 Cuadro comparativo de protocolo

Método A Método B Protocolo 1

Tipo de método M. Tradicional M. Tradicional M. Kit comercial

Si implicar No requiere mucho

Preparación preparación Si implica preparación entrenamiento

Muestra Sangre Sangre Sangre

Tiempo Aprox. 4-6 Horas Aprox. 4-6 Horas Aprox. 45 min

540uL solución lisis de 200 uL de solución lisis

Solución lisis eritrocitos 600uL de buffer CTAB 20 uL de proteinasa K

10-15 min /
Incubación 1h/ 65° Temperatura 10 min/ 60°
ambiente
Precipitación de:
Proteínas, lípidos o 90uL de acetato de Cloroformo -
carbohidratos potasio 3M isoamilico 24:1

Precipitación del 600uL Isopropanol 0.6 vol. Isopropanol

ADN frio

ADN puro o Buffer TE Agua estéril Buffer de elución

hidratado

Tubo eppendorf 2ml

Materiales Tubos 1.5ml. Tubo de 1.5ml Microtubo 1.5ml

Cantidad de Cuatro veces Tres veces Seis veces

centrifugación
 Método A
 EDTA (ácido etilendiamino tetraacético)

Es un conocido agente quelante de cationes divalentes, en especial Ca 2+ y Mg2+.

Dado que el Mg2+ inhibe la acción de las nucleasas al no haber cofactores libres
para su actividad y así protege al ADN durante la preparación y la electroforesis.

 Solución de lisis de glóbulos rojos (Tris-HCL 10 mM Ph 8, Tritón x-100 1% y

Sacarosa 11%):

 Tris-hcl 10 mm:

Actúa como un tampón biológico general en múltiples aplicaciones, incluyendo

estudios de tinción, reducción y alquilación.

 Tritón x-100 1%

Como surfactante no iónico, también puede usarse como detergente.- rompe las
membranas.

 Sacarosa 11%
Permitirá la ruptura de las membranas del glóbulo rojo, eliminándolos de una
muestra de sangre en la que, para extraer DNA, solo nos importan los elementos
nucleados, o sea los glóbulos blancos.

 Tampón tris – HCL:

Necesario para ajustar el pH al valor indicado. La disolución, por tanto, contiene

Tris base, Tris ácido y cloruro. En la electroforesis, es el tampón que mantiene el
pH en el gel.

 TRITON X-100 1%:

Es un tensioactivo y emulsionante no iónico ampliamente utilizado para la

solubilización de membranas y la recuperación de componentes de la membrana
en condiciones suaves y no desnaturalizantes. Un componente de la prueba de
hemoglobina fetal (HbF), viene como una solución al 1% que se puede diluir en
solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contiene albúmina de suero
bovino (BSA) y azida de sodio para crear una solución de trabajo al 0.1%.

 BUFFER DE GLOBULOS BLANCOS (Tris-HCL 10 mM Ph 8; EDT 2mM y NaCl

400 mM):
 Tris-HCL 10 mM ph 8:

Actúa como un tampón biológico general en múltiples aplicaciones, incluyendo

estudios de tinción, reducción y alquilación.

 NaCl (Cloruro de sodio):

Las sales aumentan el poder iónico de la solución y ocasionan la precipitación del

ADN.

 PROTEINASA K:

Es una enzima que sirve para romper/degradar a las proteínas que están unidas al
ADN. Probado en ausencia de RNAsas y DNAsas es especialmente apropiado
para templados de PCR y RT-PCR.

 SDS (Dodecil sulfato de sodio):

Es un detergente aniónico que actúa como agente solubilizante de proteínas y de

componentes de tejidos y membranas.

 ACETATO DE POTASIO (C2 H3 KO2):

Es una sal neutra del ácido acético, que se utiliza en la precipitación del ADN,
luego de la eliminación de las proteínas.

 IsopropanoL (CH3 CHOHCH3)

Líquido transparente, volátil e incoloro empleado en el laboratorio químico para

extraer y disolver lípidos y en histología se usa como solubilizante de los
colorantes de grasas y como agente deshidratante. El isopropanol precipita el DNA
porque compite con este por el agua, deshidratándolo y llevándolo al fondo del
tubo.

 Etanol 70% (CH3CH2OH)

Es un disolvente que no se mezcla con el ADN por lo tanto se usa para precipitar
el ADN

 Buffer Te:

Aumenta la estabilidad del ADN en muestras almacenadas a largo plazo o de uso

frecuente, pues inhibe DNasas presentes en la muestra.
 Método B
 Buffer CTAB (bromuro de cetil-trimetil amonio)
Es un detergente catiónico que tiene la propiedad de precipitar ácidos nucléicos y
polisacaridos ácidos en soluciones de baja concentración iónica.

 EDTA
Es el ácido etilendiaminotetraacético, y generalmente se provee en forma de sal
disódica. Es un quelante de iones y se hace uso extensivo del mismo en la
preparación de diversas soluciones en Biología Molecular, así como en solución
tampón de corridas electroforéticas

 Fenol

Desnaturaliza las proteínas contaminadas de las muestras

 Cloroformo: Isoamilico 24:1

Tiene como función eliminar los residuos de lípido, proteína y sales, detergentes y
otros reactivos empleados en el ADN.

 Isopropanol frio

Precipitan los ácidos nucleicos

 Pellet

Referirse al precipitado obtenido en el fondo de un tubo luego de, por ejemplo, una
centrifugación.

 Etanol 70%

Es un disolvente que no se mezcla con el ADN por lo tanto se usa para precipitar
el ADN.

 Agua estéril

Aplicación en PCR, RT-PCR y ensayos enzimáticos

 Tris

Este es un compuesto básico (2-amino-2-(hidroximetil)-1, 3- propanodiol) cuyo uso

está muy difundido en el área de Biología Molecular en la preparación de diversos
tampones, y como agregado en reactivos de lisis, purificación, y resuspensión de
ácidos nucleicos.
 Gel agarosa

Se utiliza comúnmente para separar moléculas en función de su carga, tamaño y

forma. Se trata de un medio de separación especialmente eficaz para las
biomoléculas cargadas como el ADN, el ARN y las proteínas.

PROTOCOLO 1
  SOLUCION DE LISIS:

Es una solución de Tampón que se utiliza con el fin de romper células abiertas
para su uso en experimentos de biología molecular que analizan las macro
moléculas lábiles de las células
.
 SOLUCION BINDING:

Se utiliza para unir el ADN de un lisado que permite dar un mayor purificación

 SOLUCION LAVADO C

Es una solución que se utiliza etanol 70% que permite obtener sedimentos
blancos.

 BUFFER DE ELUCION:

Contiene acida sódica como conservante, la cual presenta absorbencia a 260 nm.
Por lo tanto, al cuantificar el ADN en el eluido midiendo la absorbencia a 260 nm,
al determinar la pureza del ADN en el eluido.

Bibliografía
x

1. [Online].; 2016. Available from:

https://repository.cimmyt.org/bitstream/handle/10883/593/91224.PDF?
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2. [Online].; 2015. Available from:

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3. [Online].; 2017. Available from: https://sisbib.unmsm.edu.pe/bibvirtualdata/Tesis/Basic/Ya

%C3%B1ez_A_V/anexos.pdf.

4. [Online].; 2014. Available from:

https://www.tdx.cat/bitstream/handle/10803/2990/6.MATERIALES_Y_METODOS.pdf?
sequence=7.

• Indicar las funciones de los reactivos empleados en cada protocolo.

Método A
Buffer TE :Este tampón 1X TE es un componente del sistema de purificación de plásmidos
PureLink ™ 96, que ahora se ofrece por separado. Se utiliza para resuspender el sedimento de
plásmido purificado final y contiene muy bajo EDTA, por lo que es compatible con la secuenciación
y otras aplicaciones enzimáticas.

Método B

Buffer CTAB (Detergente: Rompe las membranas nucleares

Protocolo 1

Solución binding