Manual de Control de Calidad Micológico

GESTIÓN DE LABORATORIOS Código:
MANUAL DE CONTROL DE CALIDAD MICOLÓGICO Versión 0.0

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MANUAL DE CONTROL DE
CALIDAD MICOLÓGICO
POR:
LUZ DARY CAICEDO BEJARANO
MARIA INES ALVAREZ VALLE
Elaboró Luz Dary Caicedo Bejarano

Cargo Docente
Revisó María Inés Álvarez Valle
Fecha 08.02.2108

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TEORÍA
MICOLOGÍA DE ALIMENTOS
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1. MICOLOGÍA DE ALIMENTOS
Traducción del libro: Pitt, J. I., and A. D. Hocking. "Fungi and food spoilage."
1.1 ECOLOGÍA DE LOS HONGOS EN LOS ALIMENTOS:
Los alimentos no son tratados como un ecosistema, quizás con el argumento de que este
no es un sistema “natural”. Sin embargo, este es un ecosistema y uno muy importante.
La población mundial ha ido creciendo y el hombre almacena suficiente comida para
varios años, lo que permite que algunos organismos evolucionan de manera rápida en
estos sustratos, por ejemplo los hongos, organismos asexuales haploides, los cuales
pueden llegar a ocupar diferentes nichos ecológicos.
Los alimentos por su propia naturaleza se espera que sean nutritivos, por lo son un
hábitat rico para los microorganismos, en contraste con los grandes sistemas naturales,
suelo, agua y plantas. Dadas las correctas condiciones Fisico-quimicas, solamente los
microorganismos fastidiosos son incapaces de crecer en estos sustratos, por lo que
factores diferentes a los nutrientes suelen ser seleccionados para determinados tipos de
poblaciones microbianas. Tal vez lo más importante de estos factores es que están
relacionados con los estados biológicos de los alimentos. Alimentos vivos, particularmente
las frutas frescas, vegetales e incluso granos y nueces después de la cosecha, poseen
mecanismos de defensa poderosos contra la invasión microbiana. El factor primordial para
determinar el deterioro de la frescura de un alimento vivo es la habilidad de algunos
microorganismos de superar los mecanismos de defensa.
Los factores que pueden influir en el deterioro de los alimentos por parte de los hongos
son:
1) Actividad del agua.

2) Concentración de iones de hidrogeno

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3) Temperatura de procesamiento y almacenaje

4) Tensión del gas, específicamente del oxígeno y dióxido de carbono
5) Consistencia
6) Estado nutricional
7) Efectos de solutos específicos
8) Preservativos
1.1.1 Actividad del Agua.
La actividad del agua es un concepto físico-químico que fue introducido a la microbiología

por Scott (1957), el cual mostraba la relación entre el agua disponible de los alimentos y
la habilidad de los microorganismos para crecer en éstos.
La actividad del agua está definida como:
Aw = p/p0
Donde p es la presión parcial del vapor de agua en el material de muestra y p0 es la
saturación del vapor generado por la presión de agua pura bajo las mismas condiciones.
La actividad de agua, es numéricamente similar a la humedad relativa del equilibrio (ERH)

expresada como un decimal. Si una muestra de comida es guardada a temperatura
constante en un recinto cerrado hasta que el agua en la muestra se equilibre con el vapor
de agua en el espacio aéreo del recinto. Entonces,
Aw(comida) = ERH (aire)/100.
A la inversa, si el ERH del aire es controlada en un medio con una solución saturada de sal,
el equilibrio de aw de los alimentos puede numéricamente ser igual al generado en el ERH.

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De este modo, aw puede experimentalmente controlarse, y la relación de a w a la humedad

(el isotermo de la absorción) podría ser estudiado.
En muchas situaciones prácticas, aw es el factor ambiental dominante que rige en la

estabilidad de los alimentos o en su deterioro. Un conocimiento de las relaciones hídricas
de los hongos permitiría predecir en ambos casos, la vida útil de los alimentos y el
potencial deterioro de los hongos.
Como todos los organismos, los hongos son profundamente afectados por la
disponibilidad del agua. En la escala de a w, la vida que conocemos existe sobre el rango
0.9999+ hacia 0.6 (ver Tabla 1). El crecimiento de los animales está confinado a 1.0-0.99
aw; el punto de marchitamiento de las plantas mesofiticas es cercano a 0.98 a w; y la
mayoría de microorganismos no pueden crecer por debajo de 0.95 aw. Unas pocas algas
halofilicas y bacterias podrían crecer en cloruro de sodio saturado (0.75 a w), pero son
confinados a ambientes salados. Los Hongos ascomicetos comprenden la mayoría de los
organismos capaces de crecer por debajo de 0.9 aw.
Los hongos tienen la capacidad de crecer en bajos a w, en presencia de altas

concentraciones de soluto, son clasificados como uno de los organismos más altamente
evolucionado en el planeta. Incluso entre los hongos este camino evolutivo debe haber
sido de los que presenta mayor complejidad; la capacidad de crecimiento con baja a w se
limita a sólo un puñado de géneros. (Pitt, 1975).
El grado de tolerancia a bajos a w es el mínimo valor de aw al cual germina el hongo y el

crecimiento puede ocurrir. Los hongos que son capaces de crecer con poco a w son
llamado xerófilos: una definición ampliamente utilizada es que un hongo xerófilo es capaz
de crecer por debajo de 0.85 aw. (Pitt, 1975).

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Tabla 1. Actividad de agua de algunos alimentos.
AW ALIMENTOS MOHO LEVADURAS

1.00 Vegetales
Carne, Leche
Fruta
0.95 Pan Basidiomicetos, la mayoría Basidiomicetos

de hongos del suelo
0.90 Jamón Mucorales, Fusarium La mayoría de

ascomicetos
0.85 Salame seco Rhizopus, Cladosporium Zygosaccharomyces rouxii
(sal)
0.80 Aspergillus flavus Zygosaccharomyces bailii
Penicillium, Aspergillus
xerófilos
0.75 Mermeladas Aspergillus xerófilos Debaryomyces hansenii
Pez de agua Wallemia , Eurotium
salada
Pastel de frutas
Confitería
0.70 Frutos secos Chrysosporium
Granos
0.65 Xeromyces bisporus Zygosaccharomyces rouxii
(dulce)
0.60 DESORDENES DEL ADN
1.1.2 Concentración de los Iones de Hidrógeno.

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En actividades con Aw alto, los hongos compiten con las bacterias como deterioradores de
alimentos. Aquí el pH juega un rol decisivo. Las bacterias prosperan cerca del pH neutro y
los hongos no pueden competir al menos que algún otro factor, como temperaturas bajas
o preservativos, generen un ambiente hostil para la bacteria. Cuando el pH esta por
debajo de 5, el crecimiento de las bacterias disminuye.
Las bacterias del género Lactobacillus son la excepción, y compiten con los hongos en
algunos alimentos hasta alcanzar un pH de 3,5. La mayoría de los hongos pueden vivir en
un amplio rango de pH ( 3 a 8). Algunos hongos conidiales son capaces de crecer a un pH
< 2 y las levaduras por debajo de un pH de 1.5. Sin embargo, el PH se aleja del óptimo.
usualmente alrededor del pH 5, el efecto del crecimiento es bueno.
Para los alimentos procesados calientes, el pH 4.5 es crítico: el procesamiento caliente

para destruir las esporas de Clostridium botulinum también destruye todas las esporas de
los hongos.
1.1.3 Temperatura
La influencia de la temperatura en la preservación de alimentos y en el deterioro son dos
facetas separadas: las temperaturas durante el procesamiento y las temperaturas durante
el almacenamiento.
Las esporas de los hongo resistentes al calor pueden sobrevivir al proceso de pasterización
utilizado en los alimentos ácidos. Aparte de unas pocas especies importantes, existe poca
información sobre la resistencia al calor de los hongos y la que sí existe debe
interpretarse con cuidado. Marshall y Walkley (1952). (Domsch et al., 1980).
En la interpretación de los datos de resistencia al calor, hay que considerar que las
condiciones de calor pueden profundamente afectar la resistencia al calor. Altos niveles
de azúcar pueden generalmente ser protectores (Beuchat y Toledo. 1997). Bajo pH y

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preservativos incrementan el efecto del calor (Beuchat, 1981a,b) y también obstaculiza la

reanimación de las células dañadas (Beuchat and Jones, 1978).
Para datos comparativos, es aparente que las ascosporas de los hongos filamentosos son
mucho más resistentes que los conidios. (Pitt y Christian,1970; Tabla 2.2). Aunque no es
estrictamente comparable, los datos de Put et al (1976) indican que la resistencia al calor
de las ascosporas de levadura y células vegetativas es del mismo orden que la de conidios
de hongos.
Entre los hongos ascomicetos, las especies de Byssochlamys son conocidas por echar a
perder los productos enlatados o frutas empacadas en vidrio (Olliver y Rendle, 1934; Put y
Kruiswijk, 1964; Richardson, 1965). Ascosporas de Neosartorya fischeri tienen una
resistencia similar B. fulva (Splittstoesser and Splittstoesser, 977), pero han sido
reportadas con menor frecuencia como una causa de deterioro de alimentos.
Alimentos congelados a -10°C o menos parecen ser microbiológicamente estable, a pesar

de algunos informes sobre el crecimiento de hongos a temperaturas más bajas. La
temperatura más baja reportada para el crecimiento de Fusarium (Joffe, 1962),
Cladosporium (Panasenko, 1967; Gill y Lowry, 1982), Penicillium (Mislivec y Tuite, 1970b) y
Thamnidium (Brooks y Hansford, 1923) está en el rango de -7 a 0ºC. Alimentos no
esterilizados almacenados a 5º C en refrigeradores domésticos, donde las condiciones de
alta humedad prevalecen, eventualmente se deterioran por hongos de estos géneros. Las
bacterias psicrófilas con alto aw y pH neutro, podría también ser importantes (por
ejemplo mayoría de especies de Pseudomonas; Michener y Elliot, 1964).
Hongos termófilos por ejemplo son aquellos que pueden solamente crecer en altas
temperaturas, raramente son de importancia en la descomposición de alimentos. Si se
produce un sobrecalentamiento de los productos básicos, sin embargo, en situaciones
tales como granos húmedos, los termófilos pueden ser un problema muy serio.

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Los hongos termo tolerantes, por ejemplo son especies que pueden crecer en ambos bajas
o altas temperaturas, tienen un mayor significado y A. niger, pueden crecer entre 8 y 45º
C (Panasenko, 1967) son algunos de los mohos más destructivos.
Tabla 2 Comparación de la resistencia al calor de asocosporas y conidias a

Hongo Tipo de Recuento viable Sobrevivientes
espora inicial/ml
50% 60% 70%
Eurotium Ascospora 497 93 85 3
amstelodani s
Conidia 728 107 0,3 0
Eurotium chevalieri Ascospora 1044 103 62 21
s
Conidia 886 128 0,1 0
Xeromyces bisporus Ascospora 1000 93 30 0,3
s
Aspergillus Conidia 382 102 0 0
candidus
Wallemia sebi Conidia 706 42 0 0
a
Calentado a temperaturas observadas por 10 minutos. Datos por Pitt y Christian (1970).
1.1.4 Potencial de oxido-reducción:
Los moho que deterioran los alimentos, como casi todos los otros hongos filamentosos,
tienen un requisito absoluto para el oxígeno. Sin embargo, muchas especies parecen ser
consumidores eficientes de oxígeno, de modo que la cantidad total de oxígeno disponible,
en lugar de la tensión de oxígeno, determina el crecimiento. La concentración de oxígeno
disuelto en el sustrato tiene una influencia mucho mayor en el crecimiento de hongos que
la tensión de oxígeno atmosférico (Miller y Golding, 1949).

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Por ejemplo, Penicillium expansum crece casi normalmente en 2,1 % de oxígeno en toda
su gama de temperaturas (Golding, 1945). Paecilomyces variotii producen colonias
normales a 25 ° C bajo 650 mm de vacío (Pitt, no publicado).
La mayoría de los mohos que deterioran los alimentos parecen ser sensibles a altos
niveles de dióxido de carbono, sin embargo, el crecimiento de varias especies de
Aspergillus y Penicillium fueron estimuladas por el aumento de dióxido de carbono hasta
un 15% en el aire, pero se reducen cuando los niveles son más altos (Golding, 1945; Miller
y Golding, 1949). Hay notables excepciones, Penicillium roqueforti creció a una tasa del 30
% en una atmósfera de 80 % de dióxido de carbono y 4,2 % de oxígeno, y una
temperatura <20 ° C (Golding, 1945). Xeromyces bisporus se ha informado que puede
crecer en niveles similares de dióxido de carbono (Dallyn y Everton, 1969).
Las especies Byssochlamys parecen ser particularmente tolerantes a las condiciones de la

reducción de oxígeno y / o dióxido de carbono elevado. Crecimiento de Byssochlamys
nivea se vio poco afectada por la sustitución de nitrógeno por dióxido de carbono en el
aire, por lo menos hasta un 90 % el dióxido de carbono (AR Yates et al., 1967). Tanto
Byssochlamys nivea y B. fulva fueron capaces de crecer en atmósferas que contenían 20
%, 40 % o 60 % de dióxido de carbono con menos del 0,5 % de oxígeno, pero la inhibición
aumentó con el aumento de la concentración de dióxido de carbono (Taniwaki , 1995 ).
Byssochlamys fulva es capaz de crecer en 0,27 % de oxígeno, pero no en su ausencia total
(King et al., 1969). También es capaz de fermentación en productos de frutas, pero sólo si
está presente algo de oxígeno.
Al menos algunas especies de Mucor, Rhizopus y Fusarium son capaces de crecer y

fermentar productos líquidos embotellados y, a veces causar el deterioro fermentativo.
Las especies de Mucor, Rhizopus y Fusarium usados en los cultivos de alimentos
fermentados pueden crecer en condiciones anaeróbicas, lo cual se ha demostrado por el
crecimiento en un frasco anaerobio con un generador de hidrógeno y dióxido de carbono

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(Hesseltine et al., 1985). Otros autores han informado de crecimiento en condiciones

anaeróbicas de hongos tales como especies de Mucor, Absidia spinosa, Geotrichum
candidum, Fusarium oxysporum y F. solani (Stotzky y Goos, 1965; Curtis, 1969; Taniwaki,
1995). Los hongos tipo levadura Moniliella acetoabutans pueden causar el deterioro de
procesos de fermentación en condiciones anaeróbicas (Stolk y Dakin, 1966).
Como una generalización, sin embargo, todavía es correcto afirmar que la mayoría de los
problemas de deterioro de los alimentos debido a los hongos filamentosos se producen
bajo condiciones aeróbicas, o al menos cuando la tensión de oxígeno es apreciable,
debido a una fuga o difusión a través de los envases.
En contraste, las especies de Saccharomyces, especies de Zygosaccharomyces y otras

levaduras fermentativas son capaces de crecimiento en ausencia completa de oxígeno. De
hecho, S. cerevisiae y Z. bailii pueden continuar el proceso de fermentación con varias
atmósferas de presión de dióxido de carbono. Esta propiedad de S. cerevisiae ha sido
aprovechada por el hombre para sus propios fines, en la fabricación de pan y muchos
tipos de bebidas fermentadas. Z. Bailii, por otro lado, es conocida por su capacidad para
seguir fermentando con un Aw reducido y en presencia de altos niveles de conservantes.
La fermentación de jugos y concentrados de frutas puede continuar hasta que la presión
del dióxido de carbono provoque distorsión en el contenedor o explosión. La especie
vecina Zygosaccharomyces rouxii es xerófila, y provoca el deterioro de líquidos con un Aw
muy bajo o de productos envasados como concentrados de fruta, mermelada y frutas
secas. La diferencia en los requerimientos de oxígeno entre mohos y levaduras de
fermentación es uno de los principales factores que determinan el tipo de deterioro de un
producto en particular.
1.1.5 Consistencia
La consistencia, como la tensión de gas, ejerce una influencia considerable sobre el tipo de
deterioro de un alimento. En términos generales, las levaduras causan deterioro más

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evidente en los productos líquidos, porque los microorganismos unicelulares son capaces
de dispersarse más fácilmente en estos sustratos. Por otra parte, los líquidos dan lugar a
condiciones anaeróbicas y la fermentación se ve produce más fácilmente en líquidos. En
contraste, los hongos filamentosos necesitan de sustratos firme, y de fácil acceso al
oxígeno.
1.1.6 Nutrientes
El estado nutricional de la mayoría de los alimentos es adecuada para el crecimiento de

cualquier microorganismo. En términos generales, sin embargo, parece que el
metabolismo de los hongos se ve favorecido por los hidratos de carbono, mientras que las
bacterias son más propensas a estropear los alimentos ricos en proteínas. Los
Lactobacilos son una excepción.
La mayoría de las especies de mohos son capaces de asimilar cualquier fuente de carbono
derivada de los alimentos con la excepción de los hidrocarburos y polímeros altamente
condensada tales como la celulosa y la lignina. La mayoría de los mohos son indiferentes a
la fuente de nitrógeno, usando nitrato, iones amonio o fuentes de nitrógeno orgánico con
igual facilidad. Algunas especies, sin embargo sólo logran crecer si los aminoácidos o
proteínas proporcionan tanto la fuente de carbono y de nitrógeno. Algunas cepas de
Penicillium subgen. Biverticillium son incapaces de utilizar nitrato (Pitt, 1979b).
Algunos hongos xerofílicos son conocidos por ser más exigente. Ormerod (1967) mostró
que el crecimiento de Wallemia sebi fue fuertemente estimulada por prolina. Especies
xerófilas de Chrysosporium y Xeromyces bisporus también Requieren de nutrientes
complejos, pero los factores involucrados no han sido definidos (Pitt, 1975).
Las levaduras son a menudo fastidiosas. Muchas son incapaces de asimilar nitrato o
carbohidratos complejos; Zygosaccharomyces bailii por ejemplo, no pueden crece con
sacarosa como única fuente de carbono. Algunas cepas requieren vitaminas. Estos

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factores limitan en cierta medida, los tipos de alimentos susceptibles al deterioro por
levaduras. La adición de nutrientes, por cualquier razón, pueden convertir un producto
seguro en un costoso fracaso.
1.1.7 Efectos específicos de soluto
Como se dijo anteriormente, el crecimiento microbiano en condiciones de menor

disponibilidad de agua se describe de manera más satisfactoria en términos de A w. Sin
embargo, los solutos particulares presentes en los alimentos pueden ejercer efectos
adicionales sobre el crecimiento de hongos. Scott (1957) informó que Eurotium
(Aspergillus) amstelodami creció 50% más rápido con Aw óptimo (0,96) que cuando el Aw
fue controlado por glucosa en lugar de cloruro de magnesio, cloruro de sodio o glicerol.
Pitt y Hocking (1977) mostraron un efecto similar para Eurotium chevalieri, e informaron
que los hongos xerófilos Chrysosporium fastidium y Xeromyces bisporus crecieron poco en
los medios que contenían cloruro de sodio como el principal soluto. En contraste Pitt y
Hocking (1977) y Pitt y Hocking (1979) mostraron que la germinación y el crecimiento de
varias especies de Aspergillus y Penicillium se vieron poco afectados cuando A w del medio
se controló con glucosa-fructosa, glicerol o cloruro de sodio.
Aunque Pitt (1975) expresó que no hay hongos que sean verdaderamente halófilos,
recientemente se han documentado algunos hongos adaptados a ambientes salinos.
Tanto Basipetospora halophila y Polypaecilum Pisce han demostrado que crecen más
rápidamente en medios que contienen cloruro de sodio. (Andrews y Pitt, 1987b; Wheeler
et al, 1988c). Tales hongos han sido llamados los xerófilos halófilos para distinguirlas de las
bacterias halófilas obligadas.
Zygosaccharomyces rouxii, es el segundo organismo más xerófilo conocido, puede crecer

en un medio con fructosa hasta un A w de 0,62 (von Schelhorn, 1950). su A w en cloruro de
sodio es mucho más alto, 0,85 Aw (Onishi, 1963).

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1.1.8 Los conservantes
Obviamente, los conservantes utilizados en los alimentos deben ser seguros para el
consumo humano. En virtud de esta limitación, en la mayoría de los países se limitan al
uso de conservantes débiles como el ácido benzoico, sórbico, nitroso, sulfuroso, acético y
propiónico o, en menor proporción de sus ésteres. Las concentraciones permitidas de
estos ácidos son útiles sólo a niveles de su pKa más uno de pH, ya que para ser eficaces,
deben estar presentes en forma de ácido no disociado.
El uso de conservantes químicos en los alimentos está regulada por la ley en la mayoría de
los países. Se limitada a niveles relativamente bajos, y para alimentos específicos. Algunas
especies de hongos poseen mecanismos de resistencia a los conservantes ácidos, los más
notables son Zygosaccharomyces bailii (Pitt y Richardson, 1973; Warth 1977). Esta
levadura es capaz de crecer y fermentar licores a base de frutas con pH 2,9 -3, 45 ° C Brix
y que contiene 800 mg / L, de ácido benzoico (Pitt y Hocking, 1985a). el hongo Moniliella
acetoabutans puede crecer en presencia de ácido acético al 4%, y sobrevivir en 10% (Pitt y
Hocking, 1985a).
El hongo filamentoso Penicillium roqueforti parece ser especialmente resistentes a los

conservantes de ácido débil y esta propiedad se ha sugerido como una ayuda útil para el
aislamiento e identificación (Engel y Teuber, 1978).
CONCLUSIONES: CONSERVACIÓN DE LOS ALIMENTOS
Es evidente que el crecimiento de los hongos en un alimento está gobernada en gran

medida por una serie de parámetros físicos y químicos, y el estudio de estos factores
puede ayudar en la evaluación de la estabilidad e inocuidad de éstos. La situación en la
práctica se hace más compleja por el hecho de que tales factores con frecuencia no actúan
independientemente, pero si de forma sinérgica. Si dos o más de los factores
anteriormente enumerados actúan simultáneamente, los alimentos pueden ser más

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seguro de lo esperado. Esto ha sido descrito por Leistner y Rodel (1976) como el
"concepto de obstáculo". Este concepto ha sido evaluado cuidadosamente para algunos
productos básicos como las salchichas alemanas.
La influencia de los ocho parámetros mencionados anteriormente en la germinación y el

crecimiento la mayoría de los hongos sigue siendo escaso. Sin embargo, se puede
encontrar la información suficiente sobre el deterioro de algunos alimentos causado por
los hongos.
PREGUNT
2. MÉTODOS PARA AISLAMIENTO, ENUMERACIÓN E IDENTIFICACIÓN.
2.1 Muestreo
Se debe enfatizar que los resultados de los análisis micológicos de alimentos sólo son tan
buenas como las muestras que se vayan a utilizar. Excelentes tratados sobre planes de
muestreo para fines alimentarios han sido descritos por la Comisión Internacional de
Especificaciones Microbiológicas para los Alimentos (ICMSF, 1986), y son de aplicación
general a la micología alimentos.
2.2 Técnicas de Enumeración

La cuantificación del crecimiento de los hongos filamentosos es mucho más difícil que las
bacterias o levaduras. El crecimiento vegetativo consiste de hifas, que no son separadas
fácilmente del sustrato. Cuando se produce la esporulación, un número muy alto de
esporas se pueden producir, provocando fuertes aumentos en los recuentos de viables, a
menudo sin gran aumento de la biomasa (Pitt, 1984).

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La estimación del crecimiento fúngico o la biomasa no es fácil, porque no existe un patrón

primario (por ejemplo, como los números de células utilizadas para la levadura y
bacterias). Aunque las técnicas para la cuantificación de biomasa han mejorado en los
últimos años, la mayoría de los laboratorios de alimentos siguen confiando en el recuento
viable (dilución) para detectar y cuantificar el crecimiento de hongos en los alimentos.
La técnica de dilución en plato y el plaqueo directo, son dos técnicas que han sido
desarrolladas para estimar el crecimiento de los hongos en los alimentos.
2.2.1 Plaqueo directo.
El plaqueo directo es el método preferido para la detección, la enumeración y el

aislamiento de los hongos en los alimentos como granos y frutos secos. Los granos o
partículas de alimentos se colocan directamente en medios de agar solidificado. En la
mayoría de las situaciones, éstos deben ser desinfectados antes de la siembra, ya que se
debe eliminar la contaminación de la superficie adquirida del polvo y de otras fuentes, y
permite la recuperación de los hongos que crecen en realidad dentro de los granos. Este
proceso proporciona una medida efectiva de la calidad micológica inherente, y permite la
evaluación de la posible presencia de micotoxinas también.
La desinfección de superficies debe omitirse cuando los contaminantes superficiales se

vuelven parte de la micoflora, por ejemplo, en el grano destinado a la fabricación de
harina. Incluso en este caso, la desinfección de superficies antes de la siembra directa
ofrece la evaluación más realista de la calidad del grano real.
Los resultados de los análisis del plaqueo directo se expresan como porcentaje de
infección de partículas. La técnica no proporciona ninguna indicación directa de la
extensión de la invasión fúngica en partículas individuales. Sin embargo, es razonable
suponer que un alto porcentaje de infección se correlaciona con la invasión extensa en las
partículas, y un mayor riesgo de aparición de micotoxinas.

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El protocolo estándar adoptado por el segundo taller de internación es la siguiente (Pitt et

al., 1992), con la amplificación en caso necesario.
2.2.1.1. Desinfección de superficies. La desinfección de superficies se lleva a cabo

mediante la inmersión de las partículas en una solución de cloro. Cloro de uso doméstico,
nominalmente 4.5% de cloro activo, es eficaz. Diluir el cloro 1-10 con agua antes de su
uso, para proporcionar una solución aproximadamente 0,4%. sumergir las partículas por 2
minutos, revolviendo de vez en cuando, luego drenar el cloro. Las soluciones de cloro se
desnaturalizan rápidamente por la materia orgánica, por lo que es importante utilizar un
excedente de solución de cloro (10 veces el volumen de las partículas) y para utilizar la
solución una sola vez.
Este proceso se debe llevar a cabo en vasos de precipitados de 250 a 500 ml. Se debe
colocar 50 o más partículas en el vaso, y añadir el cloro. Para desalojar las burbujas de
aire, se deben remover con un par de pinzas, posteriormente se deján en la solución, y se
cubre el vaso con un vidrio de reloj. El vidrio de reloj simplifica la decantación del cloro y
las pinzas desinfectados por el cloro, pueden ser utilizados para el plaqueo directo de las
partículas.
Estudios recientes han demostrado que el tratamiento descrito aquí puede ser
insuficiente en algunas condiciones como el maní o maíz, donde los altos niveles de
Aspergillus flavus o especies de Penicillium pueden estar presentes, la desinfección de
superficies puede ser difícil. Aquí se recomienda 2 min de inmersión en etanol al 70%,
seguido por 2 min en 0,4% de cloro.
2.2.1.2. El enjuague. Una vez terminado el tiempo de desinfección, se debe eliminar el

cloro y las partículas deben ser enjuagadas por un minuto con agua esterilizada, utilice las
pinzas estériles para revolver, después vierta el agua. Una vez más un vidrio de reloj debe
cubrir el vaso de precipitado. No está claro si el enjuague cumple alguna función esencial.

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Los regímenes de plaqueo directo utilizan agentes tales como cloruro de mercurio para la
desinfección y el enjuague es esencial para eliminar tales materiales tóxicos antes de que
penetren profundamente en las partículas. Sin embargo, el cloro se desnaturaliza
eficazmente por las partículas y se cree que penetra muy poco. Así que la etapa de lavado
se puede omitir sin pérdida de eficacia del tratamiento, con el ahorro de tiempo y
materiales, y reduce el riesgo de contaminación del aire.
2.2.1.3. Plaqueo directo: Después de la desinfección y el enjuague opcional, las partículas

deben ser sembradas en agar solidificado, a razón de 6 a 20 partículas por placa,
dependiendo del tamaño de las partículas. Utilice las pinzas desinfectadas. El
recubrimiento debe llevarse a cabo inmediatamente: mantener el vidrio de reloj en el
vaso de precipitados si esto no es posible.
2.2.1.4 Incubación. Incubar las placas en posición vertical, durante 5 días a 25 ° C.
2.2.1.5 Lectura de la prueba: Después de la incubación, examinar las placas visualmente,

cuente el número de partículas infectadas, y expresar los resultados como un porcentaje.
El conteo diferencial de algunos géneros es a menudo posible. La correcta elección de los
medios, un microscopio estereoscópico y la experiencia le ayudará en este proceso.
2.2.2 Dilución en placas
El método de dilución en placas de Petri es el método apropiado para el análisis

micológico de alimentos líquidos o en polvo. También es adecuado para los granos
destinados a la fabricación de harina, y otras situaciones donde la contaminación fúngica
total es relevante.
2.2.2.1. Preparación de la muestra. Los dos métodos más comunes de preparación de la

muestra para la siembra de dilución son stomaching y mezclar: stomaching es

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recomendado por ICFM (King et al., 1986). El Colworth Stomacher (Sharpe y Jackson,
1972) es un dispositivo muy eficaz para dispersar y separar los hongos de los materiales
finamente divididos tales como la harina,las especias y los alimentos blandos, como
quesos y carnes, y su uso es muy recomendable. El tiempo de tratamiento en el
Stomacher debe ser de 2 min. Alimentos más duros o en partículas tales como granos,
frutos secos o alimentos secos tales como legumbres secas, deben ser remojados antes de
llevarlos al stomaching. Los tiempos de remojo deben estar entre 30 a 60 minutos. pero
para partículas extremadamente duras, como las legumbres secas, puede ser necesario el
remojo durante un máximo de 3 horas. La trituración en un mezclador Waring o una
máquina similar es una alternativa adecuada para este tipo de muestras, y pueden dar un
homogeneizado más satisfactorio. Los tiempos de mezcla no debe exceder de 60
segundos, por que los tratamientos más largos pueden fragmentar el micelio en
fragmentos cortos que pueden no ser viables o por que se puede sobrecalentar el
homogeneizado.
El tamaño de la muestra utilizada debe ser tan grande como sea posible. Si se utiliza un
Stomacher 400 el tamaño de la muestra debe ser entre 10 a 40 gramos.
2.2.2.2 Los diluyentes. El diluyente recomendado es el agua peptonada a 0,1% (Kurtzman

et al., 1971), adecuada tanto para los hongos filamentosos y levaduras. Las soluciones
salinas, el buffer fosfato o agua destilada ya no son recomendadas por ICFM ya que
pueden ser perjudiciales para las levaduras (Mian et al., 1997). La adición de un agente
humectante tal como polisorbitán 80 (Tween 80) puede ser deseable para algunos
productos, pero la capacidad de humectación natural de la peptona es generalmente
adecuada.
Diluyentes especiales pueden ser necesario en algunas circunstancias. Si las levaduras van
a ser enumeradas a partir de productos secos o concentrados de zumo de frutas, el
diluyente debe también contener un 20-30% de sacarosa, glucosa o glicerol, ya que las

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células pueden ser dañadas o ser susceptibles a choque osmótico. La formulación óptima
todavía no ha sido establecida, quizás el 20% de glicerol es el más satisfactorio.
2.2.2.3. La dilución: Las diluciones seriadas de hongos se llevan a cabo con los mismos
procedimientos que utilizados en bacteriología, y la tasa de dilución recomendada es de
1:10 (= 1 + 9). Las esporas de hongos se sedimentan más rápidamente que las bacterias,
por lo que es importante establecer alícuotas para la dilución tan pronto como sea
posible, preferiblemente dentro de un minuto (Beuchat, 1992a).
2.2.2.4 Siembra: Se recomienda la siembra en superficie. Si se utiliza la siembra en

profundidad los hongos se desarrollan más lentamente por debajo de la superficie del
agar y pueden ser ocultadas por las colonias que crecen más rápido en la superficie. Por
lo tanto la siembra en superficie permite el desarrollo de colonias más uniformes, mejora
la precisión de la enumeración de las colonias y hace que el posterior aislamiento de
cultivos puros se más fácil.
El inóculo óptimo para la siembra en superficie es de 0,1 ml. Se obtendrán mejores

resultados si las placas se secan ligeramente antes de su uso. Después de añadir el
inóculo, se debe extender uniformemente sobre la superficie del agar con una varilla de
vidrio doblada estéril ("palo de hockey"). Esterilice la varilla por flameado con etanol antes
de su uso. Una ruleta para placas es un accesorio útil. Por lo general, es posible enumerar
las placas con un máximo de 150 colonias, pero si una gran proporción de los hongos que
crecen rápidamente están presentes, la cantidad máxima que se puede distinguir con
precisión será menor. Debido a esta restricción en los números máximos, puede ser
necesario en algunos casos aceptar los recuentos de placas con tan sólo 10 a 15 colonias.
Es evidente que este tipo de limitaciones en los números por placa y el crecimiento
excesivo de las colonias darán lugar a errores de conteo.

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En consecuencia, se ha sugerido que 1: 5 diluciones pueden tener ventajas en Micología

alimentos. Sin embargo, los estudios definitivos sobre este punto aún no se han llevado a
cabo, y las complicaciones resultantes de los cálculos son un inconveniente.
Son menos difíciles de enumerar las levaduras. En ausencia de hongos filamentosos, de 30

a 300 colonias por placa puede ser contadas y los errores serán comparables con los que
se espera en la enumeración bacteriana.
2.2.2.5. La incubación. Las condiciones de incubación estándar son 25 ° C durante 5 días.

Sin embargo, otras condiciones pueden ser más adecuados en algunas circunstancias.
2.2.2.6. Informe de los resultados. Como en bacteriología, los resultados de dilución en

placas se expresan como recuentos viables por gramo de muestra. Tenga en cuenta que
estos resultados no son directamente comparables con los obtenidos a partir de la
siembra directa, y de nuevo no ofrecen una indicación directa de la extensión del
crecimiento de hongos.
2.2.3 Las condiciones de incubación.
Como se señaló anteriormente, las condiciones de incubación estándar especificadas por

ICFM son 25°C durante 5 días (King et al, 1986;.. Pitt et al, 1992). Sin lugar a dudas, 25°C es
la temperatura más adecuada en ambientes subtropicales. Pocos o ninguno de los hongos
comunes son sensibles a esta temperatura, incluso aquellos que crecen fácilmente en
condiciones de refrigeración. Las temperaturas más altas son inaceptables: 30°C está
cerca del límite superior para el crecimiento de algunas especies importantes de
Penicillium. En las regiones tropicales, se recomienda la incubación a 30°C, como una
temperatura más realista para la enumeración de los hongos de productos almacenados a
temperatura ambiente. En las regiones templadas frías como Europa, 22°C se ha
recomendado como la temperatura óptima de incubación (Mossel et al., 1970).

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Cuando se utiliza para los hongos, placas de Petri se deben almacenar en posición vertical.
La razón principal es que algunos hongos comunes pueden arrojar un gran número de
esporas durante la manipulación, que en un plato invertido será transferido a la tapa.
Reinversión de la placa de Petri para la inspección o la retirada de la tapa puede liberar
esporas en el aire o sobre y causar serios problemas de contaminación.
2.3 Las superficies de muestreo: Los métodos que se describen a continuación son para
muestrear directamente la micoflora de las superficies de los productos básicos, tales
como frutas, carnes, quesos, embutidos y pescado seco, así como materiales de embalaje,
maquinaria y paredes. Las técnicas se basan de los descritos por Langvad (1980) para el
estudio de la flora de hongos de las hojas.
Si las muestras son partículas, o pueden ser cortadas, se pueden utilizar las pinzas estériles
para presionar piezas de un tamaño adecuado (aproximadamente 10 mm 2 ) en un medio
adecuado en una placa de Petri. Se retira la muestra, dejando una impresión, y las esporas
de micelio trasladado formarán colonias dentro de unos días. Esta técnica se conoce como
recubrimiento prensado.
Para materiales tales como cartón de embalaje, un método alternativo es cortar una pieza
que se ajuste en una placa de Petri estándar. El plato se prepara mediante la adición de un
papel de filtro estéril humedecido con 10% de glicerol y luego la adición de una varilla de
vidrio doblado como un separador. Después se coloca la muestra y sobre su superficie se
vierte, una capa delgada de un medio de agar apropiado. Para reducir la evaporación, el
plato debe ser sellado con Parafilm o de un material similar o colocado en bolsa de
polietileno antes de la incubación a 25o C durante unos pocos días. Si los niveles de
contaminación no son demasiado pesados, los números y los tipos de mohos presentes
pueden ser estimados eficazmente por este método. Las microcolonias pueden ser
subcultivados para su identificación.

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Para el muestreo de las paredes u otras superficies, o para el muestreo no destructivo, las
impresiones pueden ser tomadas con cinta adhesiva. La cinta procedente del rollo será
prácticamente estéril. Pulse una corta longitud de la cinta firmemente sobre la superficie a
muestrear, lado adhesivo hacia abajo, y luego transfiéralo siempre con la misma cara
hacia abajo, en un medio de crecimiento adecuado. Después de 1-2 días de incubación a
25 ° C, la cinta puede ser retirada para permitir el desarrollo y esporulación de las
colonias.
Las superficies pueden ser muestreadas mediante el uso de hisopos estériles o por
métodos de contacto con agar. El método del hisopo implica frotar un hisopo de algodón
estéril humedecido sobre la superficie de prueba y colocar el hisopo en un tubo de
dilución para ser posteriormente sembrada en los medios de cultivo apropiados. Las
placas de contacto Agar, también conocido como RODAC (Replicar Organismo directa Agar
Contacto) están restringidas a ser utilizadas en superficies planas lisas o semi-lisas. Una
alternativa a las placas de contacto con agar es la técnica rebanada de agar, donde se
introduce el agar por medio de un aparato similar a una jeringa o en un envase para
embutidos artificial. El agar solidificado puede ser empujado hacia fuera sobre la
superficie a muestrear, entonces la porción que tuvo contacto se corta con un bisturí
estéril o alambre, y se coloca en una placa de Petri para la incubación.
2.4 Muestreo de Aire
El método más simple de muestreo de aire es por sedimentación o método gravimétrico.

Una placa de Petri que contiene un medio de agar apropiado se expone a la atmósfera
durante un período fijo de tiempo (por lo general 15 a 30 min), luego la caja se cierra y se
incuba a 25 ° C (Samson et al., 1995). Este método puede ser útil en áreas de producción
de alimentos, ya que da una indicación directa de la cantidad y tipos de hongos que
puedan entrar en contacto con el producto expuesto. Sin embargo, el muestreo
volumétrico de aire es un indicador mucho más fiable de la calidad del aire.

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Un número de dispositivos de muestreo de aire están disponibles comercialmente. De

estos, el Anderson Sampler es probablemente el mejor, dando resultados precisos y
consistentes (Buttner y Stetzenbach, 1993). Sin embargo, el Anderson Sampler es caro y
requiere de alimentación de red o una batería de gran tamaño para el funcionamiento. En
situaciones de fábrica, la pila seca operado Biotest RCS y RCS Plus muestreadores de aire
centrífugos (Biotest AG, Dreieich, Alemania) son más conveniente, ya que son pequeños y
portátiles. El muestreador Biotest RCS Plus dá resultados comparables a máquinas más
grandes y más sofisticadas, pero su eficiencia de muestreo disminuye gradualmente con el
tamaño de partículas por debajo de 4µm.
PREGUNTAS:
MEDIOS DE CULTIVO UTILIZADOS EN MICOLOGÍA DE ALIMENTOS
2.6.3 Técnicas para levaduras
El medio más simple enumeración y crecimiento para la mayoría de las levaduras que
alteran los alimentos es el Agar de extracto de malta (MEA). Aunque fue introducido
originalmente como un medio de crecimiento mohos, la riqueza de nutrientes hace que
sea adecuado para levaduras, y su pH relativamente bajo (por lo general alrededor de 5.0)
reduce la posibilidad de contaminación bacteriana.
Más recientemente, el extracto de agar de triptona de levadura glucosa (TGY) ha sido

recomendado para la enumeración de levaduras (Hocking et al., 1992). Debido que cuenta

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con una mayor concentración de glucosa (10%) y mayor pH (5.5 - 6.0), este medio es más
eficaz en la recuperación de células de levadura estresada, y el desarrollo de la colonia es
generalmente más rápido que en MEA. Sin embargo, su pH más alto significa que un
antibiótico debe ser incorporado para la enumeración de levaduras a partir de muestras
de alimentos que pueden contener bacterias. Antibióticos recomendados son
Cloramfenicol u oxitetraciclina a las concentraciones que son utilizados en DRBC y OGY.
Tanto MEA y TGY son adecuados para la enumeración de levaduras en productos como
zumos de frutas, purés de frutas y yogur, en los cuales los mohos suelen estar presentes
en bajo número. Si se sospecha que un gran número de moho puede estar presente en un
alimento, a menudo en el caso de productos sólidos como el queso, se debe utilizar un
medio de enumeración general como DRBC.
En los casos en que la enumeración de levaduras sigue siendo difícil se pueden utilizar
medios de cultivo como DRBC. Una técnica valiosa es la de Jong y Put (1980), que consiste
en una incubación anaeróbica tres días. Se recomienda Agar Mycophil (BBL), pero el agar
extracto de malta debe ser igualmente adecuado. Los antibióticos pueden ser añadidos si
necesario. Las placas se incuban a 25°C durante 3 días en un frasco anaerobio, entonces
de sacan y se incuban aeróbicamente durante otros 2 días a 25º C. Como muchas
levaduras alterantes son capaces de crecer en condiciones anaerobias, las colonias
iniciarán el desarrollo sin la posibilidad de proliferación de mohos.
2.6.3.1. Enriquecimiento de levaduras en productos líquidos: En productos alimenticios

líquidos con bajos números de levaduras pueden ser difíciles de detectar, pero pueden
tener provocar su deterioro. Técnicas de enriquecimiento son la única manera
satisfactoria de controlar los productos bajo estas circunstancias.
Para los productos o materias primas libres de sólido suspendido y de baja viscosidad, las
técnicas de filtración de membrana estándar son un método satisfactorio para detectar
bajas cantidades de levaduras. El filtro puede ser colocado directamente sobre un medio

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adecuado, tal como MEA o TGY. La centrifugación también puede ser utilizada, pero tiene
la desventaja que sólo volúmenes de producto relativamente pequeños pueden ser
examinados.
Si los productos o materias primas son viscosas, de baja a w o contienen pulpas y no se

pueden filtrar de manera eficiente, se requieren otras técnicas de enriquecimiento. En
muchos casos, el mejor medio de enriquecimiento es el producto en sí, se diluyó 1: 1 con
agua esterilizada. Dejar la tapa suelta, incubar a temperatura ambiente o 30 ° C, y ver la
evidencia de la fermentación. Sacudiendo a diario el contenedor ayudará a detectar los
gases resultantes de la fermentación.
Técnicas de enriquecimiento clásicas utilizadas en bacteriología también se pueden utilizar

para las levaduras. El caldo de TGY se ha usado con mucho éxito en nuestro laboratorio
para el enriquecimiento de un bajo número de levaduras en los productos líquidos. Añadir
10 ml de producto a 90 ml de caldo TGY e incubar a 25 ° C durante 3-4 días, o 30°C
durante 2-3 días. Busque señales de la fermentación, y hacer resiembras en agar TGY.
2.6.3.2. La detección de levaduras resistentes a los conservantes. Unas pocas especies de

levaduras son capaces de crecer en productos que contienen conservantes tales como
ácido sórbico, benzoico y acético o dióxido de azufre. El más importante de ellos es
Zygosaccharomyces bailii. La manera más simple y más eficaz para la detección de
levaduras resistentes conservantes es difundir o replicar el producto en placas de Agar
ácido acético malta (MAA), que es MEA con ácido acético al 0,5% (Pitt y Richardson, 1973),
o TGY con 0.5 ácido acético% (TGYA, Hocking, 1996).
MAA y TGYA se realizan añadiendo glacial ácido acético (16N) para una concentración
final de 0,5%. Mezclar y vertir inmediatamente. Estos medios no necesitan estrilizarse
debido a su pH más bajo (aproximadamente 3.0 y 3.5 para MAA y TGYA respectivamente).
El ácido acético no requiere esterilización antes de su uso.

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MAA y TGYA son los medios adecuados para el seguimiento de las materias primas, líneas
de proceso y los productos que contienen conservantes para la levadura resistentes. Éstos
son eficaces para pruebas con levaduras resistentes a los conservantes. Recientemente,
un medio selectivo para Zygosaccharomyces bailii ha sido publicado (Erickson, 1993).
Zygosaccharomyces bailii Medio (ZBM) se basa en el Agar de Dextrosa Sabauroud
modificado con fructosa, NaCl, triptona, extracto de levadura y colorante azul de tripano,
a continuación ácido acético (0,5%) y sorbato de potasio (0,01%) se añaden para hacer
que el medio sea selectivo.
Cuando se compara con MAA y TYGA en un estudio entre laboratorios, ZBM se encontró
que era altamente selectivo para Zygosaccharomyces bailii, a la exclusión de otras
levaduras resistentes a los onservantes como Schizosaccharomyces pombe y Pichia
membranifaciens. En adicción, la recuperación de las células Z. bailii subletalmente
dañadas por liofilización fue significativamente más bajo en ZBM que en TGYA o MAA
(Hocking, 1996). Su alta formulación selectiva y compleja hace a ZBM inadecuado para su
uso rutinario de laboratorio como un medio para la detección de levaduras resistentes a
los conservantes.
2.6.3.3. Enriquecimiento de levaduras resistentes a los conservantes. Una técnica capaz

de detectar los números de levadura tan bajas como una ufc / ml dentro de 4 días. Este
método es particularmente adecuado para la detección de Zygosaccharomyces bailii en
las materias primas o producto terminado, pero también se puede utilizar para la
detección de Schizosaccharomyces pombe, Pichia membranaefaciens y otras especies de
levaduras resistentes a los conservantes. El método implica una etapa de enriquecimiento
de 2 a 3 días seguido de una etapa de siembra con más 2 días de incubación. Por triplicado
20 ml de caldo triptona glucosa extracto de levadura (TGY) que contienen ácido acético al
0,5% (TGYA) se inoculan con 1 g o 1 ml de producto y los caldos se incuban a 30 ° C.
Después de incubar durante 48 a 72 horas, 0,1 ml de cada caldo se replica en placa sobre
agar TGY que contiene ácido acético 0,5%, y las placas se incuban a 30 ° C.

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El tiempo de detección del método se acorta mediante la incubación de los caldos y las
placas a 30°C en lugar 25°C, como la temperatura de crecimiento óptima para
Zygosaccharomyces bailii es 30 - 32 ° C (Jermini y Scmidt-Lorenz, 1987b). La sensibilidad
del método aumenta en gran medida mediante el uso de caldos por triplicado en lugar de
caldos únicos o duplicados, y por la propagación del recubrimiento 0,1 ml de cada caldo
de rayas en lugar de un asa de siembra en agar TGYA.
Este método ha sido utilizado para detectar bajo número de células de

Zygosaccharomyces bailii en que se inocula experimentalmente jarabe cordial, mayonesa,
aderezo de ensalada y salsa de barbacoa, y otras levaduras resistentes a los conservantes,
tales como Schizosaccharomyces pombe, Pichia membranaefaciens y algunas cepas
resistentes a los conservantes de Saccharomyces cerevisiae. Levaduras de resistencia
intermedia (por ejemplo Debaryomyces hansenii, Candida krusei y Torulaspora
delbrueckii) también pueden ser detectados por este método.
Mejores recuperaciones se obtuvieron utilizando TGY que MEA debido al hecho de que el
pH del caldo TGY + 0,5 ácido acético es 3,8, en comparación con pH 3,2 para MEA + ácido
acético 0,5%, y hay una menor concentración de glucosa (2%) en el sistema MEA en
comparación con el 10% en TGY. Las levaduras que son incapaces de crecer en presencia
de ácido acético u otros conservantes de ácido débil (sórbico o ácido benzoico y sus sales)
no son detectadas por este método.
2.6.4 Técnicas para hongos resistentes a temperatura.
Los hongos resistentes a la temperatura de fermentación, como Bysochlamys,

Talaromyces, Neosartorya y especies Eupenicillium pueden ser aislados selectivamente de
zumos de frutas, pulpas y concentrados por técnicas de pasteurización en el laboratorio.
Hay un número de métodos publicados, en su mayoría se indica en Beuchat y Rice (1979).
Dos métodos se describen aquí: el primero es el método de siembra de Murdock y

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Hatcher (1978) adaptada para muestras más grandes y el segundo el método de

incubación directa.
2.6.4.1. Método de siembra. Si la muestra a analizar es superior a 35°Brix, primero debe

diluirse 1.1 con 0,1% de peptona o diluyente similar. Para los zumos de frutas muy ácidas
como el de maracuyá, normalmente cerca de pH 2,0, el pH debe ser ajustado a 3.5 - 4.0.
Dos muestras de 50 ml c/u se toman para análisis. Las dos muestras se colocan en tubos
de ensayo de 200 x 30 mm con taparosca y se calientan en un baño de agua a 80°C
durante 30 minutos, después se enfrían rápidamente. Cada muestra de 50 ml se
distribuye en cuatro placas de Petri y se mezcla con la PDA doble agar dextrosa o MEA.
Las placas de Petri se colocan selladas en una bolsa de plástico para evitar que se sequen y
se incubaron a 30°C durante un máximo de 30 días. Las placas se examinan semanalmente
para ver el crecimiento. La mayoría de mohos producirán colonias visibles dentro de los
diez días, pero la incubación debe hacerse hasta 30 días. Permite la posible presencia de
esporas gravemente dañados por calor, que pueden germinar muy lentamente. Este
tiempo de incubación largo también permite que la mayor parte de mohos maduren y
esporulen, ayudando a su identificación.
El principal problema asociado con esta técnica es la posibilidad de contaminación aérea

de las placas con las esporas de moho común, lo que dará falsos positivos. El crecimiento
de las colonias de Penicillium verdes, o colonias de especies comunes de Aspergillus tales
como A. flavus y A. niger, es una clara indicación de contaminación de hongos que no son
resistentes al calor. Para minimizar este problema, las placas deben ser vertidas, si es
posible, en una cabina de flujo laminar. Si un producto contiene un gran número de
esporas de bacterias resistentes al calor (por ejemplo, especies de Bacillus), los
antibióticos pueden ser añadidos al agar. La adición de cloranfenicol (100 mg / l o medio)
evitará que el crecimiento de estas bacterias.
2.6.4.2. Método de incubación directa. Un método más directo utilizado para el cribado
de pulpas de frutas y otros materiales semisólidos evita los problemas de la

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contaminación aérea. Coloque aproximadamente 30 ml de pulpa en cada uno de tres o

más botellas planas de 100 mL. Calentar las botellas en posición vertical durante 30
minutos a 80°C y enfriar rápidamente. Las botellas de pulpa se pueden incubar
directamente, sin la adición de agar. Deben incubarse en forma plana, permitiendo una
superficie tan grande como sea posible, por un máximo de 30 días a 30 ° C. Cualquier
colonia de moho que se desarrolle tendrá que ser subcultivadas en un medio adecuado
para la identificación. Si los contenedores tales como botellas Roux están disponibles, las
muestras más grandes pueden ser examinados por esta técnica, pero los tiempos de
calentamiento debe ser aumentada. El contenido de la botella deben alcanzar al menos
75° C durante 20 minutos, dato que debe ser verificado con un termómetro suspendido
cerca del centro de la pulpa.
2.6.5. Otras técnicas de plaqueo: Otras técnicas que se han desarrollado para las
bacterias se han aplicado para la enumeración de hongos.
2.6.5.1 Recuento en placa espiral. Zipkes et al. (1981) evaluaron la aplicación del
procedimiento de la placa de caracol a la enumeración de levaduras y mohos. Compararon
este procedimiento con el vertido de placa de los métodos tradicionales, y encontraron
que la siembra en espiral dio una mayor recuperación y menores errores que con otros
métodos. El medio que utilizaron fue agar dextrosa de patata, pero se pueden utilizar
otros medios de cultivo. El recubrimiento espiral parece haber sido poco utilizado por
micólogos alimentos.
2.6.5.2. Filtros de membrana rejilla hidrofóbica.

Los filtros de membrana sobreimpresos con una rejilla cuadrada hidrófobica se han
desarrollado para la rápida enumeración de bacterias. El filtro de membrana de rejilla
hidrofóbica (HGMF) "Count" está determinado por un número más probable (NMP) de
cálculo. Brodsky et al. (1982) aplicaron la técnica HGMF para contar levaduras y mohos en
los alimentos. Ellos lo compararon con la siembra en superficie en agar de dextrosa de
patata modificada con antibióticos, y encontraron que la técnica HGMF produce recuentos

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superiores en 2 días comparado con el método tradicional después de 5 días. El método

HGMF podría encontrar un uso para la evaluación de la calidad de las materias primas
antes de su incorporación a un producto. Por ejemplo, Erickson (1993) ha propuesto un
método que utiliza HGMF en conjunción con un medio selectivo para la detección de las
levaduras resistentes a los conservantes como Zygosaccharomyces bailii, sin embargo, el
uso de HGMF requieres soportes especiales para los filtros de membrana y un sistema de
recuento automatizado. El número de colonias en una HGMF puede ser contado
visualmente, pero es un proceso relativamente lento.
2.6.5.3. Un método de cultivo por película: Petrifilm YM Tm. Petrifilm YM (3M Company,
St. Paul, MN, EE.UU.) es un sistema para enumerar los hongos en una capa de medio
encerrado en una película de plástico, lo que elimina el uso de placas de Petri. Beuchat et
al. (1990). Los recuentos de una amplia variedad de alimentos con altos Aw se
compararon en Petrifilm YM con métodos tradicionales de aislamiento. Se encontró que
Petrifilm YM fue tan eficaz como los otros métodos y era una tecnología alternativa
aceptable. Sin embargo, ninguno de los sistemas probados era particularmente eficaz en
la inhibición del crecimiento de mohos como Rhizopus y Mucor. Además, los subcultivos
de las colonias para la identificación eran más difícil de Petrifilm YM que de placas
tradicionales de Petri.
PREGUNTAS:

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3. ESTIMACIÓN DE LA BIOMASA FÚNGICA
La biomasa se considera generalmente como la medida fundamental del crecimiento

fúngico, pero no es fácil de cuantificar en las condiciones existentes en los alimentos. El
peso seco del micelio es la técnica más utilizada como una estimación de la biomasa, pero
su relación con el peso húmedo de micelio varía ampliamente en los alimentos, debido a
la gran influencia de Aw. Los hongos que crecen en un sustrato con un A w reducido se
puede esperar que sean más densos que los que tienen un A w alto, debido al aumento de

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las concentraciones de solutos internos, aunque esto es excepcionalmente difícil de medir

experimentalmente. La medición satisfactoria de biomasa hongos sigue sin respuesta.
A pesar de estos problemas básicos, varias técnicas químicas y bioquímicas se han

desarrollado para estimar el grado de crecimiento de hongos en los productos básicos.
Estas técnicas se basan en algún componente único del hongo que no se encuentra en
otro microorganismo o alimentos, o en técnicas inmunológicas o moleculares. La mayoría
se encuentran todavía en la fase de desarrollo: los más importantes se describen
brevemente aquí.
3.1 La quitina
La quitina es un polímero de N-acetil-D-glucosamina, y es un constituyente principal de las

paredes de las esporas fúngicas y el micelio. También ocurre en el exoesqueleto de los
insectos, pero no está presente en las bacterias o en los alimentos. Por lo tanto el
contenido de quitina de un alimento o materia prima puede proporcionar una estimación
de la contaminación fúngica.
Para la determinación de La quitina se utiliza el método de Ride y Drysdale (1972). La

hidrólisis alcalina de la muestra de comida a 130°C causa despolimerización parcial de
quitina para producir quitosano. El tratamiento con ácido nitroso provoca entonces la
solubilización parcial y desaminación de residuos de glucosamina para producir 2,5-
anhidromanosa, que se estima colorimétricamente usando clorhidrato de hidrazona 3-
metil-2-benzotiazolona como el reactivo principal. La hidrólisis alcalina se lleva a cabo más
fácilmente a 121°C en un autoclave (B.Jarvis, 1977). La sensibilidad del ensayo mejoró
mediante la derivación de glucosamina y otros productos con oftalaldehido, la separación
por cromatografía líquida de alta resolución y detección de compuestos fluorescentes con
espectrofluorometro (Lin y Cousin, 1985). El ensayo de la quitina sigue siendo bastante
complejo y lento, por lo general requieren aproximadamente 5 horas.

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Un número de estudios han indicado que el ensayo de quitina es una técnica valiosa para
la estimación de la invasión fúngica en alimentos tales como el maíz y la soja (Donald y
Mirocha, 1977), trigo (Nandi, 1978) y la cebada (Whipps y Lewis, 1980). Se ha prestado
especial atención a la posibilidad de desarrollar el ensayo de quitina como un reemplazo
para el recuento de hongos (B, Jarvis, 1977; Bishop et al, 1982; Cousin et al., 1984).
El ensayo de la quitina tiene algunas deficiencias y ha sido duramente criticado por

algunos autores (por ejemplo, Sharma et al., 1977). La relación entre el peso seco y
contenido de quitina varía al menos el doble en diferentes hongos que deterioran los
alimentos (Cousin et al, 1984; Lin / Cousin, 1985). Algunos alimentos contienen azúcares
naturales amino tales como glucosamina y galactosamina, que deben ser eliminados por
extracción con acetona (Cousin et al., 1984) y el contenido de quitina no aumenta
proporcionalmente con el crecimiento de hongos (Sharma et al., 1977). La contaminación
de insectos de muestras de grano (Sharma et al., 1997), la presencia de moscas de la fruta
en los productos a base de tomate (Lin / Cousin, 1985). Materiales tales como granos
almacenados con frecuencia contienen fragmentos de insectos y necesitan ser revisado
antes de hacer los ensayos de quitina. Debido a estas dificultades, el uso de quitina como
un ensayo químico para los hongos en los alimentos en gran medida ha sido reemplazado
por el ensayo de ergosterol.
3.2 El ergosterol
El ergosterol es el principal esterol producido por los hongos (Weete, 1974). El ergosterol
se produce como un componente de las membranas celulares de los hongos, por lo que se
correlaciona con el crecimiento de las hifas y la biomasa. Es por lo tanto un buen
candidato como un producto químico para medir el crecimiento de hongos en los
alimentos y materias primas. La metodología para la estimación de ergosterol en los
cereales ha sido desarrollado por Seitz et al, (1977; 1979). Las muestras se mezclan con
metanol, se saponifica con álcali fuerte, se extraé con éter de petróleo, y se fraccioná por
cromatografía líquida de alta presión. El ergosterol se detecta por absorción ultravioleta,

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óptimamente a 282 nm, con una longitud de onda a la que otros esteroles exhiben poca o
ninguna absorbancia.
El ensayo de ergosterol puede ser ampliamente útil para cuantificar el crecimiento de

hongos. Se han hecho varios intentos de evaluar la relación entre el crecimiento de
hongos y la producción de ergosterol, utilizando sustratos tanto líquidos como sólidos.
Taniwaki (1995) ha demostrado que los hongos que crecen en atmósferas con bajo
contenido de O2 y con niveles elevados de CO2, el contenido de ergosterol de las hifas se
reduce significativamente. En atmósferas que contienen 60% de CO2, el contenido de
ergosterol por unidad de longitud hifal fue hasta seis veces menor. El medio de
crecimiento también afectó a las concentraciones de ergosterol: siete especies fúngicas
encontradas en alimentos fueron cultivados en PDA y producen más de dos veces la
cantidad de ergosterol por unidad de longitud de las hifas que cuando se cultivan en CYA
(Taniwaki, 1995).
La cuantificación de la producción de ergosterol en los alimentos ha demostrado ser más

difícil. Seitz et al. (1977) mostró una buena correlación entre el daño en los granos de
arroz y su contenido de ergosterol, entre ergosterol en el trigo y precipitaciones durante la
estación de crecimiento, y entre el contenido de ergosterol y la invasión de hongos en
varios híbridos de sorgo. Matcham et al. (1985) reportaron una buena correlación entre la
extensión lineal de Agaricus bisporus cuando se cultiva en granos de arroz y la cantidad
de quitina, ergosterol y la producción de lacasa. El contenido de ergosterol se correlaciona
con recuentos de colonias de hongos en los granos de trigo en 0,95 a w pero no a 0,85 aw
(Tohill et al., 1992).
Después de un amplio estudio de los niveles de ergosterol en cultivos daneses, Hansen y

Pedersen (1991) concluyeron que los niveles normales de ergosterol en la cebada fueron
7,6 ± 2,8, en el trigo para la panificación 5,0 ± 1., centeno para panificación 6,8 ± 2,2,

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guisantes 2,2 ± 2,7 y canola 2,4 ± 1,3 µg/g de peso seco, respectivamente. Ocratoxina A
en la cebada correlaciona bien con el contenido ergosterol y alcanzó niveles significativos
cuando ergosterol aumentó a 25 µg/g en peso seco. Sin embargo, la aflatoxina B1 fue
detectable en la harina de semilla de algodón cuando el ergosterol alcanzó sólo el 4 µg/g.
La canola"quemada" se hizo significativa cuando el ergosterol alcanzó 1,4 µg/g de peso
seco.
Se informó que el ensayo de ergosterol para tener una alta sensibilidad y, en contraste
con el ensayo de quitina, requiere sólo una hora (Seitz et al., 1979). A pesar de sus
limitaciones, parece ser el indicador más útil de la invasión fúngica de los alimentos y
podría ser una técnica de rutina para el control de la calidad.
3.3 Impedimétrica y conductividad
Metabolitos producidos por crecimiento de microorganismos en medios líquidos alteran la

impedancia y conductancia del medio. Los cambios en estas propiedades como una
medida del crecimiento bacteriano fue sugerido por Hadley y Senyk (1.975), y se aplicó
primero a las levaduras por Evans (1982) y a los mohos por Jarvis et al. (1983). La mayor
parte del trabajo posterior sobre los hongos se ha llevado a cabo con levaduras, pero la
metodología es a menudo aplicable a mohos.
Un problema importante con estas técnicas implica la selección de los medios de cultivo
adecuados, que incluirá cambios detectables y reproducibles, ya sea en la conductancia o
capacitancia durante el crecimiento de hongos. El éxito temprano en las mediciones de
impedancia se informó con glucosa y extracto de malta (Shapton y Cooper, 1984) y sulfato
de amonio en un medio base de carbono (Zindulis, 1984). Williams y Wood (1986) usaron
el extracto de malta (2%) glucosa (2%) como un medio para esta técnica e informaron que
la mayoría de las 32 especies fúngicas ensayadas puede ser detectado por este método.
Sin embargo, en otras publicaciones se informó que los medios convencionales, tales
como agar de extracto de malta son de poco valor (Schaertel et al., 1987).

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Watson-Craik et al. (1989) estudiaron 27 especies de moho en una amplia gama de

medios disponibles en el mercado y especialmente preparados y concluyó que la
conductancia y la capacitancia eran medio y especie específico. Un medio que contiene
peptona de soja (0,5%) y extracto de levadura (0,5%) fue el más eficaz. Sin embargo, la
adición de zumo de fruta produjo una reversión de la señal que superada en parte por la
adición de glucosa y (NH4) 2SO4. La adición de KH 2PO4 para aumentar la capacidad de
tamponamiento produjo un rendimiento mejor (Watson-Craik et al., 1990). A medida que
el pH óptimo es de aproximadamente 6,0, la adición de antibióticos era necesaria para
evitar el crecimiento bacteriano.
Para reducir la influencia de la variabilidad del producto en los medios de cultivo utilizados
en las estimaciones de conductancia, Owens et al. (1992) se recomienda el uso de medios
con iones de amonio, glucosa, extracto de levadura y peptona. La alta concentración de
amonio induce cambios de conductancia alta, mientras que los otros ingredientes reducen
al mínimo los efectos de alta concentración de carbohidratos y bajos niveles de nitrógeno
orgánico en los alimentos.
El método impedimétrico para la detección de hongos resistentes al calor en los zumos de

frutas se ha descrito recientemente. Nielsen (1992) informó que la adición de extracto de
levadura (0,75%), dihidrógeno fosfato de potasio (0,60%) y sulfato de amonio (0,1%) a los
zumos de frutas mejoró notablemente la calidad de la curva, dando como resultado una
detección más temprana y más reproducible. El límite de detección en los jugos
contaminados artificialmente fue una ascospora de Neosartorya por mililitro, detectable
en 100 horas.
En resumen, el método impedimétrico y la conductividad parecen ser métodos rápidos

eficaces cuando se usan en condiciones bien definidas para un fin específico con un tipo
en particular de alimentos. Ellos no se pueden aplicar en una escala más amplia.

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3.4. Trifosfato de adenosina (ATP)
La técnica del ATP también se ha sugerido para medir la biomasa microbiana porque las
técnicas de bioluminiscencia proporcionan ensayos muy sensibles (Jarvies et al., 1983).
Siempre que los niveles de ATP en la planta u otras células sean muy bajos, o que los
microorganismos se pueden separar de manera efectiva a partir otros materiales, el
método tiene cierto potencial como un ensayo microbiano. Una buena correlación se
muestra entre la producción de ATP y recuentos viables de seis especies de levaduras
psicotrópicas crecidas en cultivo puro (Patel y Williams, 1985). También se ha informado
La detección eficaz de los bajos niveles de levaduras en las bebidas carbonatadas.
(LaRocco et al., 1985). Sin embargo, las células vegetales vivas contienen altos niveles de
ATP y los hongos son a menudo muy difíciles de separar de los materiales alimenticios. Por
otra parte la extracción de moléculas a partir de células fúngicas es notoriamente difícil,
por lo que este potencial puede ser difícil de realizar en la micología en alimentos.
3.5 Pectinesterasa
Offem y Dart (1983) informaron de un método rápido para la detección del deterioro de
los alimentos por esporas viables de hongos. La cromatografía líquida de gas se utilizó
para determinar la cantidad de metanol liberado de la pectina por la enzima fúngica
pectinesterasa. Se informaron los estudios preliminares sobre suspensiones de esporas
puras y mixtas de especies de Aspergillus y Penicillium. Aplicaciones prácticas de esta
técnica todavía se siguen desarrollado.
3.6 Volatilidad en hongos.
Los métodos descritos, se han ocupado de detectar el crecimiento de hongos o su

reproducción. Los métodos que se van a describir han tomado un enfoque opuesto, el de
medir los efectos de los hongos en los alimentos, en lugar de los hongos per sé. El
deterioro de los granos almacenados dá una combinación de cambios químicos y

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biológicos, debido al crecimiento de los hongos. El deterioro se caracteriza por el

desarrollo de mal olor, la pérdida de de la capacidad para la germinación, el
apelmazamiento, la rancidez y, a veces el desarrollo de micotoxinas (Abramson et al.,
1980, 1983). Los hongos producen sustancias químicas volátiles durante el crecimiento y
estos productos químicos particulares pueden estar asociados con el deterioro del grano
(Kaminski et al., 1972, 1974, 1975). El crecimiento de hongos en granos almacenados fue
estudiado por RN Sinha y col., (1988), quien supervisó la producción de 3-metil-1-butanol,
1-octen-3-ol y 3-octano. La presencia de estos compuestos volátiles generalmente
correlacionaba con la infección de semillas por Alternaria alternata, Eurotium repens,
Aspergillus versicolor y varias especies de Penicillium. Octenol y octanona, en particular,
parecen estar asociadas con un deterioro en el grano debido al crecimiento de hongos.
Adamek et al. (1.992) determinaron que el metilfurano, 2-metilpropanol y 3-metilbutanol
fueron los metabolitos más importantes de E. amstelodami, A. flavus, P.cyclopium y
Fusarium culmorum que crecen en el trigo. También se estudiaron los compuestos
volátiles producidos por varias especies de Penicillium. El uso de la producción de
compuesto volátiles como indicador del deterioro de moho en granos ha sido revisado por
Kaminski y Wasowicz (1991).
Para aclarar el papel preciso de estos compuestos y para permitir la detección de especies
de hongos específica, Borjesson et al. (1989) recoge las sustancias volátiles producidas por
varios hongos de putrefacción de alimentos cultivados en cultivo puro en el grano de trigo.
Los volátiles se recogieron en un adsorbente químico y se analizaron por cromatografía de
gases. Algunos compuestos, especialmente 3-metil-1-butanol, se produjeron temprano en
el crecimiento de hongos y podrían ser utilizados como una alerta temprana del deterioro
potencial, antes de que el crecimiento de hongos se hizo visible. La producción de
metabolitos volátiles por especies de Penicillium en el grano se correlacionó bien con la
producción de dióxido de carbono y la formación de ergosterol (Borjesson et al., 1990,
1992).

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PREGUNTAS:
4. TÉCNICAS INMUNOLÓGICAS.
Proteínas de la pared celular de los hongos producen antígenos, que pueden ser
detectados por métodos inmunológicos. Algunos antígenos se derivan de componentes
comunes de una amplia gama de hongos, y por lo tanto son indicativos de crecimiento de
los hongos en general, mientras que otros son género o incluso especies específicas. Una
variedad de métodos han sido desarrollados para tomar ventaja de estos antígenos
fúngicos.

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4.1 Inmunoensayo enzimático (ELISA). La preparación de antígenos a partir de tres

hongos comunes transmitidas por los alimentos (Penicilium aurantiogriseum, Mucor
racemosus y Fusarium oxysporum) fue descrito por Notermans y Heuvelman (1985). La
preparación de anticuerpos de inmunoglobulina contra estos antígenos fue seguida por el
desarrollo de un ensayo ELISA. Se detectaron hongos en alimentos sin procesos térmicos y
en alimentos con procesos térmicos. Los antígenos fueron género específicos.
Posteriormente se demostró que el antígeno de Penicillium reaccionó con 43 de 45

especies de Penicillium, que la producción de antígeno correlacionó con el peso micelial y
no se vio afectada por las condiciones de cultivo, los medios, la temperatura y la Aw
(Notermans et al., 1986). El antígeno de Penicillium también reaccionó con Aspergillus
flavus y el nivel de antígeno correlacionó con la producción de aflatoxina (Notermans et
al., 1986).
Las técnicas de ELISA también se han estudiado como un reemplazo potencial para el
recuento de mohos. Antígenos de mohos aislados del tomate (Alternaria alternata,
Geotrichum candidum y Rhizopus stolonifer) se utilizó para producir un ensayo ELISA
sensible a mohos en tomate. Se observó una correlación entre la formación de antígeno y
el moho añadido al puré de tomate, mientras que la interferencia de fondo fue muy baja
(Lin et al., 1986). El método fue probado contra una gama más amplia de alimentos, con
resultados alentadores (Lin / Cousin, 1987), Robertson y Patel (1989) mejoró la
sensibilidad del método de la pasta de tomate mediante el uso de un anticuerpo policlonal
contra Botrytis cinerea, Mucor piriforme y Fusarium solani además de las tres especies
utilizadas por Lin et al. (1986).
Pruebas de ELISA para Botrytis y Monascus en los alimentos (Cousin et al., 1990), y para la
detección en el arroz de Penicillium islandicum (Dewey et al., 1990) y Humicola lanuginosa
(Dewey et al., 1992 también se han descrito.

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4.2 Aglutinación de látex. Un enfoque diferente para la detección inmunológica de los

hongos en los alimentos ha sido el revestimiento de perlas de látex con anticuerpos y la
detección de aglutinación de las perlas en la presencia de antígenos (Kamphuis et al.,
1989; Notermans y Kamphuis, 1992; Stynen et al., 1.992). Se encontró que las perlas de
látex de 0,8 µm recubiertas con anticuerpos a partir del polisacárido extracelular
producido por Penicillium digitatum detectan específicamente las especies Aspergillus y
Penicillium (Kamphuis et al., 1989). Los límites de detección fueron tan bajo como 5 a 10
ng/ml del antígeno purificado. La prueba de aglutinación de látex producida
comercialmente tiene valor para la detección de la calidad micológica de granos y
alimentos procesados (Braendlin y Cox, 1992; Van der Horst et al, 1992), aunque un kit de
no produjo buenos resultados en la detección de moho en productos de tomate (van der
Horst et al., 1992).
Schwabe et al. (1992) comparó el ensayo de aglutinación de látex con la producción de

ergosterol para la detección de especies de Penicillium, Aspergillus y Fusarium en cultivo
puro. Llegaron a la conclusión que los dos métodos fueron comparables para Penicillium y
Aspergillus, pero que el método de ergosterol era más sensible para Fusarium. En
muestras de alimentos, tanto en la prueba de aglutinación en látex y ergosterol eran
medios eficaces para detectar el crecimiento de moho, pero no existía ninguna correlación
clara en los valores obtenidos por los dos métodos.
4.3 Técnicas de anticuerpos fluorescentes. Técnicas de anticuerpos fluorescentes también

se han utilizado directamente para la detección de moho en los alimentos. Warnock
(1971) detecta Penicillium aurantiogriseum en la cebada.
4.4 Los métodos moleculares. Las técnicas inmunológicas se basan en el desarrollo de

anticuerpos contra antígenos específicos en las moléculas expresadas por ARN y ADN
genómico. Durante las últimas décadas se han utilizado técnicas para la detección de
secuencias de ADN utilizando sondas específicas. (Southern, 1975). Con el desarrollo de la
clonación de genes y la síntesis de oligonucleótidos, ahora se pueden preparar en grandes

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cantidades secuencias de ADN para su uso en sondas. Dependiendo de su papel en el

genoma, el ADN puede ser específico en casi cualquier nivel taxonómico. En teoría, la
producción de una sonda de ADN específica es ahora es posible para cualquier organismo
(Walker y Dougan, 1989). En la práctica, el genoma de sólo unos pocos organismo es lo
suficientemente conocida para que esto sea cierto, pero la situación está cambiando
rápidamente.
Hasta la fecha, las sondas relevantes para Micología de alimentos se han limitado al
reconocimiento de especies después del aislamiento y el crecimiento en cultivo puro. Una
sonda está diseñada para distinguir entre los Z. bailii estrechamente relacionada con
Zygosaccharomyces rouxii, y Saccharomyces cerevisiae (Pearson y McKee, 1992), y una
segunda Fusarium moniliforme para diferenciar a partir de dos especies estrechamente
relacionadas (Lodolo, et al., 1992.
4.5 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). PCR es una técnica relativamente nueva
que promete acelerar el uso de técnicas moleculares en todo tipo de sistemas biológicos.
PREGUNTAS:

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5. LEVADURAS

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Tabla 3. Deterioro de los alimentos por las levaduras.
Tabla 4. Medios y condiciones para identificar levaduras que deterioran los alimentos

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Medioa Propósito
Czapek agar Evaluación de capacidad de utilizar nitrato como única fuente de
nitrógeno
Agar Extracto Malta morfología de la colonia
(MEA)
Agar Acetico de Malta La evaluación de la resistencia con conservantes
(MAA)
MEA a 37°C Evaluación del grado de crecimiento a temperaturas elevadas
Agar Levadura de Evaluación del grado de crecimiento en reducción de la
Malta 50% Glucosa actividad de agua en la presencia de niveles altos de
(MY50G) carbohidratos
Agar Levadura de Evaluación del grado de crecimiento a la reducción de actividad
Malta 10-12(MY10- de agua en presencia de NaCl
12)
aLa incubación es a 25°C salvo especificación. La inspección debe ser a los 3 y 7 días
después de la incubación.
Tabla 5. Propiedades mas destacadas de las levadurasa

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Especie Long. Diám. Color de Crece en

de de la colonia Cz 37º C MA MY50 MY10-
células colonia MEA MEA A G 12
MEA MEA
µm mm
B. bruxellensis 4-5-7 1.5-2 Blanco 0 + 0 W 0
C. krusei 3-2.5 5-8 Blanco W + + 0 0
C. parapsilosis 3-20 3-4 Blanco W + V + +
D. hansenii 2.5-4 2.5-4 Blanco W 0 0 W +
K. apiculata 3.5-6 2-4 Blanco +/- 0 0 0 0
P.membranae 4-6 3-4 Blanco W Vw + 0 0
R. 4.5-5 5-10 Roja +/- 0 0 0 0
mucilaginosa
S. cervisiae 5-12 2.5-4 Blanco W + W 0 0
Sch. Pombe 5-7 1-2 Blanco W + + W 0
T. holmii 4-5 1-2 Blanco 0 0 0 0 0
Z. bailii 5-8 2-3 Blanco 0 0 + + 0
Z. bisporus 3.5-7 2-3 Blanco 0 0 0 + 0
Z. rouxii 5-7 2-3 Blanco 0 0 0 + +
a.0, no hay crecimiento; w: débil; vw: muy débil; +1 mm diámetro o más en 7 días.
PREGUNTAS:

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PRÁCTICAS
MICOLOGÍA DE ALIMENTOS
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MATERIALES QUE DEBEN TRAER Y TENER DISPONIBLES EN EL MOMENTO QUE SE

NECESITEN
1. Bata de laboratorio.
2. Mascarillas, para personas que sean alérgicas a los hongos
3. Cuaderno de campo
MEDIDAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICOLOGÍA
1. No comer, beber o fumar en los mesones de laboratorio.

2. Usar siempre bata de laboratorio.
3. Use guantes cuando debe manipular material infeccioso.
4. Subcultivos de microorganismos patógenos deben hacerse en cabina de seguridad
5. Cada vez que se derrame material, cubra la mesa con toallas de papel, impregne esta zona
con sustancias bactericidas como jabones soluciones cloradas (hipoclorito de sodio al
10%)
6. No pipetear con la boca material contaminado. Obture las aberturas superiores de las
pipetas con algodón antes de esterilizarlas.
7. Pipetas usadas deben sumergirse inmediatamente en desinfectantes y esterilizar en
autoclave.
8. El material contaminado debe ser colocado en recipientes adecuados y deben ser
esterilizados en autoclave.
9. Nunca humedezca etiquetas con la lengua
10. Antes y después de cada sección de trabajo limpie los mesones con sustancias
desinfectantes.
11. No olvide el lavado continúo de las manos con jabones desinfectantes.
12. De cuenta inmediatamente al instructor de cualquier accidente, tales como Cortaduras,
quemaduras o derrames de cultivos. Tome las precauciones posibles para evitar
accidentes.

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13. Las agujas de transferencia y las asas bacteriológicas deben ser esterilizadas a la llama,
poniendo al rojo todo el alambre, antes y después de su uso. Cuando tenga residuos de
crecimiento microbiales es necesario calentarlas inicialmente en el cono frío de la llama
para evitar aerosoles.
14. No lleve materiales muy contaminados al laboratorio y elimine lo más pronto posible los
cultivos que lo estén.
15. Cuando se saca parte de un producto de un recipiente y sobra algo, deséchelo luego de su
uso.
16. Todos los reactivos y equipos deben dejarse organizados y en sus sitios respectivos al final
de cada práctica.
EXIGENCIAS:
1. Antes de entrar a trabajar al laboratorio, léase el texto de las prácticas que va a realizar y
haga el plan de trabajo con todo cuidado.
2. Cada práctica de laboratorio debe iniciarse con una corta explicación. No empiece a
trabajar hasta que haya recibido las instrucciones.
3. Pregunte cuando no entienda. La buena técnica de laboratorio depende de que usted
sepa lo que va a hacer.
4. Anote cuidadosamente todas las observaciones en el momento de hacerlas. El examen de
prácticas se referirá no solo a las información proporcionada en el manual, sino también a
sus propias observaciones y deducciones.
5. Los datos de laboratorio deben estar disponibles en cualquier momento, después de
realizada cada práctica.
LABORATORIO 1
MEDIOS DE CULTIVO: (TEORÍA)

Son sustancias naturales o artificiales que los microorganismos pueden utilizar como
nutrientes.
1. TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO

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Hay tres tipos principales de medios de cultivo: Naturales, sintéticos y vivos. Varían en su
forma y composición dependiendo de las especies de microorganismos que se vayan a
cultivar y los propósitos del cultivo.
1.1. Medios de cultivos naturales:

Son los medios empleados tal y como se encuentran en la naturaleza para el cultivo de los
microorganismos, como la leche, sangre diluida, jugos vegetales, etc.
1.2. Medios de cultivos sintéticos:

Tienen una composición definida. Ejemplo de éstos son los medios deshidratados que se
consiguen en el comercio en forma de polvos o granulados; son los más usados hoy en día
en los laboratorios. Son los medios recomendados para trabajos de investigación en los
cuales se deben reproducir los resultados en otros laboratorios.
1.3. Medios vivos:

Son aquellos que contienen células u organismos vivos: Células de riñón de mono, huevos
embrionados, etc.
2. CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO:

2.1 Medios de cultivo simples:
Tienen los requerimientos de cultivos mínimos y son utilizados para hongos que son poco
exigentes.
2.2. Medios enriquecidos:
Contienen elementos altamente nutritivos a veces en forma natural como sangre,suero,
huevo, etc o enriquecidos con sustancias químicas.
2.3. Medios diferenciales:
Son utilizados cuando se desea poner de manifiesto una propiedad especial de un hongo.
2.4 Medios selectivos:
Se utiliza cuando se desea suprimir el crecimiento de unos microorganismos y favorecer el
desarrollo de otros.
2. PROPIEDADES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO:

Los medios de cultivo pueden ser líquidos, semisólidos ó sólidos. Estos medios se obtienen
mediante adicción de sustancias químicas según el caso. Deben tener las siguientes
propiedades:

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2.1. Humedad: Es necesaria para el crecimiento microbiano, para evitar la desecación que
mata a la mayor parte de microorganismos.
2.2 Fertilidad
2.3 pH. Los microorganismos tienen un pH óptimo, el cual se les debe procurar en los
medios de cultivo.
2.4 Transparencia: Es calidad primordial para observar el crecimiento microbiano.
MEDIOS DE CULTIVO (PRÁCTICA)
I.- PREPARACIÓN Y ENVASE DE MEDIOS DE CULTIVO:

Los medios de cultivo deben poseer todos los elementos necesarios para permitir la
multiplicación de los microorganismos. Pueden ser:
Líquidos: Semejantes a un caldo casero, filtrado y/o esterilizado, se envasan en tubos,
frascos o matraz.
Sólidos: A un medio líquido se le puede agregar una sustancia gelificante como el agar, de
modo que el medio se convierte en sólido, con una consistencia como de gelatina. Por
calentamiento se funde y se puede verter en diversos recipientes como tubos, frascos, y
cajas de Petri.
OBJETIVOS:
1.- Diferenciar los medios de cultivo utilizados en el laboratorio de micología de
alimentos.
2.- Utilizar las técnicas necesarias para la buena preparación y conservación de un medio
de cultivo.
MATERIALES
2 Erlenmeyer de 1000 ml
1 Probeta de 500 ml
1 Espátula
1 Plancha de calentamiento
1 Balanza
Marcador o lápiz vidriograft
Papel aluminio
Esparadrapo

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1 Encendedor
1 Guantes de cocina
50 Cajas de Petri estériles
Papel kraft
Agua destilada
Agar Dicloran Rosa de Bengala Cloranfenicol
D + glucosa
Peptona
Agar
Penicilina 800000 U.
Gentamicina 80 mg
Micropipeta de 1100 -1000µL
PROCEDIMIENTOS:
1. Preparar 500 ml de agar DRBC*
2. Preparar 200 ml de agar Saboraud **
* El agar DRBC se prepara según la indicación de la casa comercial.
** Agar Saboraud:
20 g de D+ glucosa
20 g de Agar bacteriológico ó agar agar
10 g de peptona bacteriológica
1000 mL de agua destilada
Preparación de los medios de cultivo sólidos:

1. Pesar en erlenmeyer o pesasales la cantidad de medio de cultivo que va a necesitar.
2. Agregar el agua destilada y dejar en reposo 5 minutos
3. Al cabo de este tiempo se hierve esta solución teniendo cuidado que no se vaya a
derramar.
4. Dejar reposar un poco, taponar con algodón y sellar con papel aluminio o papel kraft.
5. Colocar el erlenmeyer dentro del autoclave y esterilizar a 121° centígrados y 15 psi.

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6. Una vez esterilizados se dejan enfriar hasta una temperatura aproximada de 56°C y se le
añaden los dos antibióticos a una concentración de 0,2% c/u . Los medios se envasan en
las cajas de Petri, siguiendo las indicaciones del instructor. Estos procedimientos se
trabajan en un ambiente estéril.
PREGUNTAS:
1. Que clase de microorganismos crece en agar Saboraud? Porqué?
2. Qué medios de cultivo se utilizan en Colombia para la búsqueda de hongos en alimentos.

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Tabla 3 . Medios recomendados para la detención, enumeración y el aislamiento de

hongos.
Tipo de comida Seleccionado para Medio Observaciones
Alimentos frescos: Moho DRCB Mezclar (Cuando

Leche y productos Levaduras TGY, MEA, sea necesario) y
lacteos fruta, queso y OGY diluir en placas
comida de mar General DRBC
Granos recientemente General DRCB Plaqueo directo
cosechados, nueces
Dematiaceae DRCB, CZID Plaqueo directo
Hifomicetos
Fusarium CZID Plaqueo directo
Levaduras TGY, MEA, Dilución en placas
OGY

Jugos de frutas, frescos Levaduras TGY, MEA, Dilución en placas
OGY

Jugos de frutas, Levaduras resistentes TGYA, Dilución en placas
preservadas a los conservantes Agar malta
ácido acético

Jugos de frutas que son Moho resistente al PDA, MEA Protocolos
pausteurizados o calor especiales
productos
pausteurizados
Concentrados de jugos Levaduras xerofílicas MY50G Diluentes
de fruta especiales
Alimentos secos en General DG18 Plaqueo directo
general

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Cereales almacenados, General DG18 Plaqueo directo

nueces
Dematiaceae DRCB, CZID Plaqueo directo
Hifomicetos
Fusarium CZID Plaqueo directo

Grano para moler para General DG18 mezclar y diluir en
hacer harina placa

Fruta seca, confiteria, Moho y levaduras MY50G Plaqueo directo
chocolate, etc xerofílicas
Xerófilos fastidiosos MY50G Plaqueo directo
En presencia de MY70GF Plaqueo directo
Eurotium spp
Alimentos salados, General DG18 Plaqueo directo o
Pescado de mar presionar la placa
Xerófilos halófilos MY 5-12 / MY Plaqueo directo o
10-12 presionar la placa
General Hongos productores AFPA Plaqueo directo o
de aflatoxinas presionar la placa

General Hongos productores DRYS Plaqueo directo o
de ochratoxinas presionar la placa
Escriba las principales características de los medios de cultivo utilizados para el

aislamiento de hongos en alimentos.
Tabla 4. Medios de cultivo generales y específicos para el recuento de hongos en

alimentos:

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MEDIO DE INGREDIENTES PH USOS

CULTIVO
DRBC
Nombre:
DG18
Nombre:
MEA
Nombre:
TGY
Nombre:
OGY
Nombre:
TGYA

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Nombre:
CZID
Nombre:
PDA
Nombre:
MY50G
Nombre:
MY70GF
Nombre:
MY5-12
Nombre:

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MY10-12
Nombre:
AFPA
Nombre:
DRYS
Nombre:
ALF reactivo.
Nombre:
LABORATORIO 2. MICROORGANISMOS DEL AMBIENTE Y SUPERFICIES
La presencia de microorganismos en cualquier ambiente es de especial significado para los

trabajos realizados en micología. El conocimiento de este hecho debe tenerse en cuenta

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con el propósito de mantener libre de microorganismos los materiales hasta su utilización.

El aire carece de una microbiota propia, ya que todos sus gérmenes se encuentran allí
accidentalmente y en forma general se hallan sobre partículas sólidas en suspensión o en
pequeñas gotas de agua. Los microorganismos llegan al aire por medio del polvo, tierra
seca, salpicaduras de la corriente de agua, gotitas expulsadas al toser, estornudar o
hablar, hongos que crecen en las paredes, techos, suelos, alimentos, etc. Los
microorganismos presentes en el aire como no alcanzan a desarrollarse sólo se mantienen
ahí, persisten por lo tanto, las estructuras más resistentes a la desecación como las
conidias y esporas de hongos, también se pueden encontrar levaduras. El número de
microorganismos está dado por factores como: Movimiento del aire, luz solar, humedad,
situación geográfica, cantidad de agua y polvo suspendidos.
OBJETIVOS:
1. Observar el grado de contaminación de un área determinada.
2. Aislar, cuantificar y tratar de identificar los microorganismos que habitualmente se
encuentran en el área de trabajo.
PROCEDIMIENTO:
1. Diríjase al sitio que le corresponde analizar.
2. Destape 1 caja con agar Saboraud y 1 caja con DRBC
3. Déjela expuesta al aire durante 20 minutos.
4. Tape la caja y séllela con cinta de enmascarar
5. Déjela incubando a temperatura ambiente.
6. Observe diariamente el
7. crecimiento de los hongos.
8. Describa en el cuaderno sus observaciones.
9. Se harán observaciones macro y microscópicas de estos hongos
10. Deje una caja de cada medio sin abrir (Como testigos de esterilidad)

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PREGUNTAS:
1. Que sitios creen ustedes que deben permanecer libres de contaminación y cómo han sido
tratados para obtener completa esterilidad.
2. Qué otras técnicas se utilizan para el análisis microbiológico del aire.
MICROORGANISMOS DE SUPERFICIES:
Son aquellos microorganismos que encontramos sobre las paredes, las mesas de trabajo,
los lavamanos, las manos, etc.
MATERIALES Y MÉTODOS:
1. Cuadricula de cartulina que tenga en el centro un agujero en forma cuadrado de 10 cms x
10 cms.
1. 4 Tubos de ensayo con 9ml de solución salina
3. 2 Pipetas estériles de 1ml
4. 2 Pipetas estériles de 5 ml
5. 2 asas de vidrio estéril
6. 5 Cajas de Petri con agar Saboraud o DRBC
7. Aplicadores de algodón estériles
PROCEDIMIENTO:
Se realizará de la siguiente forma:
1. Escoja la superficie que va a analizar (preferiblemente un lugar que no se vea en buenas
condiciones de higiene).
2. Coloque la cuadricula en el lugar indicado, sosténgala y con el aplicador de algodón
húmedo recorra de un lado a otro la superficie que va a estudiar.
3. El aplicador con la muestra se introduce en un tubo de ensayo con solución salina estéril,
se parte el aplicador y se tapa el tubo. (Dilución 1:10)
4. Se agita fuertemente el tubo Se extrae 1 ml de esta solución con una pipeta estéril y se
deposita en una caja de agar Sabouraud io DRBC (Dilución 1:10),

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5. Se extrae 0.1 ml de esta solución y se deposita en una caja de agar Sabouraud. Se debe
distribuir bien la muestra en el medio de cultivo, utilizando para ello asas estériles.
(Dilución 1:100)
6. Se extrae 0.1 ml de la dilución 1:10 y se agrega a un nuevo tubo con 9.9 ml de solución
salina (Dilución 1:1000).
7. se dejan incubando a temperatura ambiente, se observan diariamente para detallar el
crecimiento de hongos.
8. Escribir los resultados de los recuentos en su cuaderno de campo.
RESULTADOS:
Se informa como UFC/10 centímetros cuadrados de superficie
PREGUNTAS:
LABORATORIO 3. CARACTERÍSTICAS DE LAS COLONIAS DE HONGOS
Después de practicada una siembra y dadas las condiciones re queridas de nutrientes,

temperatura, tiempo de incubación, presencia o ausencia de Oxígeno, según el tipo de
hongo se observará la apariencia macroscópica de hongos en poblaciones, originadas a
partir de una célula y que denominamos colonias.
En los medios de cultivo sólidos las colonias se desarrollan sobre la superficie del medio
presentando una morfología con características comunes y particulares según los grupos
microbianos y que constituyen uno de los primeros pasos en la identificación de éstos.
Estas características pueden presentar variaciones de pendiendo de la composición
química del medio empleado como también de las condiciones ambientales.
Con fines didácticos se ha escogido los siguientes criterios que se deben tener en cuenta
para la descripción de las colonias:

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Características de las colonias de hongos:
I. TEXTURA: (Se observa en el anverso de la caja de Petri)

1. Algodonosa
2. Afelpada
3. Granular
4. Polvosa
5. Pastosa
6. Algodonosa-granular
II. TOPOGRAFÍA: (Se observa por el reverso de la caja de Petri)

1. Lisa
2. Radiada o Rugosa
3. Verrucosa
III. CONSISTENCIA: (levaduras)

1. Cremosa
2. Mucosa
3. Dura- Pastosa
IV COLOR:
1. Amarillo
2. Verde
3. Azul

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LABORATORIO 4. COLORACIÓN DE HONGOS

OBJETIVOS:
1. Identificar las diferentes estructuras somáticas y reproductivas que poseen los hongos y
que son útiles para su identificación.
2. Utilizar las diferentes técnicas de montaje y coloración de hongos.
MATERIALES:
Portaobjetos y cubreobjetos
Encendedor
Marcador para vidrio
Tapabocas (personas alérgicas)
Cinta transparente adhesiva
Asas en punta dobladas
Papel toalla
Mechero Bunsen
Azul de lactofenol (ALF)
Cajas de Petri con hongos aislados del medio ambiente y superficies.
PROCEDIMIENTO:
Colonias de hongos:
Existen dos técnicas de montaje:
1. La técnica de las dos agujas:

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a) Colocar una gota de azul de lactofenol (ALF) en el centro de un portaobjetos
b) Tomar con un asa curva una porción de colonia de hongos y colocarlo encima de la gota
de azul de lactofenol.
c) Con ayuda de una aguja recta estéril disociar el micelio con el objeto de hacer más
delgada la preparación que permita una mejor visualización de las estructuras del hongo.
d) Observar al microscopio primero con objetivo de 10x y posteriormente con objetivo de

40x.
2. La técnica de la cinta adhesiva transparente:

a) Colocar una gota de ALF en el centro de un portaobjetos
b) Tomar un pequeño fragmento de cinta transparente entre los dedos pulgar e índice,
con el lado adhesivo hacia afuera.
c) El lado adhesivo se presiona sobre la superficie de la colonia de moho
d) Colocar la cinta con el lado adhesivo hacia abajo y pegarla sobre el portaobjeto con el
ALF.
e) Observar al microscopio con objetivos de 10x y 40x.
RESULTADOS:
La observación microscópica de los hongos permite su identificación. Ud. debe tener en
cuenta:
a) Tipo de hifa: septada – no septada; pigmentada o hialina.
b) Forma, tamaño y ornamentaciones del conidioforo

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c) Tipo de conidias (microconidias, macroconidias, artroconidias, clamidoconidias,

esporangiosporas, blastoconidias, poroconidias aleuroconidias).
PREGUNTAS:
1. Qué estructuras de hongos observa
2. Son hongos hialinos o pigmentados
3. Qué géneros de hongos encontró en el medio ambiente

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LABORATORIO 5. ANALISIS DE ALIMENTOS
PREPARACIÓN Y DILUCIÓN DE LAS MUESTRAS DE ALIMENTOS:

INTRODUCCIÓN
Varios factores afectan los resultados obtenidos en un recuento microbiano, tales como
temperatura de incubación, método empleado, tipo de alimento, pero definitivamente lo
que asegura buenos resultados, es el cuidado que se tenga para obtener y preparar una
buena muestra que servirá como inoculo preciso y fiel reflejo del numero de
microorganismos presentes. Existen varios métodos para lograr este objetivo, pero nos
centraremos en el recomendado por el International Standar Organization (ISO). El
diluyente utilizado es el agua peptonada o tamponada con una solución amortiguadora de
fosfatos.
OBJETIVOS:
1. Utilizar las técnicas adecuadas de preparación de las muestras para análisis microbiano.
2. Adquirir destreza en Ia preparación de las diferentes diluciones de las muestras que se
van a analizar.
3. Establecer que número de diluciones necesitan las diferentes muestras a analizar.
METODOLOGIA :
La cantidad de alimentos empleada puede variar dependiendo del tipo de hongos que se
busca; lo importante es conseguir una dilución inicial de 10 -1. En nuestro caso
emplearemos 10 gramos de alimento y 90 ml del diluyente.
La homogeneización de la muestra puede hacerse en un agitador, licuadora o con un

mortero cuando se trata de alimentos fácilmente rompibles. Una vez obtenida esta
suspensión se procede a realizar las diluciones; para conseguirlo se debe disponer de
varios tubos que contienen 9 ml de diluyente a los cuales se transfiere 1 ml de la dilución
anterior. De esta forma y a partir de 10 -1 se puede obtener las diluciones 10-2, 10-3, 10-4, etc
respectivamente.
Una vez preparadas las diluciones de la muestra, las siembras se realizan inoculando 1 ml.
de cada una cuando se hace en profundidad ó 0.1 ml cuando es en la superficie de un
agar.

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RECUENTO DE HONGOS:
A los alimentos es común practicarles un examen micológico con la finalidad de cuantificar

las diferentes poblaciones de hongos que éstos presentan y en especial de aquellos
hongos que pueden producir micotoxinas.
EL método empleado se realiza en caja de Petri utilizando el agar DRBC como medio de
cultivo; se realiza a todo tipo de alimento y la siembra se aconseja que sea en superficie.
OBJETIVO:
1. Que el estudiante reconozca los medios de cultivos utilizados para realizar los recuentos
de hongos.
2. Realice el proceso de recuento de unidades formadoras de colonias por gramo o mililitro
de muestra (UFC/ml ó UFC/g) y la identificación de hongos.
MATERIALES: Por muestra de alimentos (el estudiante deberá traer tres muestras)
1 Balanza (alimento sólido)
1 Pipeta de 10 ml graduada estériles (sí el alimento es líquido)
1. Papel o vidrio reloj estéril (si el alimento es sólido)
1. Tijera o pinza estéril
1 Morteros estériles (alimento sólido)
1 Hoja de bisturí estéril
1 Bajalenguas estériles (alimentos sólidos)
1 Recipiente frasco con 90 ml de agua peptonada para la primera dilución
2 Tubos con 9 ml de agua peptonada para las diluciones
1 Micropipeta de 100 – 1000 microlitros
9 Cajas de petri vacias con el medio de cultivo DRBC.
METODOLOGÍA:
Tradicionalmente se ha recomendado que con la finalidad de minimizar el error producido
en los recuentos, todas las diluciones se siembren por duplicado, en este laboratorio se
hará por triplicado.

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11. Realice las diluciones de acuerdo con lo especificado en la página anteriormente (De
10-1 a 10-3)
2. Inocule en la superficie del agar DRBC de la siguiente manera:
1 ml de la dilución 10-1 (1:10)
0.1 ml de la dilución 10-1 (1:100)
0.1 ml de la dilución 10-2 (1:1000)
0.1 ml de la dilución 10-3 (1:10000)
3. Distribuya con un asa de vidrio la muestra situada en la superficie del agar DRBC.
4. Incúbelos a temperatura ambiente por 5 – 8 días.
5. Haga los recuentos y posible identificación del hongo.
REALIZACION DE LOS RECUENTOS:

1. Seleccione para hacer su recuento aquella dilución donde haya crecimiento bacteriano
que contenga entre 15 y 150 colonias.
2. Cuente las colonias y el número encontrado deberá multiplicarlo por el reciproco de Ia
dilución que utilizo para hacerlo.
3. Pueden presentarse ciertas variaciones en los cultivos realizados. En la hoja siguiente
usted encontrará las diferentes posibilidades y que hacer en cada caso. Lo importante es
saber que cuando se puedan encontrar diluciones que contengan entre 15 y 150 colonias
si el recuento es preciso, se informa como Recuento Standard.
RECUENTO ESTIMADO STANDARD
Este cálculo se realiza cuando no es posible encontrar ninguna dilución que contenga
menos de 150 colonias. Para hacer recuentos se puede dividir la caja en 2-4 6 aun 8
porciones y contar las colonias. Este numero de colonia se multiplica por el factor
apropiado ( 2, 4 u 8) y además por el reciproco de la dilución, que en este caso sería la
más alta.

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Cuando hay más de 75 colonias por 1/8 se asume que en toda la caja hay más de 600 (75
X 8). El recuento total deberá ser mayor de 600 multiplicado por el reciproco de la más
alta dilución.
Si no hubiese colonias en la caja de la dilución menor (10 -1) se reporta como menos de 10
colonias puesto que el mínimo número de colonias que se puede obtener es de 1 y al
multiplicarlo por el reciproco de la dilución dará 10.
EXPRESION DE LOS RESULTADOS:

1. El recuento de hongos se debe expresar con 2 dígitos y el resto en potencias de 10.
2. Como no siempre el conteo de colonias produce valores como por ejemplo 10-20-50-
8O-300 etc. es necesario aplicar algunas correcciones con la finalidad de convertir el
numero hallado en uno con 2 dígitos. Ejemplos
1. Si el recuento se realizó en la dilución 10 -3 y fue de 138 colonias, el tercer dígito por ser
mayor que 5 permite adicionar 1 unidad al segundo. Quedaría 14 x 10 4.
3. Si el recuento fue de 124, por ser el 3 dígito menor que 5 se anula y se expresa como
12 x 104.

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LABORATORIO 6. ESTRUCTURAS DE LOS HONGOS

Estructura DIBUJAR DESCRIBIR
Hifa hialina septada
Micelio

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Blastoconidia
s
Artroconidia
Clamidoconidia

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Macroconidias y microconidias
Candida albicans
Clamidosporas
Sinemas
Graphium

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Cleistotecios (ascomicetos)
Peritecios
Chaetomiun
Zigosporas de Zigomicetos
Estructura de reproducción
sexual

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Aspergillus -
fialides
Scopulariopsis-
anelides
Rhizopus -
esporangios
PREGUNTAS:

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1. Cuáles estructuras son de reproducción asexual:

2. Cuáles estructuras son de reproducción sexual:
3 Qué estructuras se deben tener en cuenta para la identificación de los hongos
LABORATORIO 7. LEVADURAS, CARACTERÍSTICAS
Levadura Características Características

macroscópicas microscópicas
Saccharomyces cerevisiae
Candida albicans
Candida parapsilosis
Candida krusei
Trichosporon sp
Geotrichum sp

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Rhodotorula sp
Cryptococcus neoformans
Prototheca
LABORATORIO 8. PRINCIPALES HONGOS AISLADOS DE LOS ALIMENTOS

Aspergillus spp
Géneros Características Características
Aspergillus candidus

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Teleómorfo
Alimentos que contamina
Micotoxinas
Características Características
Aspergillus
clavatus
Teleómorfo
Micotoxinas

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Aspergillu
s glaucus
Teleómorfo
Micotoxinas
Aspergillus flavus
Teleómorfo

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Micotoxinas
Aspergillus
fumigatus
Teleómorfo
Micotoxinas

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Aspergillus nidulans
Teleómorfo
Micotoxinas
Aspergillus niger
Teleómorfo
Micotoxinas

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Aspergillus
ochraceous
Teleómorfo
Micotoxinas
Aspergillus tamarii
Teleómorfo

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Micotoxinas
Aspergillus terreus
Teleómorfo
Micotoxinas

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Aspergillu
s
versicolor
Teleómorfo
Micotoxinas

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HONGOS CON FORMA DE PINCEL

Pencillium
Teleómorfo
Micotoxinas

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Paecilomyces
Teleómorfo
Micotoxinas
Scopulariopsis

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Teleómorfo
Micotoxinas
Verticillium
Teleómorfo
Micotoxinas
OTROS HONGOS HIALINOS

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Teleómorfo
Micotoxinas
Teleómorfo
Micotoxinas

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Teleómorfo
Micotoxinas
Teleómorfo
Micotoxinas
Teleómorfo
Micotoxinas

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Teleómorfo
Micotoxinas
Teleómorfo
Micotoxinas

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Fusarium
Teleómorfo
Micotoxinas
MOHOS NEGROS ( POROCONIDIAS CON SEPTOS TRANSVERSALES)


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Curvularia
Teleómorfo
Micotoxinas
Dreschler
Teleómorfoa

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Micotoxinas
Bipolari
Teleómorfos
Micotoxinas

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Exserohilu
m
Teleómorfo

Helminthosporiu
m

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Teleómorfo
Micotoxinas
MOHOS NEGROS (POROCONIDIAS CON SEPTOS TRANSVERSALES Y LONGITUDINALES)

Alternaria
Teleómorfo
Micotoxinas

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Epicoccu
m
Teleómorfo
Micotoxinas
Ulocladium

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Teleómorfo
Micotoxinas
OTROS MOHOS NEGROS

Cladosporium
Teleómorfo
Micotoxinas

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Teleómorfo
Micotoxinas
Teleómorfo
Micotoxinas
ZIGOMICETOS


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Rhizopu
s
Teleómorfo
Micotoxinas
Mucor
Teleómorfo
Micotoxinas

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Absidia
Teleómorfo
Micotoxinas

Syncephalastru
m
Teleómorfo
Micotoxinas

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Cunningamella
Teleómorfo
Micotoxinas
OTROS HONGOS EN ALIMENTOS:


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Botrytis
Teleómorfo
Micotoxinas
Moniliella acetoabutans
Teleómorfo

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Micotoxinas
Monascus ruber
Teleómorfo
Micotoxinas

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Aureobasidium pullulans
Teleómorfo
Micotoxinas
LABORATORIO 5. TEST DE CONCENTRACIÓN INHIBITORIA MINIMA (CMI)

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PRINCIPIO:
Los tubos que contienen concentraciones decrecientes del agente a investigar son
inoculados con un organismo testigo. Después de un período de incubación, los tubos son
examinados para detectar la presencia o ausencia de crecimiento. La actividad del agente
analizado es la mínima concentración que inhibe el crecimiento del organismo y es
expresado como la concentración inhibitoria mínima.
MEDIOS, DILUYENTES Y CULTIVOS:

1. Caldo tripticasa soya o BHI y caldo Saboraud
2. Agar específico para cada bacteria u hongo testigo.
3. Solución buffer fosfato
MATERIALES DE LABORATORIO:
1. Tubos de 13x100 mm
2. Tubos de 20x150 mm
3. Gradillas
4. Agitador vortex
5. Pipetas estériles
6. Pipetas automáticas
7. Incubadora
8. Baño de agua
PROCEDIMIENTO:
Preparación de los disolventes.
1. Prepare el buffer fosfato, adicionando 1.25 ml de la solución stock a 1 litro de agua
destilada. Dispense 9 ml en tubos de 20x150mm, esterilice y enfrié.
2. Prepare el caldo BHI y el caldo Saboraud
3. Dispense 1.4 ml en tubos de 13x100mm (12tubos/muestra/organismo). Dispense
adicional 0,8 ml en el primer tubo de cada grupo de 12. Esterilice y enfrié.
Preparación de los inóculos:

1. El total de los organismos deben tener: 24-48 horas las bacterias y levaduras y los mohos 5
días.
2. Se realiza la dilución de la bacteria y levadura (10-3) en solución buffer fosfato.

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3. Los mohos deben cultivarse en agar inclinado (agar Saboraud)

4. 9 ml de buffer fosfato se adicionan al tubo. Este se considera la dilución 10 -1, la dilución 10-
3
es considera como inoculo.
Preparación de las muestras:
1. El producto se puede preparar directamente o utilizar una dilución.
2. Las muestras tales como jabones, o material viscoso tales domo dentífricos, pueden ser
primero diluidas.
3. Los jabones son normalmente diluidos como sigue: Raspe 5 gramos de jabón con rallador;
combine un gramo de jabón rallado y 9 ml de agua destilada estéril en un tubo de 20x150
mm estéril; coloque en una baño maría 44 - 47ºC, agite periódicamente hasta que se
disuelva completamente. Mantenga la muestra a esta temperatura para que no se vaya a
solidificar.
4. Los dentífricos son diluidos, mezclando una parte del dentífrico con dos partes de agua
destilada (1:3), se agita periódicamente hasta que se disuelva completamente.
SERIE DE DILUCIONES: Usando técnicas asépticas.
1. Pipetee 0.2 ml de la solución test en el primer tubo de los doce (volumen total 2 ml
dilución 1:10.
2. Agítelo y transfiera 1 ml ml en el segundo tubo.
3. Repita lo anterior con el tubo tercero y así sucesivamente hasta el tubo No. 12.
4. Descarte 1 ml del último tubo.
5. Inocule a cada tubo 0.1 ml de la dilución 10-3 del microorganismo.
6. Inocule un tubo con medio sin el producto (Control positivo)
7. Deje un tubo con medio únicamente sin inóculo (control negativo)
8. Incube las bacterias, levaduras y hongos de acuerdo a las temperaturas y días de
crecimiento de cada uno de ellos.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS:

1. El crecimiento se determina por la turbidez de los tubos. La concentración inhibitoria
mínima se determina por el último tubo que no muestra crecimiento.
2. Se deben hacer subcultivos de los tubos que no muestran crecimiento para determinar la
actividad bacteriostática o bactericida del producto e igualmente la actividad fungistática
y fungicida de los hongos.
3. Estos subcultivos se hacen en los agares específicos para cada microorganismo.

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4. De los tubos que muestran crecimiento se debe hacer un subcultivo en agar para
comprobar que realmente es el organismo testigo.
5. El MIC es el último tubo que no muestra crecimiento en los subcultivos.

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1.1 ECOLOGÍA DE LOS HONGOS EN LOS ALIMENTOS:

1) Actividad del agua.

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3) Temperatura de procesamiento y almacenaje

1.1.1 Actividad del Agua.

La actividad del agua es un concepto físico-químico que fue introducido a la microbiología

La actividad del agua está definida como:

La actividad de agua, es numéricamente similar a la humedad relativa del equilibrio (ERH)

Aw(comida) = ERH (aire)/100.

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De este modo, aw puede experimentalmente controlarse, y la relación de a w a la humedad

En muchas situaciones prácticas, aw es el factor ambiental dominante que rige en la

Los hongos tienen la capacidad de crecer en bajos a w, en presencia de altas

El grado de tolerancia a bajos a w es el mínimo valor de aw al cual germina el hongo y el

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Tabla 1. Actividad de agua de algunos alimentos.

AW ALIMENTOS MOHO LEVADURAS

0.95 Pan Basidiomicetos, la mayoría Basidiomicetos

0.90 Jamón Mucorales, Fusarium La mayoría de

1.1.2 Concentración de los Iones de Hidrógeno.

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Para los alimentos procesados calientes, el pH 4.5 es crítico: el procesamiento caliente

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preservativos incrementan el efecto del calor (Beuchat, 1981a,b) y también obstaculiza la

Alimentos congelados a -10°C o menos parecen ser microbiológicamente estable, a pesar

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Tabla 2 Comparación de la resistencia al calor de asocosporas y conidias a

1.1.4 Potencial de oxido-reducción:

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Las especies Byssochlamys parecen ser particularmente tolerantes a las condiciones de la

Al menos algunas especies de Mucor, Rhizopus y Fusarium son capaces de crecer y

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(Hesseltine et al., 1985). Otros autores han informado de crecimiento en condiciones

En contraste, las especies de Saccharomyces, especies de Zygosaccharomyces y otras

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El estado nutricional de la mayoría de los alimentos es adecuada para el crecimiento de

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1.1.7 Efectos específicos de soluto

Como se dijo anteriormente, el crecimiento microbiano en condiciones de menor

Zygosaccharomyces rouxii, es el segundo organismo más xerófilo conocido, puede crecer

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1.1.8 Los conservantes

El hongo filamentoso Penicillium roqueforti parece ser especialmente resistentes a los

CONCLUSIONES: CONSERVACIÓN DE LOS ALIMENTOS

Es evidente que el crecimiento de los hongos en un alimento está gobernada en gran

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