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AMINOACIDOS
AMINOACIDOS
La lista se pudiera extender casi indefinidamente, sin embargo las funciones mencionadas
anteriormente, demuestran la importancia central de las proteínas en el estudio de la
bioquímica.
Las proteínas son polímeros de elevado peso molecular constituídas por monómeros de
bajo peso molecular (~110 Daltons) denominados aminoácidos. Los aminoácidos se
derivan de las proteínas animales, vegetales y microbianas y son ácidos orgánicos que
contienen ya sea un grupo amino o un imino, un grupo carboxílico, un átomo de
hidrógeno y un grupo distintivo (o cadena lateral) R enlazados a un átomo de carbono
central alfa. Al carbono central se lo denomina alfa por encontrarse ligado adyacente al
grupo (ácido) carboxílico.
Los aminoácidos son compuestos incoloros cristalinos, que a primera vista, la apariencia
de un polvo blanco. Las formas cristalinas son muy características, variando desde haces
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de delgadas agujas (tirosina) a gruesas placas hexagonales (cistina). El sabor varía desde
el dulce azucarado (glicina, alanina), pasando por el insípido (tirosina) hasta el amargo
(arginina).
RXN ?????????????????????????????
Los aminoácidos se unen por enlaces peptídicos para formar cadenas polipeptídicas
Los -aminoácidos tienen al menos dos grupos ácidos en potencia, el grupo carboxilo sin
disociar y el grupo amino protonado.
H H
I I
Cl◊NH3-C-COOH⁄ Cl- + +H3N-C-COOH
I I
R R
H H
I I
+H N-C-COOH ⁄ +H - H+
3 3N-C-COO +
I I
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R R
por lo tanto,
K1=
H H
I I
+H N-C-COO- ⁄ H2N-C-COO- + H+
3
I I
R R
por lo tanto,
K2=
pI=
pI=
PROBLEMA:
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SOLUCION:
H
I
+H N-C-COO-
3
I
CH2
I
COO-
Aspartato
pI=
4. por lo tanto,
pI= = 2.77
PROBLEMA:
SOLUCION:
H
I
+H N-C-COO-
3
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I
(CH2)4
I
NH3+
pI=
3. por lo tanto,
pI= = 9.74
Nomenclatura
Ejemplo:
H2N-Ala-Tyr-Gly-Glu-COOH
por lo tanto la fracción de carga positiva. Para un ácido como el grupo carboxilo, la meta
es calcular la fracción de especies no protonadas y por lo tanto la fracción de carga
negativa. La carga molecular neta se obtiene sumando la contribuición de carga de los
varios grupos. Así, siguiendo el procedimiento estándar para determinar la fracción de
carga negativa (Q-), para los grupos funcionales -COOH, -SH, -PhOH, la ecuación es:
Q-=
La expresión general para la fracción de carga positiva (Q +), para los grupos funcionales
-NH3+, =NH2+, NH+, es:
Q+=
EJEMPLO:
SOLUCION:
Los pKa de cada uno de los grupos en cuestión se pueden obtener de tablas.
Así, para el grupo terminal amino (+H 3N-) el pKa es de 8.5; para el grupo terminal
carboxilo (-COO-) el pKa es de 3.2; para cada uno de los cuatro aspartatos-COO-,
el pKa es de 3.9 y para cada una de las dos lisinas-NH3+, el pKa es de 10.5. Se debe
recordar que a excepción de los grupos -terminales, el resto de los valores pKa se
refieren a las cadenas laterales de cada residuo aminoácido. Por lo tanto,
sustituyendo los valores en las fórmulas anteriormente mencionadas se obtiene:
Qpéptido = + + + = -2.0
ejemplo, el grupo -amino terminal de muchas proteínas es acetilado, lo que hace que
estas proteínas sean más resistentes a una degradación. En el colágeno recién sintetizado,
muchos residuos de prolina son hidroxilados para formar hidroxiprolina. Los grupos
hidroxilos añadidos estabilizan la fibra de colágeno.
Por ser los enlaces entre el átomo de carbono y el átomo de nitrógeno; y el átomo de
carbono y el átomo de carbono carbonilo enlaces sencillos, no existe resonancia y
como consecuencia existe un enorme grado de libertad rotacional de los enlaces ubicados
a cada lado de la unidad peptídica rígida. Las rotaciones alrededor de estos enlaces se
designan por los ángulos y . La conformación de la cadena principal del polipéptido
está definida completamente cuando se conocen y para cada uno de los residuos de
aminoácidos.
Estructura proteica
De ésta manera, todos los grupos NH y CO de la cadena principal quedan enlazados por
puentes de hidrógeno. Cada residuo queda relacionado con el siguiente por una
translación de 1.5 Å a lo largo del eje de la hélice y una rotación de 100° con un
diámetro de rosca de 5.4 Å , lo que da 3.6 residuos de aminoácidos por vuelta de la hélice
(5.4 Å/1.5Å = 3.6). Así, aminoácidos espaciados tres o cuatro lugares en la secuencia
lineal, quedan espacialmente situados muy próximos en la hélice . Como contraste,
aquellos aminoácidos separados dos lugares en la secuencia lineal, quedan ubicados a
lados opuestos en la hélice y de ésta manera es poco probable que hagan contacto.
Aunque el sentido de la hélice pueda ser dextro o levorrotatorio, las hélice que se
encuentran en las proteínas son dextrorrotatorias.
Las cadenas adyacentes en una hoja plegada pueden orientarse en la misma dirección
denominándose así, hoja plegada paralela. Si las cadenas se encuentran orientadas en
direcciones opuestas, se denomina hoja plegada antiparalela.
diagrama ???????????????????
6. DOMINIOS- son unidades globulares compactas con un rango entre 100 y 400
aminoácidos. Por ejemplo, la cadena liviana de un anticuerpo (25 kd) se dobla en dos
dominios. Estos dominios resemblan el uno al otro, lo que sugiere que provienen del
mismo gen.
Los dominios proteicos son, por lo general, codificados por distintas partes de un gen
denominados exones.
Las proteínas pueden ser separadas entre sí y de otros tipos de moléculas, sobre la base de
características tales como el tamaño, la solubilidad, la carga y la afinidad específica de
enlace.
Diálisis- Las proteínas pueden ser separadas de las moléculas pequeñas, por medio de
diálisis a través de una membrana semipermeable. La membrana actúa como un tamiz
molecular y móleculas cuyas masas son mayores a los 15 kilodaltons, son retenidas
dentro de la membrana de diálisis típica, por el contrario, iones y moléculas inferiores en
tamaño, atraviesan los poros de la membrana hacia el exterior de esta.
Cromatografía de filtración por gel- Es otro ejemplo de tamiz molecular que separa
moléculas de acuerdo a su forma y tamaño. La resina es un polímero de glucosa
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Cromatografía de intercambio iónico- Las proteínas nativas, poseen cargas netas que
hacen posible su separación, de acuerdo a esta técnica. Si una proteína, tiene una carga
positiva neta a pH 7, normalmente esta se unirá a una resina de intercambio iónico que
contenga grupos negativos (COO-), mientras que una proteína cargada negativamente no
lo hará. Así, una proteína con carga neta positiva, puede ser desligada de la resina en la
columna añadiendo NaCl, en forma de gradiente, u otra sal, al tampón de elución. El
principio se basa en que los iones sodio compiten con los grupos cargados positivos, en la
proteína, para ligarse al la resina. Obviamente, las proteínas que tengan una baja
densidad de carga neta positiva, tenderán a eluir primero seguidas de aquellas que tienen
una densidad de carga mayor.
Electroforesis- Es una técnica utilizada para separar proteínas tanto en base a su carga
neta como también por peso molecular. La electroforesis se define como la migración
de partículas cargadas en un campo eléctrico. Cualquier ión o grupo cargado migrará
cuando sometido a un campo eléctrico. Las proteínas llevan una carga neta a cualquier
pH que sea diferente al de su punto isoeléctrico, por lo tanto estas migrarán y su tasa de
migración dependerá de la densidad de carga (la razón de carga a masa). Mientras más
alta sea la razón de carga a masa, más rápida será la migración de la molécula. La
aplicación de un campo eléctrico a una mezcla de proteínas en solución, resultará en
diferentes migraciones para diferentes proteínas hacia uno de los electrodos. La
velocidad de migración () de una proteína (o cualquier otra molécula como DNA o
RNA) en un campo eléctrico depende de la fuerza del campo eleectrico (E ), la carga neta
de la proteína (z ), y el coeficiente de fricción (f ).
=
los poros del gel, migrarán fácilmente a lo largo del soporte, mientras que aquellas
moléculas con tamaños más grandes que los poros del gel, estarán casi inmóviles.
Móleculas con tamaños intermedios migrarán a través del soporte con diferentes grados
de facilidad.
muestra se somete a enfoque isoeléctrico; este gel es luego colocado en forma horizontal
sobre la parte superior de la matriz de poliacrilamida con SDS y corrido verticalmente
para generar un patrón de puntos bidimensional. Con una técnica de este tipo, las
proteínas se separan en la dirección horizontal en base a punto isoeléctrico y en la
dirección vertical en base a la masa. Con esta técnica se han podido separar más de mil
proteínas diferentes provenientes de E. coli, en un solo experimento.
Centrifugación- Esta técnica es muy utilizada para separar y analizar células, organelos
y macromoléculas biológicas. Una partícula en movimiento circular con radio r a una
velocidad angular está sujeta a un campo centrífugo equivalente a 2r. La fuerza
centrífuga Fc para esta partícula es igual al producto de su masa efectiva m' y de su
campo centrífugo.
-
Fc = m' 2r = m( 1-) 2r
La masa efectiva m' es menor que la masa m debido a que el líquido desplazado ejerce
una fuerza opuesta. Este factor boyante es igual a (1- ), en donde es el volumen
parcial específico de la partícula y es la densidad de la solución. Una partícula se
mueve en este campo a una velocidad constante v cuando Fc es igual al arrastre viscoso
f, en donde f es el coeficiente de fricción de la partícula. Por lo tanto, la velocidad de
migración (velocidad de sedimentación) de la partícula es
= =
s==
2. Una partícula densa se mueve más rápido que una partícula menos densa debido a
que la fuerza boyante opuesta es menor para una partícula de mayor densidad.
La masa (peso molecular) de una proteína, puede ser directamente determinada por el
equilibrio de sedimentación, en el cula una muestra es centrifugada a relativamente una
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en donde c1 y c2 son las concentraciones a las distancias (desde el eje de rotación) r1 y r2,
k es la constante de Boltzmann, y T es la temperatura absoluta. Esta técnica de
equilibrio de sedimentación para determinar masa, es rigurosa y puede ser aplicada
bajo condicones no desnaturalizantes, en la cual la estrucutura nativa de las
proteínas multiméricas es preservada. Al contrario, electroforesis en geles de
poliacrilamida con SDS proveen un estimado de la masa de las cadenas polipeptídidcas,
bajo condiciones desnaturalizantes.
Ala-Gly-Asp-Phe-Arg-Gly
El residuo amino terminal de una proteína o péptido, puede ser identificado al marcarlo
con un compuesto que forme un enlace covalente estable, con éste grupo. El
fluorodinitrobenceno (FDNB), fue el primer compuesto utilizado para éste propósito,
por Frederick Sanger. El FDBN reacciona con el grupo -amino, no cargado (NH2), para
formar un derivado dinitrofenílico (DNP) del péptido, de color amarillo. El enlace entre
el dinitrofenilo y el grupo amino terminal se establece en condiciones en las que se
hidrolizan los enlaces peptídicos. La hidrólisis del DNP-péptido en 6N HCl da lugar a un
DNP-aminoácido, que en el caso del péptido puesto como ejemplo se identifica como
DNP-alanina, por sus propiedades cromatográficas.
Aunque el método del dabsilo, para determinar el grupo amino terminal, es sensible, éste
no puede ser utilizado repetitivamente sobre el mismo péptido porque éste se degrada por
completo en la etapa de hidrólisis ácida. Pehr Edman desarrolló un método para marcar
el residuo amino terminal y romper el primer enlace petídico sin destruir el resto de
enlaces, entre los residuos de aminoácidos del péptido. La degradación de Edman
remueve, en forma secuencial, un residuo aminoácido a la vez, empezando desde el grupo
amino terminal del péptido. En éste procedimiento, el fenilisotiocianato reacciona con el
grupo amino terminal no cargado del péptido para formar un derivado
fenilisotiocarbamato; luego, bajo condiciones ácidas leves, se libera un derivado cíclico
del aminoácido terminal, dejando así el péptido intacto, pero acortado en un residuo. El
compuesto cíclico es una feniltiohidantoína (PTH) del aminoácido. El derivado PTH-
aminoácido puede ser fácilmente identificado por medio de procedimientos
cromatográficos tal como la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Además,
la composición de aminoácidos del péptido acortado:
lo cual indica que el segundo residuo desde el extremo amínico es la glicina. Un PTH-
aminoácido individual puede ser identificado cromatográficamente, por HPLC,
comparándolo con los perfiles de volumenes de elución de estándares conocidos.
Las proteínas pueden ser escindidas en un sitio específico para formar péptidos de
menor tamaño y facilitar su análisis.
Cortes específicos se pueden obtener con métodos químicos o enzimáticos. Por ejemplo,
Bernhard Witkop y Erhard Gross descubrieron que el bromuro de cianógeno (CNBr)
rompe cadenas polipeptídicas únicamente sobre el lado carboxílico de los residuos de
metionina. Por lo tanto, con éste método, una proteína que contenga diez residuos de
metionina proporcionará once péptidos. Cortes altamente específicos se pueden obtener
también con la tripsina, un enzima proteolítico del jugo intestinal. La tripsina corta a las
cadenas polipeptídicas por el lado carboxílico de los residuos de arginina y lisina, por lo
tanto, una proteína que contenga diez residuos de lisina y siete de arginina, suministrará
dieciocho péptidos mediante la digestión con tripsina. Cada uno de los péptidos trípticos
formados, terminarán ya sea con arginina o con lisina.
Ala-Ala-Trp-Gly-Lys Val-Lys-Ala-Ala-Trp
Thr-Asn-Val-Lys
péptido quimotríptico
superpuesto
Esta metodología se aplica a las proteínas que constan de una sola cadena polipeptídica
sin ningúb enlace disulfuro. Procedimientos adicionales son necesarios para proteínas
con más de una cadena polipeptídica o que contenga enlaces disulfuro. Para proteínas
que contengan dos o más cadenas polipeptídicas unidas por enlaces no covalentes, se
utilizan agentes desnaturalizantes tales como urea y el clorhidrato de guanidina para
disociar las cadenas. Las cadenas disociadas deben ser separadas antes de determinar su
secuencia. Para las cadenas polipeptídicas unidas covalentemente por puentes disulfuro,
primeramente se procede a la reducción, con -mercaptoetanol o ditiotreitol, de los
enlaces disulfuro. Para prevenir la re asociación de los residuos de cisteína, estos son
alquilados con iodoacetato para formar S- carboximetil derivados estables.
GGG.TTC.TTG.GGA.GCA.GCA.AGG.AAG.CAC.TAT.GGG.GCA. DNA
Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly Ala AMINOACIDOS
modificaciones posttraduccionales, como las mencionadas. Es por este motivo, que los
análisis químicos son necesarios para delinear la naturaleza de estos cambios, los cuales
son críticos para la actividad biológica de la mayoría de proteínas. Así, la secuenciación
del DNA y los análisis químicos de las proteínas son procesos complementarios para
elucidar las bases fundamentales de la función proteíca. La tecnología del DNA
recombinante a contribuido enormemente a proporcionar información más rápida y
exacta de las secuencias de los aminoácidos, especialmente para proteínas con un gran
número de residuos. Hoy en día se conoce la secuencia de aproximadamente 3000
proteínas con un número de residuos de más de106.
4. Datos de secuenciación proveen las bases para preparar anticuerpos contra una
proteína específica. Anticuerpos específicos pueden ser muy útiles en la determinación
de la cantidad de proteína y su distribuición en la célula.
5. Las secuencias de aminoácidos hacen posible elaborar sondas de DNA que son
específicas para genes que codifican las proteínas correspondientes.
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Los anticuerpos que reconocen una proteína en particular, pueden ser obtenidos
inyectando la proteína a un conejo. Las inyecciones deben ser dos, a tres semanas de
separación la una de la otra. Varias semanas después se obtiene la sangre del conejo
inmunizado y se la somete a centrifugación. El suero resultante se denomina antisuero,
que usualmente contiene el anticuerpo deseado. El antisuero o su fracción de
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Proteínas con alarmantes similitudes entre ellas, pueden ser distinguidas por la gran
especificidad de los anticuerpos. Tanto así, que hasta la más mínima diferencia en la
superficie (un sólo residuo) puede ser detectada. Los anticuerpos pueden ser utilizados
como reactivos analíticos específicos, para cuantificar la cantidad de una proteína u otro
antígeno. En un inmunoensayo de fase sólida, un anticuerpo específico para una
proteína de interés, es ligado a un soporte polimérico, como puede ser una hoja de
polivinilcloruro (PVC). A ésta, se le añade una gota de extracto celular, o se esparce una
muestra de sangre u orina, para lograr la formación del complejo anígeno-anticuerpo, y
luego se la somete a un primer lavado. A continuación se añade un anticuerpo específico,
el cual reconoce un segundo sitio en el antígeno, y se vuelve a lavar la hoja de PVC para
eliminar el exceso de anticuerpo. El segundo anticuerpo añadido, lleva una marca
radioactiva o fluorescente que puede ser detectada con facilidad debido a su sensibilidad.
La cantidad del segundo anticuerpo ligado a la hoja de PVC es proporcional a la cantidad
de antígeno presente en la muestra. La sensibilidad por este método, puede ser
incrementada aún más si el segundo anticuerpo está ligado a un enzima como la fosfatasa
alcalina, ya que ésta convierte, de manera rápida, una sustancia incolora en un producto
coloreado, o un substrato no fluorescente en un producto intensamente fluorescente.
Menos de un nanogramo (10-9 g) de proteína puede ser medido por este ensayo
inmunosorbente ligado a un enzima (ELISA), el cual es rápido y conveniente. Por
ejemplo, con éste método, el embarazo puede ser detectado a los pocos días después de la
concepción , utilizando la orina de la paciente como muestra biológica, para la detección
de la hormona gonadotropina coriónica humana (HCG), una proteína de 37 kd,
producida por la placenta.
Muy pequeñas cantidades de una proteína de interés, en una célula o líquido biológico,
pueden ser detectadas por una técnica de inmunoensayo, denominada Western blotting.
Una muestra es sometida a electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS. Las
proteínas resueltas en el gel, se transfieren a una hoja de nitrocelulosa (blotting)
proporcionando mayor facilidad a la proteína de interés, para reaccionar con el anticuerpo
específico añadido. El complejo antígeno-anticuerpo formado en la nitrocelulosa, puede
ser detectado, enjuagando la hoja de nitrocelulosa con un segundo anticuerpo específico
para el reconocimiento del primero. Marcando radioactivamente el segundo anticuerpo,
se produce una banda obscura en una película de rayos X. Alternativamente, para
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detectar la proteína de interés, se puede utilizar un enzima que utilice como sustrato, el
segundo anticuerpo, y que genere un producto coloreado.
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