CINETICA DE HIDRÓLISIS ENZIMATICA EN CARNE DE POLLO USANDO ALCALASA

Arismendi 1 , Urrutia 1 y Almonacid 1

1
12 Departamento de Ingeniería Química y Ambiental; Universidad Técnica Federico Santa María

15 Autores: C. Arismendi

Urrutia

Correo: cristobal.arismendi@gmail.com

18 Andres.urrutiaf@alumnos.usm.cl
 Resumen

En la presente investigación se realizo el estudio de una cinética de hidrólisis enzimática de

21 pechugas de pollo, conociendo el contenido proteico exacto de estas para fijarlo como la concentración

de sustrato para la reacción, con la enzima comercial Alcalasa 2.4 L, a través del método de Ph-Stat.

Se realizaron diferentes experiencias, variando la concentración de sustrato y manteniendo fija

24 la concentración de enzima añadida y viceversa, para ser analizados cualitativamente y luego evaluar

un modelo cinético de inhibición y ajustarlo al set de variables estudiadas.

Los datos obtenidos mostraron una presencia a enzima constante, de una inhibición de sustrato a

27 una concentración mayor de 50 g/L, observando una disminución en la velocidad inicial de la reacción

a mayores concentraciones de la señalada.

Analizando los datos a concentración de sustrato constante, se determino que la reacción

30 obedece a la cinética de Michaelis Menten, ya que la velocidad inicial de la reacción se comparo con la

concentración inicial de enzima y se encontró una relación lineal entre ellas, como corresponde en las

bioreacciones modeladas a través de esta cinética.

33 Se estudio la influencia de otras inhibiciones, concluyendo que la velocidad de reacción

disminuye a medida que disminuye la concentración de enlaces peptídicos y también que la

inactivación enzimática no sucede en la reacción.

36 Se dedujo un modelo desarrollado en base al modelo de la cinética química de inhibición por

sustrato el cual se trato de ajustar a las variables medidas, lo cual no se consiguió con buenos

resultados, por lo que se concluyo que suposiciones realizadas en la deducción del modelo fueron

39 erróneas.
 Introducción

42 La pechuga de pollo tiene un alto contenido proteico (22% en peso) y un bajo contenido de

grasas (3%) comparado con el tuto de pollo (18 % de proteínas y 5% grasa) y las alas (18% proteínas y

18% grasa) (TACO 2004). Además, la proteína de animal presenta un perfecto equilibrio de

45 aminoácidos esenciales que deben ser incluidos en la dieta ya que el organismo no es capaz de

sintetizarlos por sí mismo.

Según Barbut (2002), nuevos productos procesados de aves de corral (por ejemplo, las vienesas

48 de aves) han sido introducidos en el mercado en los últimos años, debido a los bajos precios de las

materias primas. Con el fin de ser competitivos, las industrias de aves de corral deberán desarrollar

nuevos productos para satisfacer las nuevas demandas de los consumidores y aumentar la rentabilidad.

51 Así, la hidrólisis de las proteínas de la carne de pollo podría ser una solución alternativa para obtener

productos con mayor valor agregado.

La hidrólisis de proteínas se puede lograr usando enzimas, ácidos o bases, pero la hidrólisis

54 enzimática es muy preferible a los métodos químicos para aplicaciones alimentarias. Las enzimas

proteolíticas se usan para disolver o descomponer la proteína muscular, lo que distingue dos fracciones,

la soluble y la insoluble. La fracción insoluble puede contener grasa y otros materiales no deseados y

57 puede ser utilizado en alimentos para animales. La fracción soluble contiene la proteína hidrolizada con

perfiles péptido bien definidos y un bajo contenido de grasa. Durante este proceso, los aminoácidos son

liberados, con esto mejora el sabor de la carne. Los hidrolizados de proteínas pueden ser utilizados

60 como potenciadores del sabor, ingredientes funcionales, aditivos o simplemente un potenciador de

alimentos con bajas de proteínas.

Los hidrolizados de proteínas se aplican principalmente en el manejo nutricional de las personas

63 que no pueden digerir todo / proteína intacta. Hidrolizados rico en péptidos de bajo peso molecular,
 sobre todo di y tri-péptidos con lo menos posible los aminoácidos libres, se ha demostrado que tiene

más usos dietéticos debido a sus altos valores nutricionales y terapéuticos (Bhaskar y otros, 2007). Las

66 proteínas hidrolizadas también muestran reducción de la reactividad inmunológica, y se puede utilizar

en las fórmulas para lactantes hipoalergénicos (Mahmoud, 1994). Por otra parte, los péptidos, que se

absorben fácilmente, pueden ser una fuente de nitrógeno en la nutrición para deportistas y péptidos de

69 alto valor biológico son atractivos como un suplemento de proteínas en general en una amplia variedad

de dietas (Sliyt y otros, 2005).

Proteólisis enzimática y la disolución de proteínas a partir de diversas fuentes han sido

72 ampliamente estudiados, como el del salmón rojo, el camarón de tratamiento de residuos, las víseras de

ovino, la carpa herbívora, y el caracol de barro (Sathivel y otros, 2005; Holanda y Netto 2006; Bhaskar

yotros, 2007, 2008; Wasswa y otros, 2007; Xia y otros, 2007). Sin embargo, hay poca información

75 disponible sobre la hidrólisis enzimática de la carne de pollo.

Las variables más importantes en la reacción enzimática son la concentración de la enzima y la

especificidad de la enzima, la temperatura de reacción y el pH y la naturaleza del sustrato proteico

78 (Adler-Nissen, 1985). Es importante saber cuál de estos factores son críticos, ya que la optimización de

los parámetros de proceso para la hidrólisis enzimática de la carne es esencial para desarrollar un

proceso económico y óptimo.

81 Como objetivo de la investigación se buscara encontrar un modelo que se ajuste a la cinética de

hidrólisis enzimática, y ver si es posible validarlo estadísticamente. También se analizaran

cualitativamente las experiencias más descriptivas y claras, con el fin de estimar el comportamiento de

84 sistema a diferentes concentraciones tanto de enzima como sustrato y ver posibles situaciones

presentadas en las reacciones de hidrólisis enzimática. Se evaluara el método experimental

cualitativamente para ver si es de fácil implementación y buena generación de datos validos.

87 Materiales y Métodos

Mecanismo de reacción planteado

El mecanismo de reacción planteado incluye inhibición por sustrato como se muestra en la

90 siguiente reacción.

93

96 donde E y S son las enzimas y sustratos libres; ES ES2 son complejos enzima sustrato; P es el producto

final; k1 ,k2 ,k3 ,k-1 ,k-3 son tasas de reacción.

Cabe destacar que es una reacción acompetitiva. La reacción correspondiente puede ser

99 determinada por la etapa de reacción irreversible:

dP
1. V0 = = k2 ES
dt

Al asumir que la reacción se encuentra en estado estacionario, el balance de masa para los

102 complejos [ES] y [ES2 ] pueden ser escritas según:

d ES
2. = k1 E S k 1 + k 2 ES k 3 ES S + k 3 ES 2 = 0
dt

d ES 2
3. = k 3 ES S k 3 ES 2 = 0
dt
105 Por lo que la concentración del complejo [ES2 ] se puede definir como usando la ecuación 3:

k3 ES S
4. ES 2 = ES S =
k 3 KI

donde:

k3
108 K1 = (constante de inhibición por sustrato)
k3

La cantidad de enzima inicial se encuentra presente en tres estado: libre E, formando el

complejo ES y formando el complejo ES 2 .

111 Por lo que, al utilizar las ecuaciones 2,28 y 2,32, la concentración de enzima libre [E] queda:

5. E = e ES ES 2

6. E = e ES ES 2

114 La concentración del complejo ES se determina utilizando la ecuación 2., usando las ecuaciones

4. y 6., esta se reordena formando la siguiente ecuación:

S e
7. ES = 2
S
S + + Km
KI

117 donde:

k 1 + K2
Km = (constante de Michaelis)
k1

Por lo que la variación de producto en el tiempo se define según:

 dP S Vmax
120 8. = 2
dt S
S + + Km
KI

donde:

Vmax = k2 * eo (velocidad máxima)

123 La tasa de reacción r será determinada por la reacción irreversible:

dx
9. r = S0 * = k2 * [ES]
dt

Si se asume estado estacionario y que la cantidad de enzima pre sente (e), se encuentra en forma

126 libre (E) y formando complejos (ES) y (ES 2 ), la ecuación anterior queda:

dx S Vmax
10.r = S0 * = 2
dt S
S + + Km
KI

Si el proceso de inhibición por sustrato controla la reacción:

2
S
129 11. K m + S
KI

La ecuación se reduce a

dx K 2 e0 K I
12. =
dt S0 S

132 Sabiendo que la cantidad de sustrato es igual al sustrato inicial menos el producto generado y

separando variables para su integración podemos obtener una relación algebraica que nos relaciona la

cantidad de producto con el tiempo:

 dP K 2 e0 K I dx
135 13. = 2
=S0 *
dt S0 S0 P dt

2 S0 P 2
14. S P
0 = K 2 e0 K I t
2

Por lo que se espera que, la tasa de reacción, a pH y temperatura constantes, dependa de la

138 concentración de enzima y sustrato iniciales en la mezcla a hidrolizar.

La variación del grado de hidrólisis en el tiempo, se representa como:

dx d DH
=
dt dt

141 La cantidad de producto obtenido, se puede medir utilizando el grado de hidrólisis (DH), ya que

este representa el porcentaje de péptidos hidrolizados; por lo que la variación del producto durante el

transcurso de la reacción se puede representar como:

dP d DH
144 = S0
dt dt

Las curvas de grado de hidrólisis versus el tiempo presentan un comportamiento exponencial.

Ellas indican que la tasa de reacción r disminuye al aumentar el tiempo de reacción y el grado de

147 hidrólisis. Esto puede ser modelado utilizando la siguiente expresión:

d DH K e K
= 23 0 2 I
dt S0 S0 P

P= S 0 DH

150 Separando variables e integrando se obtiene la siguiente expresión:

 S 03 DH 2
S 03 DH = K 2 e0 K I t
2

Materia Prima

153 Pechuga de pollo fresca fue adquirida de la empresa Faenadora Súper Pollo (Lo miranda y San

Vicente, Chile) y congelada para su posterior uso. Las características de la carne fue obtenida del

catalogo de la empresa según requerimientos de las actuales normas nacionales y se detallan en la

156 tabla 1.

Tabla 1

Característica (%)

Proteína Total 21,25%

Humedad 76,07%

Grasa 1,38%

Cenizas 1,27%

*Corresponde a la media pechuga de pollo. Deshuesada y sin piel. Con hematoma s leves.

159 Hidrólisis enzimática

El experimento se llevo a cabo en un reactor batch de 1000- mL con baño termorregulado y se

162 uso el método de pH stat, descrito por Adler-Nissen (1985). La materia prima fue descongelada y toda

la grasa y nervios visibles fueron extraídos, luego fue molida en un procesador de alimentos y

mezclada con 500- mL de agua destilada. La mezcla fue llevada a temperaturas y pH optimizados por
165 L.E. Kurozawa. K.J. Park, M.D. Hubinger (2008) en valores de 52,5 °C y 8,00 respectivamente. Se

variaron la proporción Enzima/Sustrato y Carne/Agua. Luego se añade la enzima diluida en 10-mL de

agua destilada y a 52,5 °C. Las pruebas consistieron en mantener constante el pH usando NaoH cada un

168 minuto los primeros 20 minutos y luego cada unos 5 minutos hasta generalmente completar la hora de

análisis. Luego se inactivo la enzima en un baño termorregulado a 90 °C por 15 minutos.

Determinación del grado de hidrólisis

171 EL grado de hidrólisis (DH) fue obtenido por el método pH-stat y definido como el porcentaje

del ratio entre los enlaces peptídicos aun disponibles (h) y los enlaces peptídicos iniciales (htotal)(Adler-

Nissen 1985). Se de acuerdo a la siguiente ecuación:

h B Nb
174 DH (%) = * 100 = * 100
htotal MP α htotal

Donde B es el consumo de NaOH (mL) para mantener el pH constante durante la reacción; N b

es la normalidad de la base; MP es la masa de proteína (g); htotal es el numero de enlaces peptídicos en

177 la proteína del sustrato (7,6 mEq/g); y α es el grado de disociación del grupo α-NH2 que se expresa

como:

1
α=
1+10 pH pK

180 Los valores de pK varían significativamente con la temperatura y pueden ser estimados como a

continuación (Kristinsoon y Rasco, 2000):

298 T
pK = 7,8 + * 2400
298 T

183 donde T es la temperatura (K).

 Ensayo de inactivación de enzima

Para probar la existencia o inexistencia de inactivación enzimática, se agrego enzima fresca pasados 1

186 hora de reacción y se sigue analizando con el mismo método (añadiendo base).

Ensayo de agotamiento de sustrato

Con el fin de estudiar la posibilidad de que exista agotamiento en la concentración de enlaces

189 peptídicos hidrolizables que afecta la cinética de la reacción, se añadió sustrato fresco pasados 50

minutos de reacción y se sigue agregando base como indica el método pH-stat.

192

195

198

201
 Resultado y discusión

204 Grado de hidrólisis

Los primeros experimentos fueron realizados con una concentración de enzima de 2,97 [g/L],

variando la concentración de sustrato. La figura 1. muestra las curvas correspondientes para 3

207 concentraciones de sustrato distintas.

Grado de Hidrolisis
Concentracion de sustrato variable e=2,21[g/l]
35,00
30,00
25,00
[S] [g/l] 45,9287848605578
20,00 [S] [g/l] 49,9185137884976
%DH

15,00 [S] [g/l] 50,5358268006481

[S] [g/l] 53,8842139902219
10,00
5,00
0,00
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000
tiempo [s]

Figura 1.

Nótese que al aumentar el contenido de sustrato el grado de hidrólisis la velocidad inicial de

210 reacción disminuyen; esto implica que el sustrato ejerce una acción negativa sobre el grado de

hidrólisis al llegar a cierta concentración, lo que da indicios de inhibición por sustrato.

Para comprobar esto se realiza un gráfico con las velocidades iniciales de la reacción (figura 2.)
 Velocidad Inicial vs Concentración inicial de Sustrato e
0,09
0,08
0,07
0,06
0,05
V[%/s]

0,04
0,03
0,02
0,01
0
45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55
S0 [g/l]

213 Figura 2.

De la figura 2 se deduce que la velocidad de reacción disminuye a concentraciones de sustrato

altas como consecuencia de la inhibición por sustrato. La máxima velocidad inicial, se observa a una

216 concentración de sustrato en un rango entre 46 y 50,5 g/L.

Para estudiar el efecto de la concentración de enzima sobre la cinética de la reacción, se

realizaron ensayos con concentración de sustrato constante (49,92 g/L) variando la concentración de

219 enzima como se muestra en la figura 3.

Grado de Hidrólisis
Concentración de enzima variable So=49,92 [g/L]
35,0

30,0

25,0 [E] [g/l]

2,0226024775909
20,0 [E] [g/l]
%DH

2,2175565654749
15,0 [E] [g/l]
2,24497978822644
10,0

5,0

0,0
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500
tiempo [s]

Figura 3.
222

Para demostrar que existe una dependencia (como se observa en la figura 4.) entre la velocidad

inicial de reacción y la concentración inicial de enzima, se comprueba que la reacción se comporta

225 según lo descrito por Michaelis y Menten.

Velocidad inicial vs Concentracion inicial de enzima Eo

0,1
0,09
0,08
0,07
0,06
V[%/s]

0,05
0,04
0,03 f(x) = 0,18x - 0,31
0,02 R² = 0,98
0,01
0
2 2,05 2,1 2,15 2,2 2,25 2,3
Eo [g/L]
Figura 4.

228 En general, al graficar el grado de hidrólisis versus el tie mpo, se observa que existe una velocidad de

reacción, esto se puede atribuir a uno de los siguientes fenómenos:

231 a. Una disminución en la concentración de enlaces peptídicos hidrolizables.

b. Inhibición enzimática

c. Inactivación enzimática

234
 Con el fin de estudiar la primera posibilidad, se realizo un experimento en el cual, durante la

reacción, se añadió sustrato (130g). Si existiese una disminución en la concentración de péptidos

237 hidrolizables, se observaría un aumento en el grado de hidrólisis después de la adicionó del sustrato

fresco (figura 5).

Grado de hidrolisis
Adición de sustrato
25,00

20,00

15,00
%DH

10,00

5,00

0,00
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500
tiempo [s]

240

Figura 5.

Existe un cambio notable en la reacción, por lo que la primera hipótesis es correcta.

243
 La inactivación enzimática, hipótesis c, se estudio agregando enzima fresca 1 hora después de

comenzada la reacción en un tiempo determinado como se muestra en la figura 6.

Grado de hidrolisis
Adición de enzima
25,00

20,00

15,00
Columna E
%DH

10,00

5,00

0,00
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000
tiempo [s]

246 Figura 6.

El gráfico sugiere que no existe inactivación enzimática para la reacción.

Determinación de Parámetros para Ajustar los Resultados Obtenidos

249 A partir de cada experiencia realizada se ajusto una curva para predecir su comportamiento y

luego poder comparar con el modelo planteado. Si se despejase el valor del grado de Hidrólisis para el

modelo planteado, en función de las demás variables, se podría obtener un modelo que correlacionara

252 las variables medidas en función del grado de hidrólisis.

En la tabla 2 se presentan el Parámetros de Ajuste para cada experiencia, estos debiesen estar en

255 función de las demás variables, vale decir, Eo, So y k 2 y K I (A = 2·k2 ·KI), entregando el valor de R2 .

Esto se realizo asignando un valor A talque genere la menor cantidad de error Cuadrático para los

tiempos medidos.
258 Tabla 2.

Experiencia Eo So A ΣR2 /n

2,02260248 49,7595428 16,1 1,4

2,21755657 45,9287849 6 0,96843245

2,21755657 49,9185138 11,2 1,19163112

2,21755657 50,5358268 6,3 0,51218133

2,21755657 53,884214 4,4 0,61308594

2,24497979 49,9185138 6,1 0,53821358

Los bajos valores de la suma de los errores cuadrados llevan a analizar que los ajustes

261 generados dan una buena aproximación de las cinéticas estudiadas. El las figuras 8 y 9 se muestran los

valores teóricos para los casos anteriormente estudiados (a sustrato constante y enzima constante

luego).

264

267
270 Figura 8

Figura 9

273

Observando las figuras presentadas, se ve que el comportamiento no es igual al presentado

experimentalmente, esto significa que ajuste desarrollado no es completamente valido y el modelo no

276 se puede validar estadísticamente con el ajuste planteado, por lo que se debe evaluar otra forma de

ajuste para poder validar el modelo y encontrar el parámetro que relacione correctamente al modelo

planteado.

279
 Conclusiones

El análisis cualitativo del comportamiento del grado de Hidrólisis en función de la

282 concentración de sustrato, revela una inhibición por sustrato, ya que al estimar las velocidades iniciales

a una concentración de enzima constante, en un momento al aumentar la concentración de sustrato, el

valor de la velocidad máxima empieza a descender, mostrando un comportamiento equivalente a una

285 inhibición por sustrato.

Por otro lado el comportamiento a sustrato constante, muestra que la reacción obedece la

cinética de Michaelis Menten, ya que se muestra una dependencia lineal de la concentración de enzima

288 en función de la velocidad máxima de reacción, situación que sucede en este tipo de cinéticas.

Se concluyo que la disminución de la velocidad de reacción, entre otros supuestos que no se

pudieron demostrar, es dependiente, de la concentración de enlaces peptidicos hidrolizables, debido a

291 que al agregar más sustrato (vale decir más enlaces peptidicos dispuestos a hidrolizarse) cuando la

reacción ya tiende a ser constante hacia un grado de hidrólisis, el sistema muestra una disminución

brusca del pH mostrando una aumento en la velocidad de Hidrólisis a la llevada a ntes de la adición de

294 mas sustrato. Esto indica el aumento de concentración de enlaces posibles de hidrolizar.

También esta disminución de la velocidad se concluyo que no depende de una inactivación

enzimática, ya que al agregar más enzima cuando la ciné tica lleva un tiempo donde la velocidad del

297 grado de hidrólisis se torna constante, el comportamiento sigue igual por lo que todavía la enzima está

trabajando con la misma actividad, solo que la disminución del sustrato disponible a hidrolizar genera

que no pueda tener una mayor velocidad.

300 El ajuste realizado en base al modelo desarrollado, no entrega buenos resultados comparables

con los estudios experimentales, pudiendo implicar un mal desarrollo estadístico del modelo, asignando

parámetros de ajuste inadecuadamente, o que las hipótesis planteadas, para la determinación del
303 modelo no son completamente correctas y es más conveniente desarrollar el modelo con una

descripción completa y sin despreciar términos en los balances y expresiones desarrolladas.

La configuración del equipo utilizado permitió controlar la reacción de hidrólisis enzimática de

306 proteínas, de forma relativamente sencilla y precisa; sin embargo, si no se realiza una mezcla

homogénea agua-pollo, los resultados obtenidos cambian considerablemente y afectan la

reproducibilidad de los mismos. Un sistema automático de titulación, permitiría obtener datos más

309 precisos del grado de hidrólisis.

El mecanismo de la hidrólisis enzimática de proteínas de pechuga de pollo, es un conjunto de

reacciones en paralelo que involucran inhibición acompetitiva por sustrato. La inhibición por sustrato

312 se presentó a concentraciones superiores a 50 g/L, donde a máxima velocidad alcanzada en este punto

fue de 0,089 % DH/s.

La homogenización de la mezcla, durante el proceso de reacción, es un parámetro importante

315 que debe ser estudiado para optimizar los costos de operación, ya que la viscosidad de la mezcla

cambia con el tiempo.

Los hidrolizados obtenidos deben ser analizados para determinar la d istribución de pesos

318 moleculares, y así, poder estimar los parámetros operacionales, que maximicen la producción de

péptidos con las características deseadas.

321
324 Referencias

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UNICAMP. 42 p. (in Portuguese).

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342