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  31 de Marzo de 2002

Módulos - Microscopía

     Cátedra MICROSCOPIA


   Página por G.Gigola, Chr.Gatti & J.E.Pérez
Principal  

   Presentación

 
   Cronograma
El ojo humano no logra distinguir objetos de menos de 50 micras de diámetro
ni consigue resolver dos líneas separadas por menos de 100 micras (es decir,
   Programa las ve como una sola línea).

   Docentes

   Recursos

   Investigación

Para observar elementos tan pequeños es necesario disponer de lentes de


   Cursos aumento. Estas lentes se conocen desde tiempos de Arquímedes, pero la
óptica como disciplina se comenzó a desarrollar en el siglo XIII con el monje
franciscano Roger Bacon.
     Universida
d
Anton Van Leeuwenhoek (Holanda, 1632-1723), un pulidor de lentes
   UNS
aficionado, logró fabricar lentes lo suficientemente poderosas como para
Académica observar bacterias, hongos y protozoos, a los que llamó "animálculos".

   UNS El primer microscopio compuesto fue desarrollado por Robert Hooke. A partir
de éste, los avances tecnológicos permitieron llegar a los modernos
Administrativa
microscopios de nuestro tiempo, los que existen de varios tipos y son usados
con diferentes fines.
   UNS
Biblioteca

   CRIBABB
Microscopio de Leeuwenhoek

TIPOS DE MICROSCOPIOS

MICROSCOPIOS ÓPTICOS

Microscopio de campo claro: es el microscopio óptico compuesto utilizado


en la mayoría de los laboratorios. Para formar una imagen a partir de un corte
histológico usa luz visible, por esto la muestra debe ser lo bastante fina como
para que los haces de luz puedan atravesarla. También se usan métodos de
tinción, según las necesidades, con el fin de aumentar los detalles en la
imagen.

Microscopio de contraste de fase: posibilita la observación de muestras sin


colorear, por lo que resulta útil para estudiar especímenes vivos.

Microscopio de interferencia: es una modificación del anterior que permite


la cuantificación de masa en los tejidos.

Microscopio de interferencia diferencial: también es una modificación del


microscopio de contraste de fase, que permite estudiar las propiedades de
superficie de las células.

Microscopio de fluorescencia: permite la observación de estructuras


fluorescentes, ya sea naturales o artificiales.

Microscopio de barrido confocal: se usa para estudiar la estructura de


sustancias biológicas. Combina partes de un microscopio de campo claro con
equipo fluorescente y un sistema de barrido que emplea un rayo láser. A
través de una computadora se reconstruye la imagen tomada por planos, a
una imagen tridimensional.

Microscopio de luz ultravioleta: sus resultados se registran


fotográficamente ya que la luz U.V. no es visible y daña la retina. Se utiliza en
la detección de ácidos nucleicos, que absorben esta luz.

Microscopio de luz polarizada: es una modificación del microscopio de


campo claro. Debido al fenómeno de birrefringencia se pueden observar
sustancias cristalinas y moléculas fibrosas.

MICROSCOPIOS ELECTRÓNICOS
Microscopio electrónico de transmisión (MET): utiliza un haz de
electrones para producir la imagen. Permite la observación de detalles a
escala macromolecular.

Microscopio electrónico de barrido (MEB): en este caso el haz de


electrones no atraviesa la muestra, sino que choca contra su superficie.
Permite una gran magnificación de las imágenes.

M.E.B.

EL MICROSCOPIO DE CAMPO CLARO

Es el principal medio que utilizaremos a lo largo de toda la materia para


observar la morfología de los tejidos a estudiar, por lo que debemos conocer
en detalle sus partes y el funcionamiento de cada una de ellas.

Sistema Mecánico

o Pie
o Vastgo o columna
o Tornillos de ajuste macrométrico
o Micrométrico
o Tubo
o Platina
o Subplatina
Sistema Óptico

o De Observación Ocular
o Objetivo
o De iluminación condensador
o Espejo
o Fuente de luz

SISTEMA MECÁNICO

Este sistema sostiene al sistema óptico y aloja los elementos necesarios para
la iluminación y enfoque del preparado.

Pie: brinda apoyo y estabilidad al aparato.

Vástago: soporta la platina, tubo y tornillos de ajuste macro y micrométrico.

Tornillo de Ajuste: provocan el desplazamiento del tubo o la platina en


sentido vertical, lo que permite el enfoque.

Tubo: en su extremo superior se halla el ocular, y en el inferior el objetivo. Se


trata de un cilindro metálico cuyo interior se encuentra pintado de negro, lo
que evita la reflexión de la luz. Normalmente tiene una longitud de 170 mm.

Platina: es una plataforma horizontal sobre la cual se coloca y sujeta el


preparado a observar, tiene un orificio central que permite el paso de la luz y
un venier que posibilita la relocalización de los detalles de interés.
Subplatina: sostiene al condenador y se ubica por debajo de la platina.

SISTEMA ÓPTICO

Se compone de un sistema óptico de observación y un sistema óptico de


iluminación; el primero consta de:

Objetivo: está formado por un sistema de pequeñas lentes ubicadas muy


cercanas una de la otra, la que se halla en el extremo distal del objetivo se
denomina lente frontal. Los objetivos pueden ser objetivos a seco (no hay
ninguna sustancia interpuesta entre la lente frontal y el preparado), u
objetivos de inmersión (entre la lente frontal y el preparado se coloca una
sustancia cuyo índice de refracción es muy similar al del vidrio).

  

Ocular: es un tubo cilíndrico con un diafragma fijo en el centro y una lente en


cada extremo, la superior se denomina lente ocular y la inferior lente
colectora.

El sistema óptico de iluminación consta de:

Condensador: concentra el haz de luz sobre el plano del objeto que se


encuentra en la platina. Debajo de él se encuentra el diafragma iris que regula
la cantidad de luz que llega al condensador.

  

Fuente de Luz: es una lámpara que está ubicada en la parte inferior del
aparato, en caso de no poseerla debe ubicarse una fuente de luz externa
(lámpara incandescente común) aproximadamente a 30 cm. del espejo.
CARACTERISTICAS DE LOS OBJETIVOS:

 ESCALA DE REPRODUCCIÓN: relación lineal que existe entre el tamaño del


objeto y su imagen, por ejemplo, 4:1, 40:1, 65:1, etc.
 PODER DEFINIDOR: es la capacidad del objetivo de formar imágenes de
contornos nítidos.

 LÍMITE DE RESOLUCIÓN: es la menor distancia que debe existir entre dos


objetos para que puedan visualizarse por separado.

 PODER DE RESOLUCIÓN: es la capacidad de mostrar la imagen en sus detalles


más finos. Está en relación inversa con el límite de resolución.

 PODER DE PENETRACIÓN: es la propiedad de permitir la observación


simultánea de varios planos del preparado. Es inversamente proporcional a la
escala de reproducción o aumento.

 DISTANCIA FRONTAL: es la distancia de la lente frontal al preparado colocado


en la platina, cuando está enfocado. Disminuye cuando aumenta la escala de
reproducción del objetivo.

 AUMENTO TOTAL: Debemos notar que el ocular también tiene un aumento,


por lo tanto el aumento total de la imagen que observamos es el producto
entre el aumento del objetivo y el del ocular. Ejemplo: si tenemos colocado el
objetivo cuya escala de reproducción es 40:1 y nuestro ocular tiene un
aumento de 10x, entonces el aumento total será 40 x 10 = 400.

USO CORRECTO DEL MICROSCOPIO DE CAMPO CLARO

1. Lo primero es conseguir una buena fuente de iluminación. Si la misma está


incorporada al microscopio, enfocamos con el objetivo de menor aumento,
cerramos el diafragma de campo y movemos el condensador hacia arriba y
hacia abajo hasta que el contorno del diafragma se vea nítido. El diafragma se
centra con los tornillos que lo sujetan a la subplatina. Luego se quita el ocular
y se verifica que la luz esté centrada. A medida que se abre el diafragma su
contorno desaparece del campo observado. Si la fuente de luz es externa, se
quita el ocular, se coloca el objetivo de menor aumento, y se mueve el espejo
hasta centrar la luz. Recordemos que si tenemos condensador debemos usar
la cara plana del espejo.

2. Volvemos a colocar el ocular y, siempre con el objetivo de menor aumento,


colocamos el preparado sobre la platina. Utilizando el tornillo el ajuste
macrométrico enfocamos lo más claramente posible.

3. El condensador debe estar en la posición más alta y el diafragma abierto.


Esto si el preparado está coloreado, sino el diafragma debe estar cerrado.

4. Con el tornillo micrométrico se logra el enfoque fino según nuestra visión.

5. Modificamos la apertura del diafragma hasta obtener la cantidad de luz


deseada.

6. Luego de estudiado el preparado con este objetivo, podemos pasar


gradualmente a objetivos de mayor aumento, corrigiendo la apertura del
diafragma para cada uno de ellos.

7. En caso de utilizar el objetivo de inmersión, se coloca una pequeña gota de


aceite sintético sobre el preparado y luego se enfoca con sumo cuidado,
recordando que este objetivo es el de menor distancia frontal y corremos el
riesgo de estropear el preparado y la lente frontal. Al finalizar el uso de este
objetivo se deben retirar los restos de aceite con un papel de carilina o una
gasa embebida en xilol o solvente especial para limpieza de lentes, nunca se
debe dejar sucio el objetivo.

8. Cuando se termina de utilizar el microscopio se lo debe dejar de la


siguiente manera:
- fuente de luz apagada
- condensador al tope
- diafragma abierto
- platina alta
- objetivo de menor aumento en posición
- todas las lentes limpias.

INTRODUCCIÓN A LA OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA

Para la observación microscópica es importante, como siempre, que Usted se


sienta cómodo. Antes de comenzar la observación deje en otro sitio sus
abrigos, sus carpetas y carteras, acomódese frente al microscopio y proceda a
realizar un reconocimiento del microscopio que va usar. Una vez organizado el
terreno y reconocido los elementos pase a considerar el tiempo disponible.
Tenga en cuenta que va a tener que completar todas las observaciones del
practico en un tiempo determinado, por ejemplo es habitual que un practico
de esta naturaleza dure 90 minutos de los cuales, desde que se acomoda y
recibe una explicación breve al inicio mas los saludos con sus compañeros van
a quedarle unos 60 minutos. Ud. piense que debe hacer un reconocimiento de
varios preparados que pueden ser por ejemplo 8 en 60 minutos, es decir 7
minutos por preparado. Para que no le suceda que cuando este por terminar
su tiempo de practico descubra que aun le quedan por examinar varios
preparados es recomendable que divida el tiempo del mismo en dos mitades
de 30 minutos, es decir que al finalizar los primeros 30', debe haber visto 4
preparados exitosamente.

Fíjese el tipo de microscopio que le fue asignado, en que posición esta el


tornillo que desplaza la platina, donde esta localizado el tornillo macrométrico
y el micrométrico, que tipo de fuente de luz posee, etc. Luego proceda a
encenderlo o a enfocar la luz en el espejo.

Una vez reconocido el microscopio, sin mirar aun por el ocular, alinee el eje
óptico del microscopio (que la luz que incide desde la fuente emerja por el
ocular), fíjese que este en posición el objetivo con el que Ud. desea iniciar la
observación. Es recomendable que todas las observaciones las inicie con el
objetivo seco de menor aumento (seco débil).

Seleccione su preparado, primero pase el dedo suavemente por la superficie


para detectar de que lado esta el cubre objeto y ponga este orientado hacia
arriba. Es recomendable que se acostumbre a realizar este procedimiento con
cada preparado porque si usted lo coloca invertido, va a poder usar el objetivo
seco débil (10 X) sin inconvenientes porque este objetivo hace foco mas o
menos a un centímetro de la preparación (que es una distancia superior al
espesor del portaobjetos), pero cuando usted pase al objetivo seco fuerte (40
- 45 X), con el que el foco optimo se logra a un milímetro de la preparación y
el portaobjeto tiene un grosor superior, la distancia focal quedaría dentro del
mismo vidrio que constituye el portaobjeto entonces al intentar enfocar
correctamente la imagen corre el riesgo de producir un daño. Este puede ser
de menor grado rompiendo el preparado o mayor, dañando el objetivo.

Coloque el preparado en la platina correctamente sujeto en su lugar con la


pinza y desplace el mismo moviendo el tornillo de la platina, sin mirar por el
ocular, hasta que la preparación interrumpa el haz de luz que proviene de la
fuente incorporada o externa. Una vez hecho esto aproxime, sin mirar por el
ocular, la lente frontal del objetivo al preparado (sí esta por usar el seco débil
- 10 X -, aproximadamente a 1 cm). Coloque y mantenga una mano en el
tornillo que desplaza a la platina y la otra en el tornillo macro o micrométrico
que mueven el objetivo y proceda a ajustar la distancia hasta lograr una
visión nítida del preparado. Recorra la totalidad del mismo tratando de
reconocer sus partes basándose en su conocimiento o a la comparación de un
atlas que usted puede mantener a su lado. Recuerde que los diagnósticos se
hacen con el objetivo seco débil (10 X) porque es un engaño creer que al usar
el objetivo seco fuerte Ud. va a entender mas, al contrario porque al usarlo
disminuye el diámetro del campo por lo tanto percibirá menos relaciones
menor cantidad de estructuras, de tejidos y aumentara su confusión.

Usted debe lograr un método de observación para ordenarse ... este pasará a
ser "su método" y así lo aplicará en todas las observaciones microscópicas que
realizará y ... tal vez en su vida. Usted recordará que le recomendamos
estudiar acompañado, pero la observación microscópica es una actividad
individual. Usted debe concentrarse, sumergirse en el preparado con sus 2
ojos abiertos como si estuviese contemplando un paisaje entonces verá
colores en gamas del rojo (eosina) y el azul (hematoxilina) pero si presta
atención identificará múltiples tonalidades, cada de una de ellas tiene una
explicación funcional (debe cuestionarse: porque se ve así?), desde un celeste
claro a un violeta, desde un rosa pálido a un rojo intenso. A modo de ejemplo,
si usted contempla un bosque en una mirada rápida verá todo
homogéneamente verde pero si usted observa en detalle identificará múltiples
tonos de verde que corresponden a diferentes plantas o diversos estado de las
mismas. Este procedimiento se incorpora conduciéndose como en una
investigación ... pero esta es "su investigación", con concentración y la pasión
de encontrar, de descubrir ... "el cómo" y "el porque".

Desde ahora deberá referirse como "eosinofilo" y "basofilo" y no como "rojito",


"violeta", etc. El uso del vocabulario adecuado no solo es obligatorio sino que
resulta útil porque uno puede reemplazar la frase: "eso medio violeta no muy
oscuro" por "eso basófilo".

A modo de ejemplo, un método seria comenzando por la parte de la luz (la


parte vacía), en caso de un órgano hueco o en caso de un órgano o tejido
macizo, por un borde nítido (no desgarrado) que uno piensa que corresponde
al borde natural del espécimen y luego introduciéndonos hacia el lado opuesto
en sentido perpendicular a la superficie.

Recuerde que verá un fondo eosinofilo en distintas tonalidades sin forma ni


limites dentro del cual podrá localizar formas bien definidas en tonalidades de
hematoxilina (basofilas) que corresponden a los núcleos. Es decir que todos
sus razonamientos deberá basarlos en esas manchitas azules, los núcleos. Si
mira bien verá que tienen intensidades diferentes del mismo color, formas,
tamaños y disposiciones particulares inclusive un mismo núcleo presenta
zonas más oscuras. Todas estas características responden a una actividad
funcional particular, no son productos del azar y por lo tanto estos aspectos
morfológicos son dirigidos por el propio código genético. Solo entonces
encontrará sentido a preguntarse ¿por qué?.

Usted debe elaborar su método personal para estudiar estos núcleos, por Ej.:
disposición en el tejido, tamaño, forma, aspecto de la coloración (homogénea,
en puntitos, concentrada en gránulos periféricos, etc.), presencia de un
granulo de mayor tamaño (nucleolo).

El primer tejido que atravesaría, seria un epitelio porque este recubre todo
nuestro cuerpo por afuera y por dentro de todas nuestras cavidades naturales.
Con el objetivo seco débil corroboro mi presunción al ver una línea violácea
formada por múltiples puntos muy cercanos unos a otros (en el epitelio no
existe sustancia intercelular, excepto el glucocalix), son los núcleos, solo
separados por sus correspondientes citoplasmas. El espesor de esta línea
violácea dependerá si el epitelio es simple o estratificado. Debajo de este
tejido encontraremos siempre un conectivo habitualmente laxo donde
veremos los pequeños vasos sanguíneos que nutren al epitelio que carece de
ellos.

Luego veremos diferentes tejidos y estructuras según cada preparado en


particular.

Usted deberá formarse una imagen tridimensional a partir de la visión


bidimensional que logrará ver con el microscopio óptico + el conocimiento
adquirido previamente + concentración + capacidad individual. Este es el
desafío. Además es un momento oportuno para ensayar relacionar la
morfología con la función. De usted depende.
 

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