Está en la página 1de 7

CIENCIA 12(4), 269 - 275, 2004

Maracaibo, Venezuela

Biodegradación de hidrocarburos aromáticos


policíclicos y heterocíclicos por Pseudomonas spp.
Mariangela Bracho*, Laugeny Díaz y Luz Marina Soto
Laboratorio de Microbiología Acuática, Departamento de Biología, Facultad Experimental
de Ciencias, La Universidad del Zulia, Apartado 526, Maracaibo, Venezuela.
Recibido: 29-07-04 Aceptado: 06-10-04

Resumen
Se evaluó la capacidad de 14 cepas de Pseudomonas de degradar hidrocarburos aromáti-
cos dicíclicos, tricíclicos y heterocíclicos tales como: naftaleno, antraceno, fenantreno y diben-
zotiofeno, contituyentes de la fracción aromática del petróleo. Con este fin, los hidrocarburos
disueltos en solventes orgánicos fueron rociados en placas de agar, formando una capa opaca
de sustrato, sobre la cual fueron inoculadas las colonias. Las bacterias capaces de degradar los
hidrocarburos se detectaron al presentar crecimiento visible y expansión de los límites de las
colonias o aparición de zonas claras en la capa de los hidrocarburos, fenómenos que evidencian
la solubilización y utilización del sustrato. Como resultado se encontró que el 100% de las ce-
pas estudiadas fueron capaces de degradar los hidrocarburos naftaleno y antraceno, el 78,57%
degradó fenantreno, el 71,42% dibenzotiofeno y el 50% los cuatro hidrocarburos. Estos resul-
tados demuestran que las cepas aisladas poseen capacidades enzimáticas diferentes para de-
gradar estos compuestos. Asimismo permitieron seleccionar cepas capaces de degradar algu-
nos de los constituyentes de la fracción aromática del petróleo, característica que las hace idea-
les para su utilización en ensayos de biorremediación de suelos impactados con petróleo.
Palabras clave: Biodegradación; hidrocarburos policíclicos; Pseudomonas.

Biodegradation of polycyclic and heterocyclic aromatic


hydrocarbons by Pseudomonas spp.
Abstract
The ability of 14 bacterial strains of Pseudomonas to degradate aromatic hydrocarbons
such as: naphthalene, anthracene, phenanthrene and dibenzothiophene was evaluated. With
this aim, hydrocarbons dissolved in organic solvents were sprinkled in plates of agar, forming
an opaque layer of substrate, on which the colonies were inoculated. The bacteria able to de-
grade hydrocarbons, were detected when presenting visible growth and expansion of the limits
of the colonies, or for the appearance of clear zones in the layer of hydrocarbons, phenomena
that demonstrate the solubilization and use of the substrate. As result, the 100% of the isolated
strains studied were able to degrade naphthalene and anthracene, 78.57% degraded phenan-
threne, 71.42% dibenzothiophene and 50% the four hydrocarbons. These results demonstrate,
that the isolated strains have different enzymatic capacities to degrade these compounds. Also,
they allowed to select bacterias strains able to degrade the aromatic fraction of the petroleum
that makes ideals for its use in tests of biorremediation of petroleum contaminated soil.
Key words: Biodegradation; hydrocarbons; Pseudomonas.

* Autor para la correspondencia. E-mail: mabracho@hotmail.com

Scientific Journal from the Experimental Faculty of Sciences,


at La Universidad del ZuliaVolume 12 Nº 4, October-December 2004
270 Biodegradación de hidrocarburos aromáticos

Introducción Durante los últimos años ha sido obje-


to de intensa investigación el desarrollo de
El petróleo contiene numerosos hidro- biotecnologías que complementen los proce-
carburos aromáticos y heterocíclicos, los sos fisicoquímicos ya existentes, basadas en
cuales varían en tamaño molecular y com- la utilización de microorganismos para la re-
plejidad; desde compuestos monocíclicos cuperación de los ambientes contaminados
hasta estructuras de cadenas largas y com- con petróleo y otros combustibles, en virtud
plejas constituidas por anillos aromáticos de la capacidad que poseen estos organis-
(1). De estos, los hidrocarburos aromáticos mos de oxidar los compuestos hidrocarbo-
son más complejos, siendo los más estudia- nados del petróleo degradándolos hasta me-
dos el tolueno, naftaleno, antraceno, fenan- tabolitos que pueden ser fácilmente removi-
treno y dibenzotiofeno, debido a que estos dos o dispersados del ambiente (3).
anillos aromáticos, forman parte de una
amplia variedad de productos de importan- En este sentido, la habilidad que po-
cia biológica, química e industrial. seen algunas bacterias de metabolizar hi-
drocarburos aromáticos sencillos tales
Los hidrocarburos poliaromáticos son como tolueno, xileno y naftaleno ha sido am-
constantemente liberados al ambiente prin- pliamente estudiada (4, 5). Sin embargo, se
cipalmente a partir de las actividades antro- han descrito pocos géneros bacterianos ca-
pogénicas, siendo la mayor fuente de libera- paces de degradar hidrocarburos aromáti-
ción, los procesos de quema de combusti- cos policíclicos y heterocíclicos en particular
bles fósiles, la licuefacción del carbón, la ga- el antraceno, fenantreno (6, 7) y dibenzotio-
sificación del petróleo y los derrames acci- feno (DBT) (8, 9). Generalmente las especies
dentales de petróleo. Cuando ocurre un de- señaladas por su capacidad de degradar
rrame de petróleo en el ambiente, los com- monoaromáticos no son capaces de metabo-
puestos de bajo peso molecular general- lizar aromáticos más complejos.
mente se pierden por volatilización, mien-
tras que los hidrocarburos poliaromáticos y En este trabajo se determinó cualitati-
heterocíclicos permanecen como remanen- vamente el potencial biodegradativo que
te, haciéndose de esta manera persistentes presentan bacterias autóctonas aisladas de
en el ambiente. Los hidrocarburos poliaro- suelos contaminados con petróleo frente a
máticos con dos o más anillos, heterocícli- hidrocarburos aromáticos dicíclicos, tricí-
cos y sus homólogos alquil sustituidos, que clicos y hetrocíclicos, para así confirmar su
son liberados en los ecosistemas, constitu- especificidad hacia el sustrato, a fin de se-
yen un grave problema porque contaminan leccionar cepas bacterianas con una amplia
fuentes de agua y suelos, ocasionando un capacidad degradadora, que garanticen de
gran impacto ecológico, en virtud de los efec- esta forma la remoción de los hidrocarburos
tos recalcitrantes y tóxicos que ejercen so- complejos presentes en el suelo.
bre los seres vivos (1). Es por ello que estos
hidrocarburos deben ser removidos o su Materiales y Métodos
concentración debe ser sustancialmente re-
Microorganismos: Se trabajo con un
ducida del ambiente. Con este propósito,
total de 14 cepas de Pseudomonas sp., aisla-
frecuentemente son utilizados procesos de
das en trabajos previos a partir de muestras
degradación industrial tanto químicos como
de suelo contaminado con petróleo proce-
físicos, que pese haber demostrado su po-
dentes de la localidad de “La Concepción”
tencial para la recuperación de cientos de
Municipio Jesús Enrique Lossada del Esta-
lugares contaminados, resultan relativa-
do Zulia (10). Estas fueron cultivadas en un
mente inadecuados para la remoción de hi-
medio selectivo a fin de enriquecer las cepas
drocarburos complejos y además el costo de
con la capacidad de degradar los compues-
su aplicación resulta elevado (2).

Scientific Journal from the Experimental Faculty of Sciences,


at La Universidad del Zulia Volume 12 Nº 4, October-December 2004
M. Bracho et al. / Ciencia Vol. 12, Nº 4 (2004) 269 - 275 271

tos de interés. Las cepas se incubaron en fio- rescen en presencia de la luz UV, cuando
las de 125 mL conteniendo 50 mL de medio está íntegra su estructura y propiedades fi-
mínimo mineral (MMM) (11), con una com- sicoquímicas. Sin embargo, si sufre alguna
posición por Litro de solución NH4Cl 1,2 g; alteración por acción bacteriana, causa la
KNO3 2,4 g; CaCl2 2H2O 0,00067 g; Na2SO4 pérdida de la fluorescencia y desaparece de
2,4 g; MgSO4 7H2O 2,04 g; K2HPO4 3H2O 0,65 las zonas vecinas a las colonias que efectiva-
g; KH2PO4 3H2O 0,5 g; FeSO4 7H2O 0,02 g. mente lo degradan.
Como fuente de carbono se emplearon los
hidrocarburos naftaleno, antraceno, fenan- Resultados
treno y DBT al 0,05% p/v.
Se observó, entre el quinto y séptimo
Determinación de la capacidad de día de incubación, en las placas rociadas
degradación de hidrocarburos por bacte- con naftaleno y DBT, que las colonias de las
rias: Para determinar la capacidad de utili- cepas degradadoras aumentaron su exten-
zación de los hidrocarburos antraceno, naf- sión, produciendo zonas de crecimiento con
taleno, fenantreno y DBT, como única fuen- un diámetro de 3 a 4 mm; mientras que en
te de carbono por las bacterias aisladas se las cepas controles y en las no degradado-
empleó la técnica de Kiyohara y Nagao (12) ras, el tamaño de la colonia permaneció
con algunas modificaciones. Para ello, se constante sin mostrar variación durante 15
utilizaron placas de MMM y agar al 1,5%, ro- días de incubación. Por otro lado, en las pla-
ciadas de manera homogénea con naftale- cas rociadas con antraceno y fenantreno, la
no, antraceno y fenantreno (cada uno por degradación del hidrocarburo se evidenció
separado) disueltos en éter al 0,05% y el al observar zonas claras (halo) alrededor de
DBT disuelto en acetona a la misma concen- las colonias, fácilmente diferenciables en la
tración. Las placas fueron incubadas previa capa opaca del hidrocarburo, que indican la
inoculación, durante toda la noche con el fin solubilización y utilización del sustrato por
de eliminar el solvente por evaporación. parte de la bacteria.
Como inóculo se utilizó un cultivo de cada
una de las cepas aisladas con una densidad El comportamiento de cada cepa sobre
óptica correspondiente a la del tubo Nº 2 del los hidrocarburos estudiados se incluye en
nefelómetro, el cual fue sembrado con un hi- la Tabla 1, en esta se observa que el 100% de
sopo estéril en placas de agar nutriente, las las cepas estudiadas fueron capaces de de-
cuales se incubaron a 37ºC durante 24 a 36 gradar los hidrocarburos aromáticos policí-
horas. Posteriormente, con la ayuda de un clicos naftaleno y antraceno, mientras que
palillo de madera estéril se transfirieron las el 78,57% degradó el fenantreno. En rela-
colonias correspondientes a cada una de las ción a la fracción de heterocíclicos azufrados
cepas, a las placas rociadas con hidrocarbu- estudiada representada por el DBT, este fue
ro. Posterior a la inoculación, las placas se degradado sólo por el 71,42% de las cepas
incubaron a 37ºC durante 15 días. Durante aisladas.
este lapso fueron observadas periódicamen- Es importante destacar que el 50%, las
te a través de un transiluminador UVPRO cepas de Pseudomonas estudiadas fueron
CHROMATO-VUE modelo TM-36, para de- capaces de degradar naftaleno, antraceno,
terminar la desaparición de la fluorescencia fenantreno y DBT. Tres de estas, el equiva-
propia del hidrocarburo evidenciada como lente al 42,85%, designadas como PLC 2,
zonas claras alrededor de las colonias, o el PLC16, PLC42 degradaron los hidrocarbu-
crecimiento de los límites de las colonias in- ros en la mitad del tiempo (3 días) requerido
dicadores de la capacidad de la bacteria de por las restantes, condición que las convier-
degradar los hidrocarburos. Esto es posible, te en cepas ideales para la realización de en-
ya que estos hidrocarburos aromáticos fluo- sayos de biorremediación de suelos impac-

Scientific Journal from the Experimental Faculty of Sciences,


at La Universidad del ZuliaVolume 12 Nº 4, October-December 2004
272 Biodegradación de hidrocarburos aromáticos

Tabla 1
Crecimiento de cepas de Pseudomonas en hidrocarburos aromáticos policíclicos y heterocíclicos
como única fuente de carbono

Pseudomonas Naftaleno Antraceno Fenantreno DBT


PLC 20-1 + + + +
PLC 31 + + + -
PLC 36 + + + +
PLC 24-1 + + + -
PLC 16 + + + +
PLC 42 + + + +
PLC 33 + + + -
PLC 15 + + + -
PLC 20 + + + +
PLC17-1 + + - +
PLC 18 + + - +
PLC 22 + + - +
PLC 19 + + + +
PLC 2 + + + +
+= crecimiento en placas de MMM más hidrocarburo al 0,05% p/v. – = ausencia de crecimiento.

tados, en virtud de su capacidad de degra- ron la menor capacidad de crecimiento, in-


dar un amplio rango de sustratos en menor dica que de los hidrocarburos aromáticos
tiempo. Por ello, estas fueron seleccionadas estudiados este es el más resistente al ata-
para realizar futuras investigaciones rela- que microbiológico. La recalcitrancia de este
cionadas con sus condiciones óptimas de compuesto puede deberse tanto a factores
degradación. físicos, relacionados con su estructura,
como a restricciones biológicas debidas a la
Discusión incapacidad de los organismos estudiados
para sintetizar las enzimas requeridas para
El orden de la degradación de los hidro- su degradación (13).
carburos aromáticos por las bacterias estu-
diadas fue: naftaleno = antraceno > fenantre- Trabajos realizados por Gundlanch y
no > dibenzotiofeno, siendo todas las cepas col., (14) y Fedorack y Westlake (15) demos-
capaces de crecer en presencia de naftaleno y traron que los hidrocarburos aromáticos al-
antraceno como única fuente de carbono. quilsustituidos y heterocíclicos azufrados
Esto indica que todas las bacterias estudia- son más recalcitrantes que sus contrapar-
das cuentan con el sistema enzimático re- tes no sustituidos. En este sentido, desde el
querido para la degradación de estos hidro- punto de vista estructural el DBT es mucho
carburos aromáticos policíclicos y su utiliza- más complejo que el antraceno y el fenantre-
ción como fuente de carbono y energía. no (Figura 1), a pesar de poseer sólo dos ani-
llos aromáticos, ya que está sustituido por
El hecho de que el DBT haya sido el hi- un grupo azo, el cual actúa como aceptor de
drocarburo para el cual las cepas presenta- electrones (altamente electrofílico) y crea

Scientific Journal from the Experimental Faculty of Sciences,


at La Universidad del Zulia Volume 12 Nº 4, October-December 2004
M. Bracho et al. / Ciencia Vol. 12, Nº 4 (2004) 269 - 275 273

cos (antraceno y fenantreno) dicíclicos (naf-


taleno) y heterocíclicos azufrados (DBT) en
condiciones aeróbicas, lo que indica que po-
seen enzimas del tipo oxigenasas con un
amplio rango de sustratos, que son respon-
Naftaleno Antraceno sables de la oxidación de diversos compues-
tos aromáticos.
Estos resultados concuerdan con los
encontrados por Sanseverino y col., (17)
quienes utilizaron cepas de Pseudomonas
S para investigar el papel de la ruta codificada
Fenantreno Dibenzotiofeno en plásmidos NAH en la mineralización de
otros hidrocarburos tales como el fenantre-
no y antraceno. Los resultados obtenidos in-
dicaron que estos genes catabólicos están
Figura 1. Estructura de los hidrocarburos usa- involucrados en la degradación de otros hi-
dos en este estudio. drocarburos poliaromáticos además del naf-
taleno, tales como el antraceno y fenantre-
impedimentos estéricos, afectando de esta no. Asimismo, Gibson y Subramanian, (18),
manera la acción de las enzimas dioxigena- establecieron que el antraceno y el fenantre-
sas que inician el ataque electrofílico de la no son metabolizados por las mismas enzi-
molécula al oxidar los enlaces carbono car- mas que catalizan los pasos iniciales del me-
bono de los compuestos aromáticos (13). tabolismo del naftaleno.
Los resultados obtenidos indican la Por otro lado, trabajos realizados con
presencia en la población microbiana estu- cepas de Pseudomonas demostraron que los
diada de tres fenotipos degradadores genes que codifican las enzimas involucra-
+ + + + + + + -
N A F D (7 cepas), N A F D (4 cepas), y das en la degradación del naftaleno, son los
+ + - +
N A F D (3 cepas). Si se toma en cuenta que mismos que codifican las enzimas involu-
las bacterias son capaces de degradar los hi- cradas en la oxidación del DBT (8). Por su
drocarburos debido a que contienen las en- parte, Denome y col., (19), reportaron cepas
zimas involucradas en las rutas metabólicas de Pseudomonas capaces de metabolizar,
degradativas, se puede concluir que las ce- naftaleno, fenantreno y DBT, por acción de
pas estudiadas poseen capacidades enzimá- un mismo sistema enzimático. Todos estos
ticas diferentes para degradar los hidrocar- resultados reportados en trabajos previos
buros aromáticos analizados, a pesar de que pueden explicar la actividad degradativa ha-
las rutas metabólicas implicadas en la oxi- cia el naftaleno, antraceno y DBT encontra-
dación de estos compuestos sean similares. da en los fenotipos N+A+F+D+ y N+A+F-D+.
Estos resultados concuerdan con los repor-
tados en numerosos estudios fisiológicos, El grupo de cepas que portan el fenoti-
+ + - +
bioquímicos y genéticos, en los cuales se ha po N A F D , utilizan el naftaleno pero no son
demostrado que existen diversas rutas para capaces de degradar el fenantreno, indican-
la degradación de hidrocarburos aromáticos do que en estas cepas las rutas para la de-
policíclicos en especies bacterianas diferen- gradación de estos hidrocarburos poliaro-
tes (2, 4, 8, 16, 18). máticos son independientes la una de la
otra. En este sentido, en algunos trabajos se
Las cepas que presentan el fenotipo ha sugerido la existencia de un segundo tipo
N+A+F+D+ tienen la capacidad de oxidar o de- de complejo enzimático involucrado en una
gradar hidrocarburos aromáticos tricícli- ruta alternativa para la degradación del naf-

Scientific Journal from the Experimental Faculty of Sciences,


at La Universidad del ZuliaVolume 12 Nº 4, October-December 2004
274 Biodegradación de hidrocarburos aromáticos

taleno la cual no estaría en capacidad de de- nas aisladas de suelos contaminados con
gradar hidrocarburos aromáticos policícli- petróleo, para la degradación de diferentes
cos más complejos como el fenantreno y el hidrocarburos aromáticos, las cuales po-
antraceno (20). Al respecto, Kiyohara y Na- drían utilizarse en procesos de bioestimula-
gao (12) en un trabajo realizado con 13 ce- ción para el tratamiento de derrames de pe-
pas degradadoras de fenantreno diferentes tróleo, procesos éstos tan urgidos en nues-
(Pseudomonas, Vibrio y cepas no identifica- tro país.
das) encontraron que la ruta de degradación
del fenantreno en estos casos era indepen- Referencias Bibliográficas
diente a la del naftaleno. Por su parte,
Bransley (21) reporta que la oxidación ini- 1. TISSOT B., WELTE D.H. Petroleum forma-
cial del naftaleno y el fenantreno es llevada a tion and ocurrence, Springer-Verlang,
cabo por dos enzimas diferentes. New York (USA), pp. 699, 1984.
2. PARALES R., YU C., PARALES J., GIBSON
En relación al fenotipo N+A+F+D-, pre-
D.T. Expanding the limits of naphthalene
sentado por un 28,57% de las cepas, la inca-
Dioxigenase as a biocatalyst. ASM Confer-
pacidad para degradar el DBT puede deber-
ence of Biodegradation, Biotransforma-
se a la necesidad de estas cepas de contar
con una fuente adicional de carbono como tion, and Biocatalysis (B3). Puerto Rico,
cosustrato. Al respecto, varios trabajos han pp. 6, 2001.
demostrado la necesidad de la presencia de 3. MONTICELLO D.J. The molecular biology
hidrocarburos más sencillos como el bence- of dibenzothiophene desulfurization. The
no, naftaleno o antraceno como fuente de Seven International IGT Symposium of
carbono y energía para que pueda darse la Gas, Oil and Environmental Microbiol-
activación de las enzimas involucradas en la ogy. pp.1-15, 1994.
ruta de oxidación del DBT, confirmando de 4. KANALY R.S., HARAYAMA. Journal of
esta forma que este hidrocarburo es oxidado Bacteriol 182:2059-2067, 2000.
en la mayoría de los casos por cometabolis-
5. VAN HAMM J., SING A., WARD O. Appl En-
mo (8, 16, 22)
viron Microbiol 67:503-549, 2003.

Conclusiones 6. JOHSEN A., WINDING A., KARLSON U.,


ROSLEV P. Appl Environ Microbiol 68:
Las cepas estudiadas presentaron dife- 6106-6113, 2002.
rencias en cuanto a sus capacidades para 7. WICK L., PASCHE N., BERNASCONI S.,
degradar los hidrocarburos fenantreno y di- PELZ O., HARMS, H. Appl Environ Micro-
benzotiofeno; sin embargo, todas fueron ca- biol 69: 6133-6142, 2003.
paces de crecer en presencia de naftaleno y
antraceno. En este sentido, se observaron 8. BALDI F., PEPI M., FAVA F. Appl Env Mi-
tres fenotipos degradadores diferentes crobiol 69: 4689-4696, 2003.
N+A+F+D+, N+A+F-D+ y N+A+F+D-. 9. WIDADA J., NOJIRI H., KASUGA K.,
YOSHIDA T., HABE H., OMORI T. Appl Mi-
El dibenzotiofeno fue el hidrocarburo
crobiol Biotechnol 58: 202-209, 2002.
para el que se obtuvo el menor porcentaje de
cepas degradadoras, condición que lo seña- 10. BRACHO M., DUPONTT L., DIAZ L., SOTO
la como el hidrocarburo más difícil de degra- L.M. Degradative potential over polycyclic
dar por las bacterias, en virtud de su com- and heterocyclic aromatic hydrocarbons by
plejidad estructural, impedimento estérico y bacteria isolated from crude oil contami-
su naturaleza altamente electrofílica. nated soils. ASM Conference of Biodegra-
dation, Biotransformation, and Bio-
En este trabajo se demuestra el poten- catalysis (B3). Puerto Rico, pp. 55, 2001.
cial natural que poseen las bacterias autócto-

Scientific Journal from the Experimental Faculty of Sciences,


at La Universidad del Zulia Volume 12 Nº 4, October-December 2004
M. Bracho et al. / Ciencia Vol. 12, Nº 4 (2004) 269 - 275 275

11. JOBSON A., COOK F.D., WESTLAKE 17. SANSEVERINO J., APPLEGATE B.M., KING
D.W.S. Applied Microbiol 23(6): 1082- J.M., SAYLER G.S. Appl Env Microbiol 59:
1089, 1972. 1931-1937, 1993.
12. KIYOHARA H., NAGAO K., YANA K. Appl 18. GIBSON D.T., SUBRAMANIAN V. Micro-
Environ Microbiol 43: 454-457, 1982. bial degradation of aromatic hydrocar-
13. FIELD A., STARMS A., KATO M., SCHRAA bons. Edited by Gibson, D.T. Marcel
G. Antonie Van Leeuwenhoek 67:47-77, Dekker, Inc. New York (USA), pp. 535,
1995. 1994.
14. GUNDLANCH E.R., BOEHM P.D, MAR- 19. DENOME S.A., OLDFIELD C., NASH L.J.
CHAND M., ATLAS R.M., WARD D.M., YOUNG K.D. Journal of Bacteriology
WOLFW D.A. Science 22:122-129, 1983. 176: 6707-6716, 1994.

15. FEDORACK P.M., WESTLAKE D.W. Can J 20. YEN K., SERDAR C. Crit Rev Microbiol 15:
Microbiol 29: 291-296, 1983. 247-268, 1988.

16. F OGH T J . M . , F E D O R A CK P. M . , 21. BARNSLEY E.A. J Gen Microbiol 88:193-


WESTLAKE W.S. Appl Env Microbiol 64: 196, 1983.
365-373, 1990. 22. KODAMA K. Agric Biol Chem 41(7): 1193-
1196, 1977.

Scientific Journal from the Experimental Faculty of Sciences,


at La Universidad del ZuliaVolume 12 Nº 4, October-December 2004

También podría gustarte