al., 2013). Esto representa una ventaja en el cultivo en aguas residuales ya que la mayor
parte del nitrógeno total está en forma de amonio. Sin embargo, a veces puede ocurrir que el
oxígeno disuelto (OD ≥ 2 mg O2 l-1) provoque una rápida oxidación del NH4+ a formas de NO3-,
siendo superior que la asimilación de NH4+ por las microalgas o la volatilización de NH3; de tal
forma que finalmente la asimilación del nitrógeno sea en forma de NO3-, suponiendo mayores
requerimientos de energía y una disminución de la eficiencia de eliminación (Cai et al., 2013;
Posadas et al., 2015b). Además, como mecanismo abiótico durante el cultivo de microalgas, la
eliminación de nitrógeno también puede ocurrir por la volatilización de NH3 en condiciones de
elevado pH y alta concentración de NH4+. Sin embargo, bajo estas condiciones el crecimiento de
las microalgas puede quedar inhibido (Acién et al., 2016).

El fósforo en forma de PO43- se eliminará por asimilación a la biomasa, o de forma abiótica


por precipitación en condiciones de elevado pH (> 9) (Cai et al., 2013; Heubeck et al., 2007). Sin
embargo, debido al control de las condiciones de cultivo, este último mecanismo no tiene lugar
cuando se opera bajo condiciones de pH óptimo. Teniendo en cuenta que la composición de
fósforo de la biomasa varía de 0,5 a 2%, éste podrá ser acumulado como polifosfato para usarlo
posteriormente como una reserva de fósforo para el crecimiento de la biomasa cuando se
encuentre de forma limitada en el medio o como fuente de energía (Brown and Shilton, 2014;
Powell et al., 2008).

31
CAPÍTULO 2

Figura 2.4 Degradación bacteriana del nitrógeno y formas de asimilación en las microalgas
(fuente: elaboración propia).

2.6.3. Mecanismos en la eliminación de contaminantes emergentes

Los principales mecanismos que tienen lugar en la eliminación de contaminantes


emergentes mediante microalgas son la adsorción/absorción y la biodegradación. Sin embargo, el
conocimiento en este campo aún es escaso ya que depende de múltiples factores.

Los procesos de absorción/adsorción de los contaminantes emergentes dependen en gran


medida de la estructura del compuesto considerado (hidrofobicidad y grupos funcionales
disponibles), de la especie de microalga que actuará como adsorbente/absorbente y de las
condiciones ambientales (pH y temperatura) (Norvill et al., 2016). Además, la adsorción parece
ser un paso previo en la biodegradación de algunos contaminantes (Shi et al., 2010; Urase and
Kikuta, 2005). Wilt et al. (2016) observaron una eliminación debida a procesos de adsorción
mediante el cultivo de Chlorella sorokiniana < 20% para los fármacos diclofenaco, ibuprofeno,
paracetamol, metopropol, carbamazepina y trimetopin. En el caso de los estrógenos, diversos
autores han obtenido eliminaciones < 10% tanto por adsorción a biomasa de microalgas muerta
(Hom-Díaz et al., 2015; Zhang et al., 2014) como viva (Shi et al., 2010). Norvill et al. (2017)
determinaron una degradación del antibiótico tetraciclina del 93-99%, siendo el principal
mecanismo la fotodegradación y tan solo un 6% de la eliminación total fue atribuible a la
adsorción del fármaco a la biomasa de microalgas y bacterias.

32
Antecedentes

La biodegradación de contaminantes orgánicos emergentes por medio de microalgas puede


tener lugar de forma directa mediante metabolismo heterótrofo (Neilson and Lewin, 1974;
Subashchandrabose et al., 2013, 2011) o mediante la acción de enzimas extracelulares (Wurster
et al., 2003). Además, de una forma indirecta estos compuestos pueden ser degradados por el
incremento del oxígeno disuelto en el agua, fotosintéticamente mediante cambios de pH, o en su
caso por la relación simbiótica establecida con las bacterias (Muñoz and Guieysse, 2006; Norvill et
al., 2016). Existen pocos estudios publicados sobre la eliminación de contaminantes emergentes
por microalgas, sin embargo, la mayoría de ellos apuntan hacia una significativa eliminación
mediante biodegradación. Shi et al. (2010) observaron una biodegradación > 52% de estrona,
17β-estradiol y 17α-etinilestradiol. Hom-Díaz et al. (2015) comprobaron que de una eliminación
entre el 60-100% de 17β-estradiol y 17α-etinilestradiol, tan solo un 20-54% era atribuible a la
biodegradación. Además, Matamoros et al. (2015) atribuyeron la eliminación de 26
contaminantes emergentes a la biodegradación y fotodegradación, aunque en función del
compuesto, las eficiencias variaron entre insignificantes a > 90%.

2.6.4. Separación de la biomasa

Desde el punto de vista del cumplimiento de las regulaciones de calidad del agua, es
necesario separar la biomasa del efluente tratado antes de su vertido. En el caso de los
tratamientos mediante microalgas, esta separación representa una oportunidad para rentabilizar
el proceso del tratamiento del agua residual debido a la posterior utilización de la biomasa de
microalgas.

La sedimentación natural de las microalgas presenta valores inferiores a 10-6 m s-1


(Granados et al., 2012). Esto es debido al pequeño tamaño celular (< 30 µm), su baja
concentración en el cultivo (0,5-2,0 g l-1) y las fuerzas electrostáticas de repulsión entre las células
que hace que se mantengan en suspensión (Grima et al., 2003).

Diversas técnicas pueden ser aplicadas para la separación o cosechado de las microalgas,
tales como centrifugación, filtración, sedimentación, flotación, coagulación-floculación y métodos
electrolíticos (Granados et al., 2012). Sin embargo, debido a los grandes volúmenes de agua
procesados en una EDAR, es necesario emplear un sistema que sea económicamente viable.

La recuperación de la biomasa mediante coagulación-floculación combinada con


decantación/flotación junto con un posterior desecado de la biomasa mediante centrifugación o
sedimentación ha sido presentado como el sistema más adecuado para su aplicación en el
tratamiento de aguas residuales (Christenson and Sims, 2011; Schenk et al., 2008). Los floculantes

33
CAPÍTULO 2

utilizados en los procesos convencionales del tratamiento del agua, como son sales de aluminio,
hierro o polielectrolitos, han demostrado ser efectivos para este propósito (Granados et al., 2012),
pues permiten obtener un cosechado con una concentración de biomasa de 30-40 g l-1 y
eficiencias superiores al 95 % (Acién et al., 2016).

En el caso del tratamiento de aguas residuales mediante microalgas, se obtendrán grandes


cantidades de biomasa en función de la disponibilidad de nutrientes, pudiendo llegar a alcanzar
1 kg de biomasa por cada metro cúbico de agua residual procesada, siendo este valor 5 veces
superior al que se obtendría de los lodos en tratamientos convencionales (Acién et al., 2016).
Debido a la gran cantidad de biomasa producida, es necesaria una adecuada gestión para que
suponga un beneficio y no una limitación a la implantación de las microalgas en el tratamiento de
aguas residuales. Una alternativa es la digestión anaerobia de la biomasa para producir biogás
junto con los sistemas convencionales utilizados en la línea de lodos de una EDAR. Sin embargo,
son necesarios pre-tratamientos de la biomasa con el objetivo mejorar su biodegradabilidad
(Doğan-Subaşı and Demirer, 2016; Heaven et al., 2011; Passos and Ferrer, 2015). Otra de las
opciones pasa por producir biofertilizantes y bioestimulantes para uso agrícola, debido al alto
contenido en nitrógeno de la biomasa. Es necesario un tratamiento, como la hidrólisis enzimática,
para liberar los compuestos y estabilizar la biomasa para su uso comercial (Romero García et al.,
2012). Además de proporcionar nutrientes, la biomasa de microalgas es una fuente de
fitohormonas y estimulantes del crecimiento (García-González and Sommerfeld, 2016), por lo que
la biomasa tiene un alto valor agrícola. Actualmente se está investigando la utilización de este tipo
de biomasa como alimento para animales, productos químicos, bioplásticos o biocombustibles
(Hwang et al., 2016; Zeller et al., 2013).

2.7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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50


Capítulo 3

Objetivos

Objetivos

3.1. OBJETIVOS

La creciente preocupación social y científica derivada de la presencia de fármacos como


contaminantes emergentes en las aguas deja patente la necesidad de investigar en tratamientos
alternativos, sostenibles y de bajo coste. En este sentido, tal y cómo se ha mostrado en la
introducción general y en los antecedentes, la aplicación de las microalgas como sistemas de
biorremediación para en la eliminación de nutrientes de las aguas residuales ha sido ampliamente
estudiada. Sin embargo, la capacidad de las microalgas para eliminar fármacos del agua ha sido aún
poco investigada. A pesar de que estos tratamientos han sido considerados como prometedores, es
necesario investigar para continuar recabando información. En este contexto, el principal objetivo
de la presente tesis ha sido estudiar la aplicación de las microalgas como sistema de
biorremediación de aguas contaminadas por nutrientes y fármacos. Para alcanzar este objetivo
fueron planteados los siguientes objetivos específicos:

i. Determinar si el crecimiento de Chlorella sorokiniana, Chlorella vulgaris y Scenedesmus


obliquus se ve afectado por la presencia de los fármacos paracetamol, ácido salicílico y
diclofenaco.

ii. Evaluar la eficiencia de eliminación de nitratos y fosfatos mediante microalgas en


cultivo discontinuo y semicontinuo, estudiando además si dicha eficiencia se ve
influenciada por la presencia de fármacos.

iii. Determinar la eficiencia de eliminación de los fármacos paracetamol, ácido salicílico y


diclofenaco en cultivo discontinuo y semicontinuo mediante el cultivo de microalgas.

iv. Estudiar la aplicación de la microalga Chlorella sorokiniana como sistema de


tratamiento de fármacos en altas concentraciones relativas, en cultivo discontinuo y
semicontinuo.

v. Evaluar la separación de la biomasa de microalgas del agua tratada mediante


coagulación‐floculación, estudiando diferentes agentes floculantes en función de la
especie de microalga y modo de cultivo.

vi. Determinar la eficiencia de las microalgas en la disminución de la toxicidad del agua


tras la biorremediación de fármacos mediante el estudio de los efectos producidos en
el desarrollo embrionario de pez cebra (Danio rerio).

Los objetivos anteriores fueron abordados en las publicaciones que constituyen la tesis.
Específicamente, los objetivos i, ii, iii fueron contemplados en los Artículos I, III y IV; el objetivo iv
en el Artículo II; el objetivo v en el Artículo I y III; mientras que el Artículo V se centró en el objetivo
vi.

53

Capítulo 4
Artículo I
Nutrients and pharmaceuticals removal from wastewater by
culture and harvesting of Chlorella sorokiniana

C. Escapa, R.N. Coimbra, S. Paniagua, A.I. García, M. Otero


Bioresource Technology, 185 (2015): 276-284
Bioresource Technology 185 (2015) 276–284

Contents lists available at ScienceDirect

Bioresource Technology
journal homepage: www.elsevier.com/locate/biortech

Nutrients and pharmaceuticals removal from wastewater by culture


and harvesting of Chlorella sorokiniana
C. Escapa ⇑, R.N. Coimbra, S. Paniagua, A.I. García, M. Otero
Department of Applied Chemistry and Physics, Institute of Environment, Natural Resources and Biodiversity (IMARENABIO), University of León, 24071 León, Spain

h i g h l i g h t s g r a p h i c a l a b s t r a c t

 Removal of nitrates and phosphates


was close to 100% at the end of the
batch.
 Phosphates removal was higher than
nitrates in the semicontinuous
culture.
 Removal of salicylic acid and
paracetamol was around 70% at the
end of the batch.
 Removal rates were 2.3 times higher
for salicylic acid than for paracetamol.
 AlCl3 provided efficiencies above 95%
in 1 min with 200 mg g1 dose.

a r t i c l e i n f o a b s t r a c t

Article history: This work aimed to study both the removal of nutrients and pharmaceuticals, namely salicylic acid or
Received 22 January 2015 paracetamol, from water by the culture of Chlorella sorokiniana. The removal of nutrients was nearly com-
Received in revised form 26 February 2015 plete at the end of the batch culture; above 70% for nitrates and 89% for phosphates in the semicontinu-
Accepted 1 March 2015
ous culture. The pharmaceuticals removal kinetics were 2.3 times greater for the salicylic acid than
Available online 6 March 2015
paracetamol, reaching volumetric efficiencies above 93% for salicylic acid in the semicontinuous culture.
Finally, to separate the microalgae biomass from treated water, metal salts, synthetic polyelectrolytes
Keywords:
and a biopolymer were tested as coagulants–flocculants. The best flocculation results were achieved with
Microalgae
Emerging contaminants
AlCl3 (95.23% with 200 mg g1, 1 min incubation time). However, given that resulting flocs had different
Acetaminophen characteristics, flocculants must be chosen on the basis of the subsequent use of the biomass.
Salicylic acid Ó 2015 Elsevier Ltd. All rights reserved.
Coagulation–flocculation

1. Introduction at trace concentrations (lg l1, ng l1) in natural waters, their


potential adverse effects have increased scientific and social con-
The recent development of more sensitive analytical methods cern about the risks for human health and environment.
has allowed the detection and quantification of new pollutants in Owing to the continuous introduction in the environment and
natural waters, whose presence in the environment is not their cumulative effect, these emerging contaminants (ECs) have
necessarily new. Even though these compounds are often found been detected in natural waters, wastewaters and drinking water.
These ECs include pharmaceuticals, personal care products, surfac-
tants, industrial additives and various chemicals that, coming from
⇑ Corresponding author at: Department of Applied Chemistry and Physics, different origins, are discharged either into natural streams either
Institute of Environment, Natural Resources and Biodiversity (IMARENABIO),
into sewers (Bolong et al., 2009). In fact, their presence in natural
University of León, Avenida de Portugal 41, 24071 León, Spain. Tel.: +34 987293378.
E-mail addresses: carla.escapa@unileon.es (C. Escapa), ricado.decoimbra@
waters is mostly related to the inability of conventional sewage
unileon.es (R.N. Coimbra), spanb@unileon.es (S. Paniagua), ana.garcia@unileon.es treatment plants (STPs) to remove these ECs and their metabolites
(A.I. García), marta.otero@unileon.es (M. Otero).

http://dx.doi.org/10.1016/j.biortech.2015.03.004
0960-8524/Ó 2015 Elsevier Ltd. All rights reserved.

57
C. Escapa et al. / Bioresource Technology 185 (2015) 276–284 277

from wastewater. As a result, these ECs are discharged into the filtration, gravity sedimentation, flotation and electrolytic meth-
receiving streams and STPs constitute a relevant source of these ods) (Granados et al., 2012), flocculation coupled with flotation/
pollutants for the environment. sedimentation process and subsequent further dewatering by cen-
Of particular concern is the presence of pharmaceuticals on trifugation or sedimentation, seems to be the most promising
account of their accumulation in tissues, reproductive damage, alternative (Schenk et al., 2008).
inhibition of cell proliferation and behavioural changes in organ- Several coagulants–flocculants have been studied extensively
isms for which they were not intended (Escher et al., 2011). (Rakesh et al., 2014; Granados et al., 2012; Sirin et al., 2012;
Among pharmaceuticals, paracetamol is easily accumulated in Papazi et al., 2010). Metal salts are used in wastewater treatment
aquatic environment due to its relative high solubility and process due to their high efficiency. Polyelectrolytes, which are
hydrophilicity. Moreover, it has been confirmed that 58–68% of also used in wastewater treatments, attached cells by physical or
paracetamol and their metabolites are excreted from the body dur- chemical linking, are required at lower doses, are biodegradable
ing therapeutic use (Muir et al., 1997). On the other hand, salicylic and have no toxic effects (Granados et al., 2012). In the last years
acid removal from aqueous solutions has received a great deal of have been emerged biodegradable organic compounds as chitosan,
attention in recent years due to its high toxicity and accumulation starch, alginic acid or guar gum; which are biodegradable and have
in the environment (Combarros et al., 2014). Furthermore, it is a no toxic effects on the recovery biomass (Singh et al., 2000).
common derivate of phenol and, therefore, it is a typical pollutant Therefore, the aim of this study was to determine the biore-
in industrial wastewaters. mediation potential of Chlorella sorokiniana to remove paracetamol
Wastewater from the pharmaceutical industry are mainly trea- and salicylic acid from water and if the presence of these pharma-
ted by chemical oxidation methods, but the harsh reaction condi- ceuticals affected microalgal growth. Furthermore, the simultane-
tions, the generation of secondary pollutants and high ous elimination of nitrates and phosphates, was also assessed.
operational cost associated, may made of these treatments a not Finally, different coagulants–flocculants were used at different
a desirable option (Wu et al., 2012). On the contrary, biodegrada- dosages to test their efficiency in the subsequent microalgae bio-
tion treatments are considered as an environmentally friendly mass recovery.
and low-cost choice. Some microorganisms have developed spe-
cialized enzymatic systems and metabolic pathways to access
2. Methods
pharmaceuticals as carbon and energy source, and converting
them to easily metabolizable substrates (Wu et al., 2012).
2.1. Microorganism and culture conditions
Despite there are preliminary studies about biodegradation of
pharmaceuticals by microorganisms (Combarros et al., 2014;
The microalgae strain used in this study was C. sorokiniana CCAP
Zhang et al., 2013; Wu et al., 2012; De Gusseme et al., 2011), to
211/8 K (UTEX Culture Collection). Inoculum for the experiments
our best knowledge there is not information available about biode-
was cultivated in 250 ml Erlenmeyer flasks in the standard culture
gradation of pharmaceuticals by microalgae.
medium Mann and Myers (Mann and Myers, 1968). The growth
On the other hand, it should be kept in mind that one of the
conditions were maintained constant, under controlled tempera-
pressing goals in a wastewater treatment is the need to remove
ture (25 ± 1 °C), irradiance (175 lE m2 s1) and photoperiod
high concentrations of nitrogen and phosphorus, up to the limits
(12:12).
set by the European Commission Directive 98/15/EEC. It is well-
Experiments were carried out in bubbling column PBRs with
known that microalgae can play an important role in phytore-
spherical bases (40 mm diameter and 300 mm height with
mediation of wastewaters. Extensive research have been con-
300 ml capacity), keeping an operating volume of 250 ml. All reac-
ducted to determine the feasibility of cultivating microalgae in
tors were inoculated with the same volume of pre-cultured
wastewater and removing organic carbon and inorganic nutrients,
microalgae to ensure the same initial concentration, about 3.106 -
such as nitrogen and phosphorus from these polluted effluents.
cells ml1. Culture conditions were kept constant under controlled
Gómez et al. (2013) reported the feasibility of the biomass produc-
in temperature (25 ± 1 °C), irradiance (370 lE m2 s1) and pho-
tion of Muriellopsis sp. using secondary-treated wastewater cou-
toperiod (12:12), inside a vegetal culture chamber. Culture med-
pled with the depuration wastewater process. This system
ium was the same used for the inoculum growth. PBRs were
allowed a reduction in the biomass production costs by decreasing
illuminated by 8 fluorescent lamps (58 W, 2150 lumen, Philips,
freshwater and nutrients consumption, and provided simultane-
France) and aerated at a rate of 0.3 v/v/min with CO2 enriched at
ously a depuration process. Under these conditions, the culture
7% v/v, which was injected on demand to keep a constant pH
was nitrogen-limited which supposed a metabolism directed at
(pH = 7.5 ± 0.5) as controlled by a pH sensor. Before injection, the
carbohydrates and lipids accumulation. Domínguez Cabanelas
air was filtered through 0.2 lm sterile air-venting filter (Millex-
et al. (2013) researched about the use of several streams from sev-
FG50, Millipore).
eral stages of municipal wastewater as culture medium for
Chlorella vulgaris production. The bests results about biomass pro-
duction were obtained with the centrate, with removal rates of 9.8 2.2. Removal of pharmaceuticals and nutrients
(N) and 3.0 (P) mg l1 day1. Furthermore, the removal of nitrogen
and phosphorus from wastewater by microalgae culture has been 2.2.1. Experimental set-up
extensively studied and results indicate that this culture may be Reactors were operated in batch mode until the end of the
a promising bioremediation process (Arbib et al., 2013; Aslan and exponential growth, following by a semicontinuous mode until
Kapdan, 2006; de-Bashan et al., 2002). the culture parameters remained constant. The daily dilution rate
After wastewater treatment by microalgae, it is necessary to in this state was 30% of the culture volume, which was replaced
separate the biomass from the treated water. This separation also with fresh medium. Experiments were carried out simultaneously
allows biomass recovery for further potential use as feedstock for in all the reactors, under identical conditions.
biodiesel, bioactive molecules, pigments and nutraceuticals Two types of experiments were carried out: inoculated culture
(Gupta et al., 2013). The contribution of biomass recovery to the medium with 25 mg l1 paracetamol (PC) and inoculated culture
total cost of the biomass production has been estimated at 20– medium with 25 mg l1 salicylic acid (SaC). In each case, trials also
30% (Grima et al., 2003). Even though several techniques have been included a positive control with inoculated culture medium (C+)
applied in harvesting microalgae (centrifugation, flocculation, and the corresponding negative control with 25 mg l1 PC (CP-)

58
278 C. Escapa et al. / Bioresource Technology 185 (2015) 276–284

or 25 mg l1 SaC (CSa-). Paracetamol (C8H9NO2) was supplied by 2.3. Coagulation–flocculation


Roic Pharma and salicylic acid (C7H6O3) by Panreac. All assays were
performance in triplicate. 2.3.1. Experimental set-up
Throughout the experiments, the culture growth was daily Culture remained in batch mode until the exponential growth
monitored by biomass concentration and cell density. The concen- finished, followed by semicontinuous mode with a 30% dilution
tration of nitrate and phosphate was determined at the beginning rate of culture volume.
and the end of the batch culture and daily during the semicontinu- Metal salts, synthetic polyelectrolytes and a biopolymer were
ous culture. Moreover, in order to assess the removal of pharma- tested to determine the minimum dosage that ensures recovery
ceuticals, the concentration of paracetamol and salicylic acid was efficiencies of biomass higher than 95%. Iron chloride (FeCl3) and
daily monitored. aluminium chloride (AlCl3) were used as metal salts, supplied by
Panreac. Synthetic polyelectrolytes were supplied by Chemipol,
2.2.2. Analytical methods sold as chemifloc CH-35 (strong cationic polymers) and chemifloc
Biomass concentration (Cb) was determined by optical density CH-15 (medium cationic polymers), both with high molecular
at 680 nm (OD680) by spectrophotometric (UV/visible spectropho- weight and being used in industrial and urban wastewater treat-
tometer BECKMAN DU640) and verified by dry weight. ment processes. Chitosan was supplied by Acofarma as biopoly-
Preliminary studies were conducted to determinate the relation- mer. Doses of each coagulant were expressed as mg of coagulant
ship between dry weight and OD680 as shown in Eq. (1): per g of microalgae biomass.
Flocculation assays were performed in test-tubes using 25 ml
OD680 ¼ 5:1834  C b þ 0:0128; R2 ¼ 0:9983 ð1Þ harvest volume. Flocculants were previously dissolved in water;
metal salts and chitosan were dissolved at 10 mg ml1, and syn-
Dry weight measurements were performed by filtering 10 ml of
thetic polyelectrolytes at 2 mg ml1. To ensure complete solubility
culture through a 0.45 lm Whatman filter and washing with 20 ml
of the coagulant and to favour more collisions between colloids
HCl (0.5 M) to dissolve precipitated salts. Then, the filtrate was
and their possibility of aggregation, each dose was added under
dried in an oven at 80 °C for 24 h. Additionally, the growth of the
intense stirring at 150 rpm during 2 min. Following this, the stir-
culture was measured as cell density (Nc) by cell counting with a
ring was reduced (80 rpm, 5 min) to favour the formation of flocs
Neubauer chamber.
and avoid their mechanical breakage. After that, the suspension
Nitrates (N-NO3) were measured by the ultraviolet spec-
was placed in the test-tube, in which the flocculation efficiency
trophotometric screening method, according to Standard
was measured after 0, 1, 5, 10, 15, 30 and 60 min. Samples of
Methods 4500-NO 3 B (APHA, 2008); and phosphates were mea-
1 ml were taken from the clarified zone and the biomass concen-
sured by the ascorbic acid method, according to the Standard
tration was measured by absorbance at 680 nm.
Methods 4500-P E (APHA, 2008).
A first series of experiments was performed to study the effi-
A Waters HPLC 600 E equipped with a 2996 Photodiode Array
ciency of five doses of each coagulant with the biomass harvested
Detector was used for the quantification of the target pharmaceu-
at the end of the batch culture. Then, on the basis of the results
ticals. The wavelengths of detection were 246 and 236 nm for
from this first stage, a second series of trials was carried out at
paracetamol and salicylic acid, respectively. A Phenomenex
the semicontinuous mode to establish the corresponding optimal
Gemini-NX C18 column (5 lm, 250 mm  4.6 mm) was used for
doses of each coagulant. Furthermore, verification tests were car-
the separation. The mobile phase consisted of a mixture of acetoni-
ried out to confirm if the age of the culture had any influence in
trile:water (30:70, v/v) for the analysis of paracetamol and a mix-
the flocculation behavior. For this purpose, the two most efficient
ture of acetonitrile:water:orthophosphoric acid (70:30:0.1, v/v/v).
flocculants and doses at the steady state were tested with the bio-
HPLC quality acetonitrile (CH3CN) from LAB-SCAN, orthophospho-
mass harvested at the end of a batch culture of 4 days age follow-
ric acid (H3PO4) from Panreac and ultrapure water obtained by a
ing the steady state. Finally, the best flocculant and doses obtained
Millipore System were used for the preparation of the mobile
determined at the semicontinuous mode, were assayed with the
phase. Before use, each mixture was passed through a Millipore
biomass harvested in experiments on the removal of paracetamol
0.45 lm pore size filter and degasified in an ultrasound bath dur-
and salicylic acid to test the influence of these drugs in the coagu-
ing 30 min. For the chromatographic analysis, the mobile phase
lation–flocculation process. All experiments were run in triplicate,
flow rate was 1 ml min1 and the injection volume was 50 lL.
under room temperature and at the pH value of the culture med-
Before analysis, all the samples were centrifuged twice at
ium (7.5 ± 0.5).
7500 rpm for 10 min (SIGMA 2-16P centrifuge).

2.3.2. Analytical methods


2.2.3. Statistical analysis
Biomass concentration was measured by optical density at
Growth kinetics were resolved in OriginPro 8, using the logistic
680 nm by a UV/visible spectrophotometer (BECKMAN DU640)
model, a sigmoidal curve model which describes the relationship
Biomass recovery was calculated from the biomass concentration
between a microorganism’s growth and density in limited environ-
ratio at the clarified zone (Cbt) versus the culture concentration
mental conditions Eq. (2):
at the beginning of the experiment (Cbi), Eq. (3):
K  
N¼ ð2Þ Cbt
1 þ eart Recovery of biomass ¼ 1   100 ð3Þ
Cbi
1 1
where N (g l ) is the algal density at time t (h), K (g l ) is the car-
rying capacity (the maximum algal density reached in the culture),
a is a constant in the logistic model which indicates the relative 3. Results and discussion
position from the origin, and r (d1) is the specific growth rate.
Removal kinetics were also resolved in OriginPro 8, using the 3.1. Removal of pharmaceuticals and nutrients
logistic model.
Then, the software was also used to perform an analysis of vari- The microalgae growth curves and their fittings to the logistic
ance, of growth and removal kinetic parameters, using as mean kinetic model, including the positive control and the two treat-
comparison the Fisher LSD test. ments with drugs, are represented as values of biomass versus

59
C. Escapa et al. / Bioresource Technology 185 (2015) 276–284 279

Respect to microalgae growth rate r, there were significant differ-


ences (p 6 0.05) between the two treatments with drugs. On the
other hand, daily dilutions rates in the semicontinuous culture pro-
duced instability. As a consequence, the growth rate declined
throughout several days until parameters remained constant dur-
ing the steady state at lower values of biomass concentration. In
spite of the higher growth in the batch mode, a larger the biomass
concentration decline was observed for PC and SaC, as compared
with C+. This larger decline may be consequence from an extra
instability in the culture caused by the semicontinuous input of
drugs.
Growth rates obtained in this research were quite higher (above
0.93 day1 for C+, 0.96 day1 for PC and 0.76 day1 for SaC)
(Table 1), than those reported by Kumar et al. (2014) for the same
Fig. 1. Growth curves of Chlorella sorokiniana for: C+ d, PC N and SaC . Dots specie (0.1 day1). Domínguez Cabanelas et al. (2013), described
correspond to experimental data and continuous lines correspond to fittings by the growth rates for C. vulgaris below 0.38 day1 with different domes-
logistic kinetic model during batch culture. Note: experimental points obtained tic wastewaters and a maximum biomass of 1.52 g l1.
during semicontinuous culture are connected with dashed lines.
Nevertheless, Arbib et al. (2013), reported growth rates for
Scenedesmus obliquus close to 1 day1.
time in Fig. 1. All the treatment showed a typical batch growth To evaluate the potential of C. sorokininana as bioremediation
with an exponential phase of about 5 days. The differences among system, the nutrient uptake in each reactor was evaluated. The
the treatments were analysed according to growth kinetic parame- efficiencies in the removal of nitrates and phosphates by the
ters (Table 1). There were no significant differences (p > 0.05) microalgae are displayed in Fig. 2. At the end of the batch culture,
respect the parameter a, which refers to the relative position from nitrates and phosphates removal was close to 100% since the end of
the origin. Therefore, all the treatments revealed the same beha- the exponential growth phase was caused by the depletion of
viour in the lag phase. The end of the exponential growth phase nutrients. At this stage, the removal rates were significantly differ-
was reached in 8 days with C+ and PC and in 9 days with SaC. As ent (p 6 0.05) between SaC and C+. Then, at the steady state, aver-
it can be seen, the treatments with drugs achieved higher biomass age values (Fig. 2) showed that phosphates, with removal rates
concentration than the positive control, the parameter K being sig- higher than 89% for C+ and 99% for the treatments with drugs, were
nificantly different (p 6 0.05) from that of the control. These results more efficiently removed than nitrates. The experimental data in
may be explained by the fact that both drugs were an additional semicontinuous culture revealed significant differences between
source of organic carbon (besides injected CO2) and it is well SaC and C+ in the removal of nitrates; and among the two treat-
known that the genus Chlorella can have a mixotrophic growth. ments with drugs and C+ in the removal of phosphates.

Table 1
Logistic model kinetic parameters (K, a, r) of Chlorella sorokiniana growth and experimental data of their growth (Cbo, Nco, Cbm, Ncm).

C+ PC SaC
Cbo (g l1) 0.0356 ± 0.0000 0.0356 ± 0.0000 0.0356 ± 0.0000
Nco (cell ml1) 3.20  106 ± 0.00 3.20  106 ± 0.00 3.20  106 ± 0.00
Cbm (g l1) 1.4100 ± 0.2907 2.0465 ± 0.0342 2.0545 ± 0.1507
Ncm (cell ml1) 2.12  108 ± 4.88  107 4.20  108 ± 2.17  107 3.15  108 ± 8.48  106
K (g l1) 1.4039 ± 0.2923 2.0901 ± 0.0224 2.1350 ± 0.1318
a 3.7749 ± 0.0053 4.3349 ± 0.2070 4.1589 ± 0.4765
r (d1) 0.9395 ± 0.0572 0.9627 ± 0.0650 0.7679 ± 0.1151
R2 0.9935 0.9939 0.9912

Abbreviations: Cbo = initial biomass; Nco = initial number of cells; Cbm = maximum biomass; Ncm = maximum number of cells; K = carrying
capacity; a = constant of logistic kinetic model; r = microalgae growth rate; R2 = correlation coefficient.

Fig. 2. Volumetric efficiencies of Chlorella sorokiniana in the removal of nitrates and phosphates in batch and semicontinuous culture.

60
280 C. Escapa et al. / Bioresource Technology 185 (2015) 276–284

Table 2
Volumetric efficiency and specific efficiency in the removal of nitrates and phosphates by Chlorella sorokiniana in the steady state of a semicontinuous culture.

C+ PC SaC
1 1
Volumetric efficiency (mg l d ) NO
3 159.43 ± 9.82 167.04 ± 12.31 180.25 ± 3.46
PO3
4 14.65 ± 0.12 16.33 ± 0.03 16.34 ± 0.02
Specific efficiency (mg g biomass1 d1) NO
3 153.24 ± 12.08 142.86 ± 8.68 216.56 ± 12.82
PO3
4 14.11 ± 0.40 13.98 ± 0.26 19.59 ± 0.86

The obtained results may be explained by the nitrogen and


phosphorus ratio (N:P). The general microalgae composition was
determined by the Redfield ratio (C106H181O45N16P) (Redfield,
1958) and therefore, a N:P ratio of 16:1 is required for an optimal
growth. However, the culture medium used in the experiments
(Mann and Myers, 1968) has a ratio of 9.3:1 so, theoretically, has
a limitation in nitrogen. The ratio remained close to 9 at the end
of the batch culture and an efficient simultaneous elimination of
nitrogen and phosphorus took place. These results are in concor-
dance with those obtained by Arbib et al. (2013), who reported that
for an efficient simultaneous elimination of nutrients, a N:P ratio
between 9 and 13 is required for S. obliquus. They reached 95%
nitrogen removal and 100% phosphorus removal for the optimal
ratio. In the semicontinuous culture the N:P ratio increased over
time due to the higher removal efficiency of phosphate and the
daily addition of fresh medium, which caused an increase in the
relation N:P up to a value of 26. In this case, there was a limitation Fig. 3. Volumetric efficiency in the removal of paracetamol and salicylic acid of
Chlorella sorokiniana during batch culture. Dots correspond to experimental data
of phosphorus, as occurs in STPs, and therefore nitrates removal
and continuous lines correspond to fittings by the logistic kinetic model.
was not complete.
Average values of removal rates of the steady state are
expressed as volumetric performance and specific performance in Table 3
Table 2, for an initial concentration of 729.53 mg l1 of nitrates Logistic model kinetic parameters (K, a, r) of Chlorella sorokiniana for the removal of
pharmaceuticals in the batch culture. Volumetric efficiency and specific efficiency in
and 54.53 mg l1 of phosphates. The obtained results confirm that
the steady state of the semicontinuous culture.
microalgae may be applied for the removal of nutrients removal
from wastewaters due to their high removal rates. However, it is PC SaC
necessary to mention that secondary-influent wastewater has val- K (mg l )
1
17.6168 ± 0.9108 17.6789 ± 0.9589
ues much lower, with a typical concentration of ammonia nitrogen a 4.4924 ± 0.2380 10.2002 ± 3.1565
of 20–40 mg l1 and phosphorus of 1–10 mg l1 (McGinn et al., r (d1) 1.0143 ± 0.0551 4.0668 ± 1.2052
R2 0.9941 0.9919
2011). Nevertheless, several researchers (Aslan and Kapdan, 3.1309 ± 0.2158 6.9806 ± 0.3097
Volumetric efficiency (mg l1 d1)
2006; Arbib et al., 2013; Domínguez Cabanelas et al., 2013; Specific efficiency 2.6836 ± 0.2587 8.3440 ± 1.2060
Gómez et al., 2013) have proven the feasibility of microalgae (mg g biomass1 d1)
production using the effluent from the different stages at STPs. Abbreviations: K = carrying capacity; a = constant of logistic kinetic model;
Results obtained by these researchers demonstrate that the r = pharmaceutical removal rate; R2 = correlation coefficient.
biomass productivity is compatible with removal of nutrients from
wastewater. with values 2.3 times greater for the salicylic acid, reaching their
In order to determine the removal of pharmaceuticals, the daily maximum removal capacity with only 4 days of culture time. In
concentration of paracetamol in PC and that of salicylic acid in SaC any case, at the end of the batch culture, efficiencies above 67%
reactors were compared to the concentrations of these pharmaceu- for paracetamol and 73% for salicylic acid were achieved.
ticals in the corresponding C-. For both pharmaceuticals it was no Furthermore, the relation between the growth kinetics and
observed any decrease of concentration in the respective C-. On the pharmaceuticals removal kinetics in the batch culture was studied.
contrary, paracetamol and salicylic acid content decrease through- There was a constant correspondence for the removal of paraceta-
out time in PC and SaC reactors, respectively. This decrease was mol respect the biomass concentration (8.27 ± 0.54 mg of paraceta-
associated to the removal by C. sorokiniana microalgae. The mol g1 biomass), but there was an exponential increase in the case
removal curves of paracetamol and salicylic acid and the of salicylic acid (up to 53.92 mg of salicylic acid g1 biomass).
corresponding fittings to the logistic kinetic model for the batch On the other hand, the average volumetric efficiencies for the
culture, are showed in Fig. 3. The removal curves display a similar pharmaceuticals removal in the steady stage of the semicontinu-
trend than growth curves, since the removal rates increase is ous culture were 93 ± 2.25% for salicylic acid and 41.75 ± 1.01%
related with the biomass concentration increase. The removal dif- for paracetamol. Therefore, the volumetric efficiency for salicylic
ferences between the two drugs assayed were analysed according acid was 2.2 times higher than for paracetamol.
to the kinetic parameters of the logistic model (Table 3). There No prior studies about pharmaceuticals removal by microalgae
were significant differences (p 6 0.05) respect the parameter a, were found and the information available about other microorgan-
which indicated that the beginning of the removal of salicylic acid isms is scarce. Bacterial biodegradation of paracetamol has been
had a delayed response. Despite the maximum capacity of removal studied by several authors (Zhang et al., 2013; Wu et al., 2012;
did not revealed significant differences (p > 0.05), the removal De Gusseme et al., 2011), achieving high or complete degradations,
kinetic was much quicker for the salicylic acid than for paraceta- even at initial concentration of 2500 mg l1 (70 h) by a species of
mol. The removal rates revealed significant differences (p > 0.05), genus Pseudomonas (Zhang et al., 2013). On the other hand,

61
C. Escapa et al. / Bioresource Technology 185 (2015) 276–284 281

Combarros et al. (2014) claimed that the biodegradation of salicylic the culture affected the efficiency of flocculation. Differences in
acid by Pseudomonas putida achieved an efficiency of 100% (8 h) the recovery values may be explained by the dependence on the
and 94.7% (24 h) for 100 and 500 mg l1, respectively. composition of the cell wall, the age of the culture, the extent
and type of excretions, physiological conditions and other factors
3.2. Coagulation–flocculation (Avnimelech et al., 1982). Furthermore, the biochemical com-
position of the cell surface is known to vary between exponential
Natural sedimentation of C. sorokiniana was practically non- and steady state cultures, resulting in different flocculation beha-
existent, even with incubation times greater than 60 min (results viour (Danquah et al., 2009; Henderson et al., 2008). In addition,
not shown). This is due to a combination of the small cell size of microalgae excrete organic matter, such as polysaccharides and
the microalgae (3–5 lm), their low concentration in the culture proteins, which are accumulated into the growth medium and
medium (0.5–2.5 g l1), and the electrostatic repulsive forces can compete with the algal surface for the flocculants (Zhang
among cells (Grima et al., 2003). Therefore, their sedimentation et al., 2012; Chen et al., 2009). Chemical flocculation with metal
velocity is lower than 106 m s1 which leads to a non-efficient salts (Zn2+, Al3+ and Fe3+) has been extensively studied and has
process (Granados et al., 2012). been reported that aluminium salts usually have better removal
Flocculation results for metal salts are shown in Fig. 4. It can be rates than iron salts (Papazi et al., 2010). On the other hand, ferric
observed that AlCl3 presented higher efficiencies than FeCl3 for the salts caused changes in the colour of the cells with high concentra-
same dose. Efficiencies higher than 95% were achieved (1 min tion dose and gave yellowish colour to the supernatant, as shown
incubation time), with the biomass harvested at the end of batch by Papazi et al. (2010). Published studies show lower efficiencies
culture (Fig. 4a and b). The doses that proved to be more efficient than those we achieved, neither in the batch culture not in the
were 200 mg g1 for AlCl3 (95.23 ± 0.51%, 1 min) and 250 mg g1 semicontinuous culture. Efficiencies lower than 90% in the recov-
for FeCl3 (98.35 ± 0.46%, 1 min) (Figs. S1 and S2 in supplementary ery of Chlorella minutissima, biomass harvested in a batch culture,
data). In any case, incubation times higher than 15 min led to an with 500 mg l1 of AlCl3 and FeCl3 for a sedimentation time of
improvement of the recovery below 5%. On the other hand, recov- 200 min and a biomass concentration of 2.20. 108 cells ml1
ery efficiencies of the biomass harvested in the steady state are (Papazi et al., 2010). Rakesh et al. (2014) reported efficiencies
shown in the Fig. 4c and d. The aluminium salt provided a recovery below 70% in the recovery of 2 week batch culture of C. sorokiniana
of 88.44 ± 1.47% for 200 mg g1 and the iron salt 86.31 ± 1.43% for with 200 mg l1 of aluminium sulphate and below 85% with
250 mg g1 (60 min incubation time). These recovery values are 200 lM of ferric chloride. Meanwhile, Granados et al. (2012)
lower than those achieved with the same dosage in the batch stage, claimed a low recovery efficiency of 30% with 20 mg l1 of iron
when both salts showed performances higher than 98%. Then, fol- chloride and lower than 15% with 70 mg l1 of aluminium sulphate
lowing the steady state, the verification tests that were next car- in the recovery of Muriellopsis sp. (2.0 g l1 biomass concentration,
ried out with the aluminium salt showed efficiencies higher than 15 min incubation time) from a semicontinuous culture.
90% (15 min incubation time) for the biomass harvested after Flocculation results achieved by synthetic polyelectrolytes are
4 days of batch. Therefore, it may be concluded that the age of displayed in Fig. 5. As it may be seen, best efficiencies were

Fig. 4. Recovery efficiency of Chlorella sorokiniana biomass at the end of a batch culture with different doses of AlCl3 (4a) and FeCl3 (4b) and the recovery efficiency in the
steady state with AlCl3 (4c) and with FeCl3 (4d). The doses are expressed as mg of coagulant per g of biomass.

62
282 C. Escapa et al. / Bioresource Technology 185 (2015) 276–284

Fig. 5. Recovery efficiency of Chlorella sorokiniana biomass at the end of a batch culture with different doses of CH-35 (5a) and CH-15 (5b) and the recovery efficiency in the
steady state with CH-35 (5c) and CH-15 (5d). The doses are expressed as mg of coagulant per g of biomass.

obtained with the strong cationic polymer CH-35. At the end of the in the batch process (Fig. 6a) (Fig. S7 in supplementary data)
batch culture, efficiencies higher than 99.5% were achieved with showed that recoveries provided by chitosan were as low as
15 mg g1 of CH-35 and 98% with 20 mg g1 of CH-15 (1 min around 15%, which is in agreement with the low recoveries
incubation time) (Fig. 5a and b) (Fig. S3 and S4 in supplementary reported by other researchers (Granados et al., 2012). Sirin et al.
data). Similarly to the metal salts, incubation times longer than (2012) described that alkaline pH is necessary for efficient floccula-
15 min only supposed an improvement of 1% in the recovery. tion process with chitosan. In addition, it has been claimed that
This is consequence that the use of synthetic polyelectrolytes gen- auto-flocculation can be achieved with alkaline pH by adding
erated a single big floc immediately after the addition of the coagu- NaOH (Chen et al., 2011). This is explained by the fact that some
lant (Fig. S5 in supplementary data). On the other hand, recovery chemical ions can precipitate under alkaline conditions with the
efficiencies of the biomass harvested in the steady state are shown algal biomass and favour the flocculation process (Sirin et al.,
in the Fig. 5c and d. Also, as for metal salts, the recovery perfor- 2012). For this reason, in the assays with the harvested biomass
mance was lower than in the batch process, attaining, at the steady in steady state (Fig. 6b), the two best doses of the previous stage
state, efficiencies of 60.96% for 15 mg g1 CH-35 and 84.54% for were tested under pH 10, which was induced by the addition of
25 mg g1 CH-15. Regarding, the verification tests that were car- NaOH 1 N. Moreover, a chitosan dose of 500 mg g1 and then an
ried out with CH-35 following the steady state, after 4 days of induced pH 10 in the absence of chitosan were tested. The best
batch culture showed efficiencies higher than 90% (15 min incuba- results were obtained with 200 mg g1 dose under inducted pH
tion time). Again, the age of the culture was proved to affect the 10 which allowed for a biomass recovery of 69.21% with 15 min
efficiency of flocculation. Despite of their high and quickly effi- incubation time. The combination of chitosan and alkaline pH pro-
ciency in flocculation process, a limitation was detected with the vided better results than both factors separately. These results
floc viscosity, which caused cell aggregates that adhered to the agree with those by Rakesh et al., 2014, who reported the effect
wall of the test tubes (Fig. S6 in supplementary data). This aggrega- of alkaline pH values of 10 and 11 were effective for the most of
tion constitutes an important limitation for the retrieval of the bio- the strains tested but not showed any significant change for C.
mass, so impeding its subsequent use. Granados et al. (2012) sorokiniana MIC-G5. However, it has been described that 8.5–10.5
claimed that efficiencies higher than 90% were achieved in the pH values allow microalgae recovery rates above 90% with
recovery of Muriellopsis sp. (biomass harvested in a semicontinu- Phaeodactylum tricornutum (Sirin et al., 2012) or Anabaena marina
ous culture), with only 10 mg l1 of cationic polymer (EM 16), (González López et al., 2009). On the other hand, autoflocculation
which was characterized by medium charge density and med- with induced pH by cellular growth (without CO2 control), were
ium-large molecular weight (2.0 g l1 biomass concentration, assayed due to the positive previous results with alkaline pH.
15 min incubation time). The used of cationic polymers has been After a period of 2 days, 9.6 pH was reached and 200 mg g1 dose
previously reported for the microalgae flocculation although, the showed efficiencies below 20% (results not shown). These low
optimum doses depend on the nature of the polymer. results may be explained by the fact that autoflocculation is asso-
Flocculation results obtained with chitosan are represented in ciated with the formation of calcium and magnesium precipitates,
Fig. 6. For the tested doses, the results with the biomass harvested which can carry positive surface charges and may induce

63
C. Escapa et al. / Bioresource Technology 185 (2015) 276–284 283

Fig. 6. Recovery efficiency of Chlorella sorokiniana biomass at the end of a batch culture (6a) and in a steady state (6b) with different doses of chitosan. The doses are
expressed as mg of coagulant per g of biomass.

flocculation by charge neutralization. Calcium phosphate precipi- was faster removed from water than paracetamol in the batch cul-
tates are positive charged, but it is necessary calcium ions in excess ture. Then, in the semicontinuous culture the volumetric efficiency
and high phosphate concentrations (Vandamme et al., 2013). was higher for salicylic acid than for paracetamol. Finally, the floc-
However, in this work, due to the nutrients removal process asso- culants here used resulted in different efficiencies and flocs charac-
ciated to the microalgae growth, the level of nutrients at the end of teristics, which must be considered in the flocculant of choice
the batch process and at the steady state was low. Indeed, the con- depending on the subsequent use of the biomass.
centration of phosphates had been reduced by a 90% at the
moment when flocculation tests were carried out (Fig. 2). Acknowledgements
Eventually, considering 200 mg g1 AlCl3 as the most effective
flocculant and dose among all tested, it was used for the floccula- This research was supported by Spanish Ministry of Educations,
tion of the biomass harvested in the experiments on the removal of Culture and Sports (FPU12/03073), University of León (doctorate
drugs. The results did not reveal significant differences (p > 0.05) research program ULE-2014) and Spanish Ministry of Economy
between the positive control and the treatments with drugs, nei- and Competitiveness, State Secretariat for Research, Development
ther with the results already obtained in the previous flocculation and Innovation (RYC-2010-05634).
assays (Fig. 4a and c). The flocculation results of biomass harvested
at the end of the batch process showed efficiencies above 99%.
Likewise, the results with the biomass harvested in the steady state Appendix A. Supplementary data
showed efficiencies close to 90%, which were lower than for the
batch stage. Therefore, it can be assumed that the presence of Supplementary data associated with this article can be found, in
drugs in the water to be treated did not affect the AlCl3 flocculant the online version, at http://dx.doi.org/10.1016/j.biortech.2015.03.
efficiency. The flocculants nature and their concentration are 004.
determining factors in the efficiency of the process. Apart from
the flocculants price, depending on the destination of the microal- References
gal biomass and of the culture medium, potential contamination
caused by flocculants may be a key decision factor for their selec- APHA, 2008. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater,
22nd ed. American Public Health Association/American Water Work
tion because may limit further use or recycling of harvested bio- Association/Water Environmental Federation, Washington, DC.
mass. Although inorganic flocculants such as aluminium and iron Arbib, Z., Ruíz, J., Álvarez-Díaz, P., Garrido-Pérez, C., Barragan, J., Perales, J.A., 2013.
chloride are efficient, these are needed in relative high doses and Photobiotreatment: influence of nitrogen and phosphorus ratio in wastewater
on growth kinetics of Scenedesmus Obliquus. Int. J. Phytoremediation 15, 774–
can cause contamination of the biomass or the supernatant with
788.
aluminium or iron due to the excess of ions supplied (Granados Aslan, S., Kapdan, I.K., 2006. Batch kinetics of nitrogen and phosphorus removal
et al., 2012). However, they may be useful in wastewater treatment from synthetic wastewater by algae. Ecol. Eng. 28, 64–70.
Avnimelech, Y., Troeger, B.W., Reed, L.W., 1982. Mutual flocculation of algae and
because the use of biomass is a secondary objective and the excess
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of ions in the treated water may be removed by ion exchange col- Bolong, N., Ismail, A.F., Salim, M.R., Matsuura, T., 2009. A review of the effects of
umns (Rakesh et al., 2014). On the other hand, polyelectrolytes are emerging contaminants in wastewater and options for their removal.
expensive to use but they are not persistent, non bioaccumulative Desalination 239, 229–246.
Chen, L., Li, P., Liu, Z., Jiao, Q., 2009. The released polysaccharide of the
and biodegradable. Regarding chitosan, despite its non-toxic cyanobacterium Aphanothece halophytica inhibits flocculation of the alga with
effects, high doses are needed to reach medium efficiencies. ferric chloride. J. Appl. Phycol. 21, 327–331.
Moreover, characteristics of the formed floc were different for each Chen, C., Yeh, K., Aisyah, R., Lee, D., Chang, J., 2011. Cultivation, photobioreactor
design and harvesting of microalgae for biodiesel production: a critical review.
coagulant–flocculant and, therefore, are a determinant factor in the Bioresour. Technol. 102, 71–81.
subsequent use of the biomass (Fig. S8 in supplementary data). Combarros, R.G., Rosas, I., Lavin, A.G., Rendueles, M., Díaz, M., 2014. Influence of
biofilm on activated carbon on the adsorption and biodegradation of salicylic
acid in wastewater. Water Air Soil Pollut. 225, 1858.
4. Conclusions Danquah, M.K., Gladman, B., Moheimani, N., Forde, G.M., 2009. Microalgal growth
characteristics and subsequent influence on dewatering efficiency. Chem. Eng. J.
151, 73–78.
Nutrients removal by C. sorokiniana at the end of the batch cul- De Gusseme, B., Vanhaecke, L., Verstraete, W., Boon, N., 2011. Degradation of
ture was nearly complete. In the semicontinuous culture, owed to acetaminophen by Delftia tsuruhatensis and Pseudomonas aeruginosa in a
phosphorus limitation, phosphates removal rate was higher than membrane bioreactor. Water Res. 45, 1829–1837.
de-Bashan, L.E., Moreno, M., Hernández, J.P., Bashan, Y., 2002. Removal of
that of nitrates. Pharmaceuticals meant an additional source of ammonium and phosphorus ions from synthetic wastewater by the
organic carbon and resulted in a higher biomass. Salicylic acid microalgae Chlorella vulgaris coimmobilized in alginate beads with the

64
284 C. Escapa et al. / Bioresource Technology 185 (2015) 276–284

microalgae growth-promoting bacterium Azospirillum brasilense. Water Res. 36, McGinn, P.J., Dickinson, K.E., Bhatti, S., Frigon, J., Guiot, S.R., O’Leary, S.J.B., 2011.
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358–366. 97, 3687–3698.

65
SUPPLEMENTARY DATA

 
Fig. S1 Flocculation with AlCl3 with 1 hour incubation time at 100, 150,200, 250 and 300 mg g‐1
(from left to right)

 
Fig. S2 Flocculation with FelCl3 with 1 hour incubation time at 100, 150,200, 250 and 300 mg g‐1
(from left to right)

67 
 
 
Fig. S3 Flocculation with CH‐15 with 1 hour incubation time at 2.5, 5, 10, 15 and 20 mg g‐1 (from left
to right)

 
Fig. S4 Flocculation with CH‐35 with 1 hour incubation time at 2.5, 5, 10, 15 and 20 mg g‐1 (from left
to right)

68 
 
 

Fig. S5 Single big floc generated immediately after the addition of a synthetic polyelectrolyte

 
Fig. S6 Detail of the floc viscosity after the addition of a synthetic polyelectrolyte, which caused cell
aggregates that adhered to the wall of the glass during the previous stirring

69 
 
 
Fig. S7 Flocculation with chitosan with 1 hour incubation time at 20, 40, 100, 150 and 200 mg g‐1
(from left to right)

 
Fig. S8 Flocs generated after the addition of FeCl3, AlCl3, chitosan, CH‐35 and CH‐15 (from left to
right)

70 
 
Capítulo 5
Artículo II
Paracetamol and salicylic acid removal from contaminated
water by microalgae

C. Escapa, R.N. Coimbra, S. Paniagua, A.I. García, M. Otero


Journal of Environmental Management, (2016) doi: 10.1016/j.jenvman.2016.06.051
Journal of Environmental Management xxx (2016) 1e8

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Journal of Environmental Management


journal homepage: www.elsevier.com/locate/jenvman

Research article

Paracetamol and salicylic acid removal from contaminated water by


microalgae*
C. Escapa, R.N. Coimbra, S. Paniagua, A.I. García*, M. Otero*
n, 24071 Leo
Department of Applied Chemistry and Physics, Institute of Environment, Natural Resources and Biodiversity (IMARENABIO), University of Leo n,
Spain

a r t i c l e i n f o a b s t r a c t

Article history: The biomass growth, pharmaceutical removal and light conversion efficiency of Chlorella sorokiniana
Received 18 November 2015 under the presence of paracetamol (PC) and salicylic acid (SaC) were assessed and compared at two
Received in revised form different concentrations of these pharmaceuticals (I: 25 mg l1, II: 250 mg l1). Microalgae were resistant
15 June 2016
to these concentrations and, moreover, their growth was significantly stimulated (p  0.05) under these
Accepted 25 June 2016
Available online xxx
drugs (biomass concentration increased above 33% PCI, 35% SaCI, 13% PCII and 45% SaCII, as compared
with the respective positive controls). At the steady state of the semicontinuous culture, C. sorokiniana
showed removal efficiencies above 41% and 69% for PCI and PCII, respectively; and above 93% and 98% for
Keywords:
Chlorella sorokiniana
SaCI and SaCII, respectively. Under an irradiance of 370 mE m2 s1, higher quantum yields were reached
Pharmaceutical industry by microalgae under the presence of drugs, either at dose I or II, than by the respective positive controls.
Wastewater These results point to C. sorokiniana as a robust strain for the bioremediation of paracetamol and salicylic
Emerging contaminants acid concentrated wastewaters.
Bioremediation © 2016 Elsevier Ltd. All rights reserved.
Phycoremediation

1. Introduction treatment plants (STPs), which is probably the most investigated


route of entry. Still, some authors (Larsson et al., 2007; Carlsson
The global increase of the production and use of drugs has led to et al., 2009; Larsson and Fick, 2009) have pointed to the highly
a growing international awareness on the disposal of pharmaceu- concentrated effluents from drugs production facilities as impor-
tical wastes due to their potential deleterious effects (Halling- tant sources of pharmaceuticals to the environment. These
Sorensen et al., 1998). In the aquatic environment, the presence concentrated effluents should be appropriately treated to remove
of pharmaceuticals may cause physiological responses in organisms active pharmaceuticals ingredients (APIs) before discharge, either
for which they were not intended, such as accumulation in tissues, in natural waters or in the municipal sewage system.
reproductive damage, inhibition of cell proliferation and behav- To date, the nonexistence of limiting regulations (Bolong et al.,
ioural changes (Escher et al., 2011). 2009; Barcelo  and Petrovic, 2006) has led to a lack of control on
Pharmaceuticals are known to reach the environment through the discharge of APIs by manufacturing facilities (Larsson and Fick,
usage and/or inappropriate disposal (Khetan and Collins, 2007). 2009). However, given public concern about the presence of phar-
Therefore, main sources of pharmaceuticals in the environment maceuticals in the environment, it is expectable that regulations
include hospitals (Gupta et al., 2009; Sua rez et al., 2009; Escher will come out in the near future. Yet, conventional wastewater
et al., 2011; Verlicchi et al., 2012), landfill leachates (Andrews treatments were designed to eliminate carbon, nitrogen and
et al., 2012; Clarke et al., 2015) and effluents from sewage phosphorus, but not to remove APIs, which pose high biological
activity at low concentrations, are mostly hydrophilic and have low
adsorption rates (Martz, 2012).
Advanced oxidation processes (AOPs) such as oxidation, ozon-
*
This work was presented (and selected for possible publication by JEMA) at the
ation, perozonation, direct photolysis, TiO2 photocatalysis, solar
IWWATV Conference, which was held in Athens (Greece) from 21st to 23rd of May,
2015. photocatalysis, Fenton reactions and ultrasonic irradiation have
* Corresponding authors. been pointed as promising treatments for the removal of APIs from
E-mail addresses: carla.escapa@unileon.es (C. Escapa), ricado.decoimbra@ wastewater (Deegan et al., 2011). Nevertheless, the high opera-
unileon.es (R.N. Coimbra), spanb@unileon.es (S. Paniagua), ana.garcia@unileon.es tional costs, the harsh reaction conditions and the generation of
(A.I. García), marta.otero@unileon.es (M. Otero).

http://dx.doi.org/10.1016/j.jenvman.2016.06.051
0301-4797/© 2016 Elsevier Ltd. All rights reserved.

73
2 C. Escapa et al. / Journal of Environmental Management xxx (2016) 1e8

secondary pollutants are important disadvantages of this sort of medium, the PBRs and the tubing for the supply of air were ster-
treatments (Wu et al., 2012). Conversely, biodegradation treat- ilized in autoclave (121  C, 1 atm, and 20 min) to avoid contami-
ments are considered as a low-cost and environmentally friendly nations. In the experiments under the presence of paracetamol (PC)
option (Hasan et al., 2011; Chen et al., 2010). Although there are or salicylic acid (SaC), these drugs were added to the sterilized
preliminary studies about biodegradation of pharmaceuticals by culture medium but not submitted to the sterilization process so to
microorganisms (Combarros et al., 2014; Zhang et al., 2013; Wu guarantee their stability.
et al., 2012; De Gusseme et al., 2011), very few studies have been
carried out on the removal of pharmaceuticals by microalgae 2.2. Experimental set-up
(Gupta et al., 2015 and references within). On the contrary,
microalgae capacity to remove nutrients from wastewater is well PBRs were operated in batch mode until the end of the expo-
known, Choudhary et al. (2016) having highlighted the importance nential growth phase. Then, the operation mode was semi-
of the selection of robust strains/consortia that can efficiently grow continuous with a daily renewal rate of 30%. Therefore, under
under concentrated wastewaters. However, to our best knowledge, semicontinuous operation, 30% of the reactor culture volume was
there are not published results on microalgae resistance and effi- daily taken off and replaced by fresh medium (containing 25 mg l1
ciency under extreme concentrations of drugs, which may be ex- of either paracetamol or salicylic acid, in the case of PC and SaC
pected in wastewaters from pharmaceutical industry. treatments, respectively). PBRs were operated in semicontinuous
In this context, and after having proved the capability of Chlor- mode until stability of the growth parameters at the steady state.
ella sorokiniana to remove pharmaceuticals from water (Escapa The experiments carried out consisted of inoculated culture
et al., 2015), the aim of this work was to assess microalgae medium together with paracetamol (PC) or salicylic acid (SaC). Two
response towards relatively high drugs concentration. For this different and non-simultaneous sets of experiments were run un-
purpose, microalgae growth kinetics, pharmaceutical removal rates der two different concentrations of these pharmaceuticals: (i)
and light conversion efficiency under paracetamol and salicylic acid dosage I (25 mg l1), as described by Escapa et al. (Escapa et al.,
were evaluated and compared at two different concentrations of 2015), which were named as PCI and SaCI; and (ii) dosage II
these drugs, which are among the most consumed and found in (250 mg l1), named as PCII and SaCII, respectively. For each set of
natural waters worldwide. In the aquatic environment, paraceta- experiments, positive controls with inoculated culture medium
mol is easily accumulated due to its relative high solubility and without drugs (CþI and CþII, respectively) were run in parallel.
hydrophilicity (Muir et al., 1997). Regarding salicylic acid, its Also, negative controls with not inoculated culture medium but PC
toxicity and tendency to accumulate in the environment are well or SaC were run simultaneously with each concentration set of
known (Combarros et al., 2014). Therefore, results obtained in this experiments (CP-I, CSa-I and CP-II, CSa-II, respectively). The treat-
work are expected to contribute to the knowledge on the applica- ments and the abbreviations used in this work are displayed in
tion of microalgae on the bioremediation of wastewater, namely on Table s1 (as supplementary material). Three simultaneous repli-
the removal of emerging contaminants such as pharmaceuticals. cates of each treatment were operated under identical conditions
for each set of experiments. Paracetamol (C8H9NO2, 99%) was
2. Materials and methods supplied by Roic Pharma and salicylic acid (C7H6O3, 99%) by
Panreac. Physico-chemical properties of these pharmaceuticals are
2.1. Microorganism and culture conditions displayed in Table s2 (as supplementary material).
Throughout the experiments, the culture growth was daily
The microalgae strain used in this study was Chlorella sor- monitored by biomass concentration and cell density. Also, to
okiniana CCAP 211/8 K (UTEX Culture Collection). Inoculum for the assess the pharmaceuticals removal, the concentration of paracet-
experiments was cultivated in the standard culture medium Mann amol and salicylic acid was daily monitored. In addition, the irra-
and Myers (Mann and Myers, 1968) in 250 ml Erlenmeyer flasks. diance in the absence of cells in the central point inside of the PBR
The culture medium is composed of (grams per litre of distilled was measured to evaluate the light conversion efficiency of the
water): 1.2 MgSO4$7H2O, 1.0 NaNO3, 0.3 CaCl2, 0.1 K2HPO4, cells.
3.0  102 Na2EDTA, 6.0  103 H3BO3, 2.0  103 FeSO4$7H2O,
1.4  103 MnCl2, 3.3  104 ZnSO4$7H2O, 7.0  106 Co(N-
2.3. Analytical methods
O3)2$6H2O, 2.0  106 CuSO4$5H2O. The C. sorokininana inoculum
was maintained inside a vegetal culture chamber, where the
Biomass concentration (Cb) was determined by optical density at
growth conditions remained constant, under controlled tempera-
680 nm (OD680) by spectrophotometric (UV/visible spectropho-
ture (25 ± 1  C), irradiance (175 mE m2 s1), photoperiod (12:12)
tometer BECKMAN DU640) and verified by dry weight. Preliminary
and stirring (250 rpm).
studies were conducted to determine OD680 as a function of dry
Experiments were carried out in bubbling column photo-
weight as shown in Eq. (1):
bioreactors (PBRs) with spherical bases (40 mm diameter and
300 mm height with 300 ml capacity), keeping an operating vol-
OD680 ¼ 5:1834  Cb þ 0:0128; R2 ¼ 0:9983 (1)
ume of 250 ml. PBRs containing Mann and Myers medium were
inoculated with the above inoculum of C. sorokiniana in order to For the determination of dry weight, 10 ml of culture were
have an initial microalgae concentration of about 3.2  106 cells filtered through a 0.45 mm Whatman filter, which was then washed
ml1. Then, culture conditions were kept constant under controlled with 20 ml HCl (0.5 M) to dissolve precipitated salts, and dried in an
temperature (25 ± 1  C), irradiance (370 mE m2 s1) and photo- oven at 80  C for 24 h. Dry weight was then obtained by mass
period (12:12), inside a vegetal culture chamber. PBRs were illu- difference of the filter after and before filtration. Additionally, the
minated by 8 fluorescent lamps (58 W, 2150 lumen, Philips, France) growth of the culture was measured as cell density (Nc) by cell
and aerated at a rate of 0.3 v/v/min with CO2 enriched at 7% v/v, counting with a Neubauer chamber.
which was injected on demand to keep a constant pH A Waters HPLC 600 equipped with a 2487 dual l absorbance
(pH ¼ 7.5 ± 0.5) as controlled by a pH sensor. Before injection, the detector was used for the quantification of the target pharmaceu-
air was filtered through 0.2 mm sterile air-venting filter (Millex- ticals. The wavelengths of detection were 246 and 236 nm for
FG50, Millipore). At the beginning of the experiments, the culture paracetamol and salicylic acid, respectively. A Phenomenex C18

74
C. Escapa et al. / Journal of Environmental Management xxx (2016) 1e8 3

column (5 mm, 250 mm  4.6 mm) was used for the separation. The state of the semicontinuous culture specific efficiencies were given
mobile phase consisted of a mixture of acetonitrile:water (30:70, v/ as mgremoved g1 1
biomass d .
v) for the analysis of paracetamol and a mixture of acetoni- During the microalgae culture, the biomass extinction coeffi-
trile:water:orthophosphoric acid (70:30:0.1, v/v/v). HPLC quality cient (Ka, m2 g1) was determined by the following equation (Eq.
acetonitrile (CH3CN) from LAB-SCAN, orthophosphoric acid (5)):
(H3PO4) from Panreac and ultrapure water obtained by a Millipore
System were used for the preparation of the mobile phase. Before
use, each mixture was passed through a Millipore 0.45 mm pore size OD400700
Ka ¼ (5)
filter and degasified in an ultrasound bath (30 min). For the chro- Cb  r
matographic analysis, the mobile phase flow rate was 1 ml min1
and the injection volume was 50 ml. Before analysis, all the samples where OD400700 is the average optical density in the visible range,
were centrifuged twice at 7500 rpm for 10 min (SIGMA 2e16P which is determined by spectrophotometric analysis (UV/visible
centrifuge). spectrophotometer BECKMAN DU640) and r is the cuvette optical
path (m).
The average irradiance at which cells are exposed inside a cul-
2.4. Data analysis ture (Iav, mE m2 s1) was calculated on the basis of Ka, by the
equation defined by Grima et al (Grima et al., 1997). (Eq. (6)):
For the description, analysis and comparison of the experi-
mental results here obtained, different models and/or parameters
were determined according to the equations that are next depicted. I0
Iav ¼ ð1  expð  Ka  r  Cb ÞÞ (6)
The logistic equation (Eq. (2)) was used for mathematical modelling ðKa  r  Cb Þ
of microalgae biomass growth in batch culture. This classic model
was originally described by Verhulst (1838) and has been proved to where Io (mE m2 s1) is the irradiance in the absence of microalgae,
fit the growth of microalgae (Xin et al., 2010). Fittings of the and r is the light path inside the reactor (m).
experimental daily values of biomass concentration (N, g l1) The light conversion efficiency may be approached by the
versus time (t, h) to the logistic equation were determined by calculation of the quantum yield (JE, g E1). This represents the
OriginPro8, a scientific graphing and data analysis software. amount of microalgae biomass generated by unit of radiation
(usually a mole of photons) absorbed by the culture and may be
K calculated by the expression defined by Grima et al. (1997) (Eq. (7)):
N¼ (2)
1 þ eart

where the three parameters that have to be estimated are: K (g l1)


Pb
is the carrying capacity (the maximum algal density reached in the JE ¼ (7)
Fvol
culture), a is a constant in the logistic model which indicates the
relative position from the origin and indicates the duration of the
where Pb (g m3 d1) is the volumetric biomass productivity and
lag phase, and r (d1) is the specific growth rate.
Fvol (mE m3 d1) is the photon flux absorbed in the volume unit,
The logistic equation (Eq. (2)) was also used to describe the ki-
which may be calculated by applying Eq. (8) (Grima et al., 1997):
netics of the removal of pharmaceuticals in the batch culture. In this
case, for each pharmaceutical, N is the daily volumetric efficiency
(N, mgremoved l1); K (g l1) is the maximum removal capacity by Fvol ¼ Iav  Ka  Cb (8)
the microalgae; a is a constant indicating the duration of the lag
phase, that is, the delay in the removal of the target compound; and Considering the quantum yield (JE) defined by Grima et al.
r (d1) is the specific removal rate. OriginPro8 was used to deter- (1997) and aiming to determine the ratio between the removal of
mine the corresponding fittings of the experimental values of the pharmaceuticals and photon flux absorbed, a new equation was set
removal volumetric efficiency (N, mgremoved l1) versus time (t, h). in this work (Eq. (9)). In this equation, the removal yield (JR, g
For each pharmaceutical, the removal volumetric efficiency was removed E1) in microalgae cultures was defined as the amount of
calculated as indicated by the following equation (Eq. (3)): pharmaceutical removed by microalgae by unit of radiation
  absorbed by the culture (Eq. (9)):
Volumetric efficiency ¼ Cinf  Cefflu  D (3)

Rb
where Cinf (mg l1) is the average drug concentration in the JR ¼ (9)
Fvol
influent, Cefflu (mg l1) is the average concentration in the effluent
for each sampling day and D (d1) is the daily dilution rate to each
where Rb (g removed m3 d1) is the volumetric removal efficiency
operation stage. During the batch culture the removal volumetric
and Fvol (mE m3 d1) is the photon flux absorbed in the volume
efficiencies were cumulatively expressed as mg l1. Meanwhile, at
unit.
the steady state of the semicontinuous culture volumetric effi-
In this work, the Mann-Whitney non-parametric test, which
ciencies were expressed as mg l1 d1.
was performed by OriginPro8, was used to test the differences
The specific removal efficiency for each pharmaceutical was
between the treatments here conducted regarding the kinetic pa-
calculated as the ratio between the volumetric efficiency and the
rameters on microalgae growth and pharmaceuticals removal
biomass concentration (Cb, g l1) (Eq. (4)).
during the batch culture, regarding the specific efficiency on the
Volumetric efficiency removal of pharmaceuticals at the steady state of the semi-
Specific efficiency ¼ (4) continuous culture, and regarding the quantum yield and the
Cb
removal yield at the steady state of the semicontinuous culture. The
During the batch culture specific removal efficiencies were significance level was defined at p  0.05 and the p-values are
expressed cumulatively as mgremoved g1
biomass. Then, at the steady depicted as Supplementary Material (Tables s3, s4 and s5).

75
4 C. Escapa et al. / Journal of Environmental Management xxx (2016) 1e8

3. Results and discussion After the batch stage, when reactors started to be operated
under semicontinuous mode, a biomass decline occurred for all the
3.1. Biomass growth treatments (Fig. 1a and b). This decline, which is typically associated
to the outset of semicontinuous culture, is related to the instability
The microalgae growth curves are represented in Fig. 1. caused by the daily renewal rate applied. In the case of the PC and
As may be seen in Fig. 1, biomass showed the same typical batch SaC, the biomass decline was more accentuated than for positive
growth curve under all the treatments. Positive controls CþI and controls since the renewal rate also meant a daily addition of either
CþII, which were respectively run in parallel with the dose I and the paracetamol or salicylic acid. Then, after an adaptive lag, during
dose II treatments, showed very similar growth during batch cul- which cells became adapted to the new culture conditions, all
ture. Then, it is evident that the addition of pharmaceuticals treatments reached the steady state under semicontinuous opera-
stimulated microalgae growth during the batch culture as tion. The biomass decline at the beginning of the semicontinuous
compared with positive controls. This may be explained by the fact culture was more evident and the adaptive lag longer for CþII than
that the drugs were an additional source of organic carbon and it is for CþI. Differences between positive controls, which were not run
well known that the genus Chlorella can have a mixotrophic simultaneously, point to a higher instability during the second set
growth. However, while PCI and PCII reached similar maximum of experiments.
biomass concentration at the end of the batch culture (Fig. 1a), in
the case of salicylic acid, larger biomass concentration was attained 3.2. Pharmaceuticals removal
under SaCII than under SaCI (p  0.05) (Fig. 1b). This divergent
behaviour, which was evidenced by the utilization of two different The negative controls C- allowed verifying that neither salicylic
dosages in this work, points to a higher affinity for the consumption acid nor paracetamol showed any decrease of concentration
of salicylic acid by C. sorokiniana. Differences among the treatments throughout the duration of experiments. Therefore, it may be
were analysed according to growth kinetic parameters (Table 1). assumed that the concentration decrease of these pharmaceuticals
With regard to the parameter a, the addition of salicylic acid at the in PC and SaC reactors, may be associated to the removal by
initial pharmaceutical dose II (SaCII) involved the greatest increase C. sorokiniana microalgae.
of the lag phase respect the positive control (CþII) (p  0.05), as The removal curves of paracetamol and salicylic acid during the
shown in Table 1. This delayed response led to a longer exponential batch culture and the corresponding fittings to the logistic kinetic
growth phase for SaCII, which was reached in 12 days, while the model are shown in Fig. 2. These curves displayed a similar trend
rest of the treatments reached this stage within 7e9 days (Fig. 1b). than growth curves (Fig. 1), which points to the relation between
Therefore, it may be said that the growth response of the cells may the pharmaceuticals removal and the increase of biomass
be modified by the addition of pharmaceuticals, which was noto- concentration.
rious for SaCII. Regarding parameters of the logistic model (Table 2), similar
Regarding the carrying capacity (K), it was significantly larger values of the parameter a were determined for PCI and PCII
(p  0.05) under the presence of any of the drugs than for positive (p > 0.05). However, SaCII displayed a significantly higher a value
controls, either at initial dose I or II (Table 1). The K values deter- than SaCI (p  0.05), which denotes that the beginning of the
mined for the two doses of paracetamol (PCI, PCII), although removal of salicylic acid in SaCII had a delayed response as
significantly different, were mostly equivalent. On the other hand, compared with SaCI. This delayed response is related to the delay in
under salicylic acid, K values were significantly higher than under the beginning of the exponential growth in this treatment that was
paracetamol. Moreover, the K determined for SaCII was larger observed in Fig. 1b. Regarding the maximum removal capacity
(p  0.05) than for SaCI. According to properties in Table s2 (in (Table 2), a one order of magnitude higher K was determined under
supplementary material), a main issue may be the distribution of dosage II than I (p  0.05), both for paracetamol and salicylic acid.
the salicylic acid species depending on the pH. For salicylic acid, the Also, although there were no significant differences between PCI
unique species at pH ¼ 7.5 is the anionic form (100%) while neutral and SaCI (p > 0.05), SaCII displayed a significantly higher K than PCII
paracetamol is the most frequent species (99.4%) at this pH. (p  0.05). With regard to the removal rate r, PCI and PCII displayed
Therefore, it may be expected that the anionic salicylic acid is similar values (p > 0.05), as for SaCI and SaCII (p > 0.05) (Table 2). As
completely dissolved and easily available for microalgae. seen in Fig. 2, the maximum salicylic acid removal capacity was
Microalgae growth rate (r) under the initial paracetamol dose II reached within only 4 days of culture time under both initial
(PCII) was larger (p  0.05) than for the positive control (CþII) pharmaceutical doses, as compared to 7e8 days for paracetamol. In
(Table 1). However, under salicylic acid, both SaCI and SaCII showed fact, the r revealed significant differences, SaCI and SaCII displaying
a smaller (p  0.05) r than the respective positive controls. In values 4 and 5 times greater than PCI and PCII, respectively
addition, SaCII revealed a smaller r than SaCI. Therefore, the addi- (Table 2). At the end of the batch culture, efficiencies above 67% and
tion of salicylic acid led to a higher carrying capacity and a slower 48% were achieved for PCI and PCII, respectively. Meanwhile, sali-
growth rate than the paracetamol treatments and these results cylic acid removal efficiency was above 73% for SaCI and above 94%
were more pronounced under the highest dosage. for SaCII at the end of the batch culture.
Growth rates (r) here obtained for the positive controls and The specific efficiency during the batch culture is represented in
under the addition of paracetamol or salicylic acid (Table 1) were Fig. s1 (as supplementary material). In the case of paracetamol,
quite higher than those reported by Kumar et al. (2014) for the either for PCI or for PCII, there was a constant ratio between the
same strain (0.1 day1) cultivated in TAP medium in Erlenmeyer removal of paracetamol and the biomass concentration throughout
flasks under 100 mE m2 s1 irradiation. Domínguez Cabanelas et al. time. Differently, for salicylic acid, both for SaCI and SaCII, showed
(2013), described growth rates for Chlorella vulgaris below 0.38 an exponential increase until the 4th day.
day1 and a maximum biomass of 1.52 g l1 cultivated with The average specific efficiencies on the removal of pharmaceu-
different domestic wastewaters in 2 l borosilicate reactors under ticals at the steady state of the semicontinuous culture are reported
150 mE m2 s1 irradiation. Nevertheless, Arbib et al. (2013), re- in Fig. s2 (as supplementary material). However different biomass
ported growth rates for Scenedemus obliquus close to 1 day1 growth occurred during the semicontinuous culture of the two sets
cultivated in pre-treated urban wastewater in 2 l Pyrex bottles of experiments, specific efficiencies, which are expressed by mass
under 250 mE m2 s1 irradiation. unit of biomass, allow for the comparison of the removal of

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Fig. 1. Growth curves of Chlorella sorokiniana for paracetamol (CþI , PCI :, CþII -, PCII A) (a) and salicylic acid (CþI , SaCI :, CþII -, SaCII A) (b) under the initial
pharmaceutical doses I (25 mg l1) and II (250 mg l1). Dots correspond to experimental data and continuous lines correspond to fittings by the logistic kinetic model during batch
culture. Experimental points obtained during semicontinuous culture are connected with dashed lines. Notes: Curves corresponding to CþI and CþII are represented both in (a) and
(b) for comparison purpose. Experiments were performed in triplicate and bars show standard derivations.

Table 1
Logistic model kinetic parameters (K, a, r) of Chlorella sorokiniana growth and experimental data of their growth (Cbm, Ncm) for the positive control (Cþ), paracetamol (PC) and
salicylic acid treatments (SaC), for the initials concentrations I and II. Note: n ¼ 3.

Cþ PC SaC

I II I II I II

Cbm (g l1) 1.41 ± 0.29 1.41 ± 0.27 2.05 ± 0.03 1.79 ± 0.14 2.05 ± 0.15 2.75 ± 0.08
Ncm (cell ml1) 2.12  108 ± 4.88  107 2.03  108 ± 4.41  107 4.20  108 ± 2.17  107 1.63  108 ± 6.01  107 3.15  108 ± 8.48  106 3.84  108 ± 5.30  106
a 3.77 ± 0.01 2.96 ± 0.11 4.33 ± 0.21 3.11 ± 0.21 4.16 ± 0.48 4.13 ± 0.27
K (g l1) 1.40 ± 0.29 1.65 ± 0.25 2.09 ± 0.02 1.90 ± 0.10 2.14 ± 0.13 3.02 ± 0.03
r (d1) 0.94 ± 0.06 0.71 ± 0.05 0.96 ± 0.07 0.95 ± 0.13 0.77 ± 0.12 0.54 ± 0.02
R2 0.9935 0.9841 0.9939 0.9812 0.9912 0.9928

Abbreviations: Cbm ¼ maximum biomass; Ncm ¼ maximum number of cells; K ¼ carrying capacity; a ¼ constant of logistic kinetic model; r ¼ microalgae growth rate;
R2 ¼ correlation coefficient.

pharmaceuticals at this stage. In this sense, it may be stated that the about other microorganisms is scarce. Bacterial biodegradation of
salicylic acid removal by unit of biomass was similar (p > 0.05) to paracetamol at different concentrations has been studied by several
the paracetamol removal under dose II (99.62 ± 16.84 mgremoved authors (Zhang et al., 2013; Wu et al., 2012; De Gusseme et al.,
g1
biomass d
1
for SaCII, 101.16 ± 9.01 mgremoved g1 biomass d
1
PCII). 2011), achieving high or complete degradation even at initial con-
Nevertheless the average specific efficiency for the removal of centrations as high as 2,500 mg l1 (70 h) by a species of genus
salicylic acid at dosage I was higher (p  0.05) than for paracetamol Pseudomonas (Zhang et al., 2013). On the other hand, Combarros et
(8.34 ± 0.38 mgremoved g1 biomass d
1
for SaCI, 2.68 ± 0.11 mgremoved al. (2014) claimed that the biodegradation of salicylic acid by
g1
biomass d1
PCI). Moreover, the efficiencies per gram of biomass Pseudomonas putida achieved an efficiency of 100% (8 h) and 94.7%
achieved for dose II were much larger (p  0.05) than for dose I. (24 h) for initial concentrations of 100 and 500 mg l1, respectively.
No information is available on the compared removal of Therefore, although in a different concentration range, these au-
different concentrations of pharmaceuticals by microalgae and data thors (Combarros et al., 2014) verified a decrease of efficiency with

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6 C. Escapa et al. / Journal of Environmental Management xxx (2016) 1e8

Fig. 2. Chlorella sorokiniana volumetric efficiency in the removal of paracetamol (PCI , PCII -) (a) and salicylic acid (SaCI , SaCII -) (b) during batch culture under the initial
pharmaceutical doses I (25 mg l1) and II (250 mg l1). Dots correspond to experimental data and continuous lines correspond to fittings by the logistic kinetic model. Note:
Experiments were performed in triplicate and bars show standard derivations.

Table 2 centrate by the microalgae Selenastrum capricornutum and Chla-


Logistic model kinetic parameters (K, a, r) of Chlorella sorokiniana for the removal of mydomonas reinhardtii. After seven days of culture, these authors
paracetamol (PC) and salicylic acid (SaC) in the batch culture, for the initials con-
centrations I and II. Note: n ¼ 3.
(Hom-Díaz et al., 2015) determined removals above 88% for E2 and
above 60% for EE2.
PC SaC

I II I II
3.3. Light conversion efficiency
a 4.49 ± 0.24 3.98 ± 1.27 10.20 ± 3.16 14.90 ± 0.05
K (mg l1) 17.62 ± 0.91 146.46 ± 41.01 17.68 ± 0.96 234.38 ± 0.69
r (d1) 1.01 ± 0.06 0.90 ± 0.45 4.07 ± 1.21 4.57 ± 0.07 It was hypothesized that the presence of either salicylic acid or
R2 0.9941 0.9657 0.9919 0.9990 paracetamol in the culture medium could modify the light con-
Abbreviations: K ¼ carrying capacity; a ¼ constant of logistic kinetic model;
version efficiency of the cells since the biomass productivity of the
r ¼ pharmaceutical removal rate; R2 ¼ correlation coefficient. microalgae was affected by the addition of these pharmaceuticals.
In order to verify this hypothesis, the development of the light
availability inside the culture and the quantum yield were deter-
the increase of initial concentration, which is contrary to our mined for both initials pharmaceuticals doses. For an extinction
findings. In any case, removal rates by Pseudomonas putida deter- coefficient value of 0.3161 m2 g1, the average irradiance inside the
mined by these authors (Combarros et al., 2014) were larger than PBR (Iav) showed a gradual decrease corresponding to the increase
removal rates determined in this work. Still, the use of microalgae of the biomass concentration, which reduced the irradiance avail-
in wastewater treatment has been proved to have numerous ad- able inside the culture, as may be seen in Fig. 3. The results dis-
vantages. Among them, the recovery of algal biomass offers the played a sharp decline during the first days due to the exponential
possibility of recycling the assimilated nitrogen and phosphorus as biomass growth phase. Then, at the beginning of the semi-
a fertilizer, as a source of products (e.g. paraffin, olefin, glycerol, continuous culture, there was a slight increase of the light available
protein, anti-oxidant, pigment, plastic, etc.), or as biofuel, and also due to the decrease in the biomass concentration caused by the
the generation of oxygenated high-quality effluent into the water destabilization of the culture. Finally, at the steady state of the
body (Matamoros et al., 2016). semicontinuous culture Iav showed a trend to stabilize throughout
Published results on the removal of emerging contaminants by time. Therefore, the average irradiance at which cells were exposed
microalgae have revealed different efficiencies depending on the (Fig. 3) showed an inversely proportional behaviour to the trend of
pollutant and on the microalgae strain. For example, Gattullo et al. biomass growth (Fig. 1). These results are in agreement with those
(2012) demonstrated that Monoraphidium braunii was able to obtained by Go mez et al. (2013) for a Muriellopsis sp. culture, with
remove up to 48% of bisphenol A with an initial concentration of an Iav value of 43 mE m2 s1 under semicontinuous operation with
4 mg l1. de Wilt et al. (2016) reported that C. sorokiniana grown in an Io value of 1850 mE m2 s1, which means an irradiance reduction
wastewater streams was able to achieve removal efficiencies up to of about 97%.
60e100% for the removal of diclofenac, ibuprofen, paracetamol and The quantum yields (JE) at the steady state of the semi-
metoprolol. However, these authors (de Wilt et al., 2016) verified continuous culture, which are displayed in Fig. 4, are larger than
that, under identical conditions, the removal of carbamazepine and those determined by Go mez et al. (2013) for a Muriellopsis sp.
trimethoprim was incomplete and did not exceed 30 and 60%, culture. In the present work, the JE determined for SaC was higher
respectively. Wang et al. (2016) studied the removal of phenol by than the values obtained for PC and the respective positive controls,
Chorella sp. culture, obtaining removal efficiencies up to 100% from either at dosage I or at dosage II. This evidences that the salicylic
an initial concentration of 500 mg l1 in seven days. Peng et al. acid treatment produced higher biomass by unit of radiation than
(2014) reported removals above 95% of progesterone by the control and the paracetamol treatment. Indeed, significantly
S. obliquus and Chlorella pyrenoidosa, nearly complete removal of larger (p  0.05) removal yields (JR) were determined under sal-
norgestrel by S. obliquus and almost 40% of norgestrel by icylic acid than under paracetamol either at dosage I (0.22 ± 0.01
C. pyrenoidosa. Likewise, Hom-Díaz et al. (2015) studied the elimi- gremoved E1 for SaCI >0.12 ± 0.01 gremoved E1 for PCI) or at dosage II
nation of the hormones E2 and EE2 from anaerobic digestate (2.45 ± 0.01 gremoved E1 for SaCII >1.72 ± 0.03 gremoved E1 for PCII).

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Fig. 3. Average irradiance inside the culture of Chlorella sorokiniana for paracetamol (CþI , CþII -, PCI :, PCII A) (a) and salicylic acid (CþI , CþII -, SaCI :, SaCII A) (b) under
the initial pharmaceutical doses I (25 mg l1) and II (250 mg l1). Notes: Curves corresponding to CþI and CþII are represented both in (a) and (b) for comparison purpose. Ex-
periments were performed in triplicate and bars show standard derivations.

4. Conclusions than under paracetamol. The obtained results point to the prom-
issory application of C. sorokiniana as bioremediation system for the
An increased biomass productivity of C. sorokiniana occurred removal of paracetamol and salicylic from concentrated
under the presence of paracetamol or salicylic acid as compared wastewaters.
with the respective positive controls. Therefore, it may be
concluded that C. sorokininana was not only resistant to these Acknowledgments
pharmaceuticals at the considered dosages but also able to use
them as an additional source of organic carbon. During the batch Carla Escapa acknowledges the Spanish Ministry of Educations,
culture, larger maximum biomass concentration and carrying ca- Culture and Sports for her PhD fellowship (FPU12/03073). Sergio
pacity were attained under 250 mg l1 (dosage II) than 25 mg l1 Paniagua thanks the Spanish Ministry of Educations, Culture and
(dosage I) in the case of salicylic acid. Regarding pharmaceuticals Sports for his PhD fellowship (FPU14/05846). Also, Marta Otero
removal, in the batch culture, the maximum removal capacity was acknowledges support from the Spanish Ministry of Economy and
one order of magnitude higher under dosage II than I, both for Competitiveness, State Secretariat for Research, Development and
paracetamol and salicylic acid. Also, at the steady state of the Innovation (RYC-2010-05634).
semicontinuous culture, specific removal efficiencies were larger
under dosage II than under dosage I for both pharmaceuticals. In
Appendix A. Supplementary data
any case, higher removal yields were reached under salicylic acid
Supplementary data related to this article can be found at http://
dx.doi.org/10.1016/j.jenvman.2016.06.051.

References

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Arbib, Z., Ruíz, J., Alvarez-Díaz, rez, C., Barragan, J., Perales, J.A., 2013.