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GUÍA DE PRÁCTICA
PROGRAMA DE PREGRADO DE MEDICINA-PPM
MICROBIOLOGÍA MÉDICA
CICLO: IV
PLAN DE ESTUDIOS: 2014-II
SEMESTRE ACADEMICO: 2020-I
Código MEH-OT-01
Versión V.2
MICROBIOLOGÍA MÉDICA Documento de Aprobación
Fecha de Aprobación 09-07-2018
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PRÁCTICA N° 1
BIOSEGURIDAD
INTRODUCCION
La seguridad en el laboratorio se puede definir como: "La situación carente de riesgo o con un riesgo
limitado, que resulta del cumplimiento de un conjunto de normas y prácticas para lograr este fin"
1. Medidas generales de seguridad Barrera La seguridad como prevención viene definida por
una serie de barreras. Si estas fallan y ocurre un accidente, es preciso efectuar un
tratamiento precoz y adecuado para evitar un daño mayor y posteriormente hacer un
diagnóstico del fallo.
Las barreras se rompen por fallos humanos y/o errores mecánicos.
Barreras primarias: Las localizadas en tomo al origen del riesgo, como son: - Contenedores,
equipo e instrumental correcto y "buena práctica” (la técnica de trabajo ordenada v rigurosa
es probablemente la mejor protección que existe) - Uso de desinfectantes y cabinas de
seguridad.
Presuponer que todos los pacientes están potencialmente infectados por HIV u otros
patógenos transportados por la sangre.
Las heridas en las manos deben vigilarse, ya que pueden ser una puerta de entrada a la
infección. En caso de tenerlas, deben cubrirse adecuadamente con material resistente al
agua.
Lavarse a conciencia las manos y otras superficies de la piel tras quitarse los guantes e
inmediatamente después de cualquier contaminación.
Barreras terciarias: Localizadas alrededor del laboratorio: Evitan que los riesgos de
laboratorio puedan repercutir en la comunidad.
Ningún material tóxico o infeccioso abandone el laboratorio.
Acceso restringido a determinadas áreas de laboratorio.
Contenedores especiares para material bio-peligroso, autoclaves e incineradores para
desechos contaminados.
Acceso al laboratorio únicamente al personal capacitado.
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Agentes antisépticos: son germicidas químicos para la utilización en la piel como por ejemplo;
alcohol, iodóforos, etc.
Agentes esterelizantes: destruyen toda forma de vida incluidas las esporas. Por ejemplo: los
sistemas de autoclave, calor seco, óxido de etileno.
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II. OBJETIVO
1. Conocer las medidas de bioseguridad necesarias que se debe cumplir en el laboratorio para
disminuir el riesgo biológico.
2. Familiarizar al alumno con el uso correcto, de las medidas de barrera necesarias para trabajar en
bioseguridad.
III. MATERIALES
IV.CUESTIONARIO:
PRÁCTICA N° 2
MICROSCOPIA: ESTUDIO Y MANEJO DEL MICROSCOPIO
I. OBJETIVO
1. Conocer e identificar correctamente las partes ópticas y mecánicas del microscopio compuesto.
II. MATERIALES
Microscopios
PARTE MECANICA
PARTE OPTICA
Ocular
Lentes de condensador
Objetivos
Diafragma
Espejo
IV. SISTEMAS QUE COMPRENDE EL MICROSCOPIO
1. Sistema de soporte: comprende el brazo, el pie, el tubo ocular, el revólver y la platina.
2. Sistema de Iluminación: comprende el foco, condensador y diafragma.
3. Sistema de Ajuste: comprende el macrométrico, micrométrico y cremallera
4. Sistema de Aumento: comprende el ocular generalmente de 10 x , 15 x, y los objetivos de 4x, 10,
20x, 40, y 100x.
V.CUESTIONARIO
1. Cuantos tipos de microscopios hay? Y cuáles son?
2. ¿Esquematiza los tipos de microscopios?
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PRÁCTICA N° 3
INTRODUCCIÓN
A) Aquellos en los cuales el ion portador del color (cromóforo) es el anión llamados colorantes ácidos
Ej. Eosinato de sodio ó Eosina.
B) Aquellos cuyo cromóforo es el catión llamados colorantes básicos Ej. Cloruro azul de metileno.
C) Los colorantes neutros, compuestos por básicos y ácidos Ej. Hematoxilina (básico) Eosina (ácido).
En los trabajos bacteriológicos generalmente se usan colorantes básicos como el azul de metileno,
cristal de violeta, fucsina básica, safranina, todos ellos pertenecen al grupo de los colorantes
derivados de la anilina. Las coloraciones pueden ser según el número de colorantes que utilizan:
A) Simples: cuando se utiliza un solo colorante como el Azul de metileno, Tinta China, Azul de
lactofenol
B) Diferenciales: cuando utilizan más de un colorante como la coloración de Gram, y Ziehl - Neelsen.
C) Especiales: cuando se usan colorantes que permiten reconocer ciertas estructuras celulares
como la coloración de Leishman, Vago, Hiss (para capsula), Wirtz conklin (para espora) ,Albert,etc.
1. REALIZACIÓN DE LA EXTENSLÓN
2. SECADO
Dejar secar por sí solo el frotis. Se puede acelerar la desecación calentando ligeramente con un
mechero Bunsen, pero sin calentar jamás brutalmente.
3. FIJACIÓN Cuando la extensión esté bien seca, proceder a la fijación. Sólo algunas coloraciones
especiales no deben ir precedidas de una fijación. Él motivo de la misma es hacer adherir el
frotis al portaobjetos y fijar la morfología de las bacterias, células, por coagulación rápida de las
proteínas.
Alcohol flameado: Es la técnica más general. Verter sobre la preparación algunas gotas
de alcohol absoluto. Después de algunos segundos de contacto, escurrir lo mejor posible
e inflamar después el alcohol restante.
Por el calor: Aplastar la llama de un mechero Bunsen 2 a 3 veces contra la parte inferior
de la preparación, que sujetaremos con unas pinzas. Este método debe rechazarse para
los productos patológicos puesto que altera la morfología de los elementos celulares.
Por el alcohol en frío: Recubrir la preparación con alcohol etílico absoluto o metílico.
Dejar actuar 1 o 2 minutos. Escurrir y dejar secar.
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Las preparaciones coloreadas se examinan con el objetivo de inmersión (100x) sin usar
cubreobjetos. Depositar sobre el frotis una gota de aceite de inmersión. Descender primero el
objetivo de 10 x, una vez enfocado pasar al lente de 100 x sumergiéndolo en la gota, comprobar el
enfoque microscópico con el tornillo micrométnco.
OBJETIVO
A. COLORACIONES SIMPLES
Son aquellas coloraciones que utilizan un solo colorante para visualizar la morfología de los
microorganismos.
MATERIAL
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B. COLORACIONES DIFERENCIALES
Son aquellas coloraciones que utilizan más de un colorante y, generalmente el segundo colorante
es llamado colorante de contraste. Entre los más usados tenemos la coloración de Gram y la de Ziehl
Neelsen o también llamado ácido- alcohol resistente
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COLORACIÓN DE GRAM
Es una coloración diferencial que permite diferenciar a las bacterias en Gram positivas y Gram
negativas, según la estructura y composición de la pared celular. En las Gram negativas, el
peptidoglucano tiene una sola capa y las cadenas no están entrelazadas; en las Gram positivas la
mayoría presenta muchas capas de peptidoglucano. Existen varias modificaciones del Gram, una de
ellas es la de Kopeloff
MATERIAL
RESULTADOS
Las bacterias Gram positivas se colorean de violeta y las bacterias Gram negativas de color rosado.
CUESTIONARIO:
1. ¿Por qué la Escherichia coli puede adquirir el color de la Fucsina?¿De qué está compuesta
su pared celular?. Explique brevemente.
2. ¿Por qué el Staphylococcus aureus adquiere el color del cristal violeta y no el de la
Fucsina? ¿De qué está compuesta su pared celular? Explique brevemente.
PROTOCOLO:
PRÁCTICA N° 4
INTRODUCCIÓN
Coloración diferencial que permite la tinción de microorganismos que poseen elevado contenido
de lípidos, como el género Mycobacterium (bacilo tuberculoso), llamados también ácido-alcohol
resistente. Al teñirse los microorganismos con el colorante primario (fucsina básica fenicada) que
es soluble en sustancias lipoides y aplicando el calor, el colorante es forzado a penetrar en la célula
y en esta forma resistir a la decoloración.
MATERIAL
PROCEDIMIENTO
1. Cubrir con fucsina fenicada el frotis realizado en la lámina y calentar la preparación con el
mechero de alcohol hasta apreciar el desprendimiento de vapores, repetir este procedimiento por
tres veces, evitando que hierva el colorante.
3. Decolorar con alcohol ácido hasta que se aprecie una coloración rosada.
RESULTADO Las bacterias ácido alcohol resistentes se tiñen de color rojo y las no ácido alcohol
resistentes se tiñen de color azul.
CUESTIONARIO:
1. ¿Porqué el bacilo de Koch se tiñe con la fucsina fenicada y no con el azul de metileno? ¿De
qué está compuesta su pared celular?. Explique brevemente.
2. ¿Qué otros microorganismos son considerados dentro de la clasificación de ser BAAR?
PRÁCTICA N° 5
COLORACIÓN ESPECIAL
INTRODUCCIÓN
Son coloraciones especiales que permiten colorear algunas bacterias que no tienen afinidad con los
colorantes de anilina como: las espiroquetas. Así como también la coloración de microorganismos
presentes en la sangre.
COLORACIÓN DE LEISHMAN
MATERIALES
PROCEDIMIENTO
COLORACIÓN DE VAGO
MATERIALES
Lámina portaobjetos
Palito mondadientes
Solución fisiológica al 0.85%
Set de coloración de Vago: Mercurio cromo al 2% y Violeta de genciana
Asa de siembra en aro
Microscopio con lentes de 100X
Aceite de inmersión
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PROCEDIMIENTO
2. Con el palito mondadientes obtener una muestra de sarro dentario y realizar un frotis en capa
fina extendiendo en sentido espiral de adentro hacia fuera.
RESULTADOS
1) Preparar un frotis
2) Cubrir con Fucsina básica y calentar hasta el desprendimiento de vapores por 30 segundos 3)
Lavar con solución acuosa de Sulfato de cobre al 20%.
RESULTADOS
Hiss : El cuerpo bacteriano de Bacillus anthracis se observa de color púrpura y la cápsula de color
claro o incoloro.
1) Preparar un frotis
2) Cubrir con verde de malaquita y calentar hasta el desprendimiento de vapores por 5 minutos
(adicionar colorante cada vez que falte) 3) Lavar con agua corriente
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RESULTADO
Wirtz Conklin: El cuerpo bacteriano de Bacillus sp. se observa de color rosado y la espora de color
verde
COLORACION DE ALBERT
Los gránulos metacromáticos conocidos también como de volutina, son material de reserva de
polifosfato, se distribuyen en el citoplasma, preferentemente en los extremos del bacilo, se tiñen
de color azul intenso y el soma bacteriano se observa muy débilmente.
PROCEDIMIENTO
2. Cubrir con la Solución A de Albert (Azul de toluidina, verde de metilo, ácido acético, alcohol
etílico, agua destilada) por 3 a 5 minutos.
4. Cubrir con la Solución B de Albert (yodo metálico, yoduro de potasio, agua destilada) por 1
minuto.
RESULTADO
En la coloración Albert observar la bacteria Corynebacterium sp. color verde y los gránulos de color
azul oscuro
PROTOCOLO:
PRACTICA N° 6
INTRODUCCION
De acuerdo a su consistencia
Líquidos: Son los que se presentan en este estado, denominándose por esta razón caldos. El medio
líquido más utilizado es el llamado caldo nutritivo, compuesto principalmente de extracto de carne,
peptona y agua. Se utiliza fundamentalmente cuando se pretende la obtención de una suspensión
bacteriana de una determinada concentración.
Semisólidos: Se preparan a partir de los medios líquidos, agregando a éstos un agente solidificante
en una proporción menor que para preparar medios sólidos. Uno de sus usos es la investigación de
la movilidad de las bacterias
Sólidos: Se preparan a partir de los medios líquidos, agregándoles un agente gelificante , el agar.
Agar-agar: Es un polímero de azúcares obtenido de algas marinas. Se trata de una molécula insoluble
en agua pero soluble en agua caliente; una solución al 1,5% p/v forma un gel firme entre 32 y 39ºC
y no se funde por debajo de 85ºC. Funde a 90ºC y solidifica una vez fundido alrededor de los 45ºC.
Tiene el inconveniente de que introduce compuestos orgánicos indefinidos que pueden falsear los
resultados de las necesidades nutritivas de un microorganismo. Especialmente útiles para el
aislamiento de bacterias y observación de colonias, contienen de 2 a 3 % de agar
SEGÚN SU UTILIZACIÓN.
1) Medios Simples: Son aquellos que poseen los componentes mínimos para que pueda producirse
el crecimiento de bacterias que no necesiten requerimientos especiales. El medio más conocido de
este grupo es el agar nutritivo o agar común, que resulta de la adición de agar al caldo nutritivo.
Otros representantes de este grupo son el agar triplicase de soja, el agar Columbia, etc.
2) Medios de enriquecimiento: Son aquellos que, además de las sustancias nutritivas normales,
incorporan una serie de factores indispensables para el crecimiento de microorganismos exigentes.
Este enriquecimiento se hace por adición de sangre u otros productos biológicos (sangre, suero,
leche, huevo, bilis, etc.) que aportan dichos factores.
3) Medios selectivos: Son medios utilizados para favorecer el crecimiento de ciertas bacterias
contenidas en una población polimicrobiana. El fundamento de estos medios consiste en facilitar
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MATERIALES
PROTOCOLO
PRACTICA N° 7
INTRODUCCION
La siembra por estría, por dispersión agotamiento, por inoculación y por puntura.
MATERIALES
PROCEDIMIENTO
A) TIPOS DE SIEMBRA
Siembra por estría: Diseminar en forma de zigzag, una pequeña cantidad de muestra bacteriana
sobre la superficie del medio de cultivo sólido con la ayuda de un Asa de siembra en aro. Ejemplo
agar urea, citrato, TSI, LIA
Siembra por puntura: Sembrar la muestra bacteriana en un tubo con Agar semi-sólido, con ayuda
del Asa de siembra en punta, introduciéndola en forma vertical hasta la mitad de Agar.
Siembra por inoculación: Con ayuda de un Asa en aro, tomar una muestra bacteriana e
introducirlo hasta el fondo del tubo con medio líquido, procurando no tocar las paredes del tubo.
Ejemplo los medios en caldo MR VP,PEPTONA, NUTRITIVO
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B) LECTURA:
PRACTICA N° 8
METABOLISMO BACTERIANO
INTRODUCCION
Las bacterias se diferencian por los hidratos de carbono que utilizan, los tipos y cantidades de ácidos
mixtos producidos, dando como resultado la acidificación del medio, el cual es visible por el cambio
de color en el medio de cultivo de fermentación (pH- indicador); la presencia de gas (CO2 e H+) se
manifiesta por la presencia de burbujas o rotura del medio sólido.
EL medio TSI fue diseñado para la diferenciación de Bacilos Gram negativos, basándose en la
capacidad potencial de estas bacterias para fermentar carbohidratos y producir sulfuro de
hidrógeno (H2S).
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Los patrones de comportamiento de los bacilos Gram negativos ante los carbohidratos presentes
en este medio pueden ser fundamentalmente tres: 1. Fermentación de glucosa únicamente.
3. No fermentación de carbohidratos.
Como producto de la fermentación de los diferentes carbohidratos se puede formar gas, que se
detecta como pequeñas burbujas o grietas en el medio o por desplazamiento del mismo hacia arriba
del tubo.
El medio tiene incorporado tiosulfato de sodio como fuente de azufre para generar H2S, y sales de
hierro que al reaccionar con el gas forman un precipitado negro insoluble de sulfuro ferroso (FeS).
MATERIAL
Tubo con medio TSI en plano inclinado con Cepas control: E. coli, S. aureus, Ps. Aeruginosa
PROCEDIMIENTO
1. Con el asa de siembra inocule una porción pequeña de la colonia en el centro del tubo y estríe la
superficie del pico de flauta.
INTERPRETACION
5. Producción de gas: Formación de burbujas (CO2 e H+), grietas o desplazamiento del medio.
La prueba de Rojo de metilo es una prueba cuantitativa que proporciona una característica valiosa
para identificar especies bacterianas que producen ácidos fuertes (láctico, acético, fórmico) a partir
de glucosa. Estas bacterias que primariamente siguen la vía de fermentación de ácidos mixtos
frecuentemente producen suficiente ácido después de una incubación prolongada, como para
mantener un pH por debajo de 4.4 (el punto ácido límite del indicador rojo de metilo), superando el
sistema amortiguador del pH del medio.
MATERIALES
PROCEDIMIENTO
INTERPRETACION
1. Para la prueba Rojo de Metilo, añadir al cultivo unas gotas del reactivo del mismo nombre,
cuyo rango de viraje está entre pH 4.4(rojo) y 6.0 (amarillo).
La prueba positiva se manifiesta de color rojo estable y la negativa de color amarillo-
naranja.
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2. Para la prueba de Voges- Proskauer, agregar al cultivo 0.6 ml(12 gotas) de Alfa naftol y 0.2
ml (4 gotas) de KOH. Agitar el tubo por 1 minuto y dejarlo en reposo durante 15 minutos. Es
importante añadir los reactivos en el orden específico.
Una prueba positiva, color rojo localizado en la mitad superior o en todo el tubo es
observada dentro de los primeros 15 minutos. Si la lectura se realiza después de una hora
los cultivos pueden presentar un color cobrizo, siendo esta una interpretación falsa positiva.
En la prueba negativa no cambia el color inicial del medio de cultivo.
Las bacterias que poseen la enzima triptofanasa son capaces de actuar sobre el aminoácido
triptofano, produciendo indol, un benzil pirrol, ácido pirúvico y amoniaco(NH3). El indol puede
detectarse en un medio rico en triptofano, observando la aparición de un color rojo(en forma de
anillo o impregnado en la tira de papel), luego de agregar una solución que contiene p-
dimetilaminobenzaldehido
MATERIALES
PROCEDIMIENTO
La aparición de un color rojo fucsia brillante en la interfase del reactivo y el caldo, pocos segundos
después de haber agregado el reactivo es indicativo de la presencia de indol y constituye una prueba
positiva. Las bacterias que ha pesar de desarrollar en el medio, pero que no producen indol, al
agregar el reactivo, este aparecerá sin cambio alguno, siendo esta una prueba negativa.
PRINCIPIO
La utilización del citrato por una bacteria se detecta por su crecimiento en un medio con citrato con
formación de subproductos alcalinos. El medio (Citrato de Simmons) incluye citrato de sodio, un
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anión como única fuente de carbono y fosfato de amonio como única fuente de nitrógeno. Las
bacterias que pueden utilizar citrato también pueden extraer nitrógeno de la sal de amonio, con
producción de amonio(NH3), alcalinizando el medio por conversión del NH3 en hidróxido de
amonio(NH4OH), detectándolo con el indicador de pH incorporado el azul de bromotimol cuyo
rango de viraje esta entre pH 6.9(verde) y pH 7.8(azul).
MATERIALES
PROCEDIMIENTO
1. Con el asa de siembra bien esterilizada, sembrar por la técnica de estría en cada tubo la cepa
citarto positiva y negativa.
INTERPRETACION
Prueba positiva: Color azul en 24 a 48 horas y crecimiento en la superficie del medio inclinado.
Prueba negativa: No hay cambio de color ni crecimiento.
Prueba importante para la identificación de especies bacterianas que poseen la enzima ureasa que
hidroliza la urea, según el siguiente esquema:
MATERIALES
PROCEDIMIENTO
1. Por medio de la siembra por estría, sembrar la cepa positiva y negativa. No inocular en el fondo.
2. Incubar durante 18- 24 horas a 37°C
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INTERPRETACION
Prueba positiva: se observa de color rosado en la superficie o en todo el medio. Prueba negativa: El
medio permanece del color original
V. PRUEBA DE LA CATALASA
La catalasa es una enzima que poseen la mayoría de las bacterias aerobias y facultativas
anaerobias. El peróxido de hidrógeno (H2O2) es uno de los productos finales del metabolismo
oxidativo de los carbohidratos y sí se acumula es letal para el microorganismo. La catalasa convierte
el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno de acuerdo a la siguiente reacción:
MATERIALES
PRUEBA EN LÁMINA
a) Con el asa bacteriológica en punta o un aplicador estéril, picar el centro de una colonia bien
aislada y transferir él inoculo a un portaobjetos limpio.
PRECAUCIONES
1. El orden de la prueba en lámina no debe invertirse cuando se use asa de platino, ya que puede
resultar falso positivo. El alambre de nicrome no interfiere en el resultado de la prueba.
2. La prueba debe realizarse en cultivos de 18- 24 horas; cultivos más viejos pueden perder su
actividad de catalasa dando una reacción falsa negativa.
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3. El H2O2 es extremadamente acústico, por lo que se debe evitar que toque la piel, en caso que
ocurra inundar el área afectada con alcohol de 70% para neutralizar la acción. NO DEBE USARSE
AGUA.
INTERPRETACION
Los citocromos son hemoproteínas que contienen hierro y actúan como el último eslabón de la
cadena respiratoria aerobia, transfiriendo electrones (H) al oxígeno con formación de agua. El
sistema citocromo se encuentra en los organismos aerobios o anaerobios facultativos, permitiendo
identificar a organismos que carecen de la enzima o son anaerobios estrictos. En el laboratorio se
hace reaccionar la bacteria con un sustrato oxidable como el dimetil o tetrametil- p- fenilendiamina
( el cual se presenta en solución, discos o tiras llamados comúnmente oxidasa).
MATERIAL
PROCEDIMIENTO
1. Directo: Se añaden a las placas sobre la bacteria dos o tres gotas del reactivo.
2. Indirecto: Se toma con el asa un poco de la colonia bacteriana y se extiende sobre los discos o
tiras de papel que tienen ya el reactivo de oxidasa
purpura. Por contener una pequeña cantidad de glucosa (1g/L) al ser fermentada el fondo del tubo
es amarillo y la superficie alcalina
Algunos microorganismos son capaces de producir una serie de enzimas y sustancias tóxicas que
pueden ser detectadas al sembrar el microorganismo en una placa de Agar sangre, produciendo la
lisis de los eritrocitos, según el tipo de lisis que producen pueden clasificarse en tipo Alfa, Beta y
Gamma.
MATERIALES
Cepa bacteriana
Placas con Agar sangre de carnero
PROCEDIMIENTO
INTERPRETACIÓN
Hemólisis tipo Alfa: Es un tipo de hemólisis incompleta, hay un enverdecimiento del medio debido
a la salida de un derivado del tipo de la metahemoglobina, que es oxidado a compuestos del tipo de
la biliverdina
Hemólisis tipo Beta: Hay una lisis completa de los eritrocitos observándose una zona clara alrededor
de la colonia
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VIII. PROTOCOLO
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PRACTICA N° 9
INTRODUCCION
Es una prueba de laboratorio clínico que se utiliza para medir la actividad antibacteriana de los
antibióticos y quimioterapéuticos empleados en el tratamiento de las enfermedades infecciosas. La
medida de la actividad antibacteriana puede realizarse por los siguientes métodos:
Método de dilución
Método de Difusión en Agar
OBJETIVOS
DILUCION EN TUBO
Consiste en la preparación de una serie de diluciones del antibiótico estudiado en caldo o en medio
agar al cual se inocula luego una suspensión del germen. Luego de una incubación por 24 horas, se
puede observar la CIM como la dilución más alta en la que no existe crecimiento macroscópico
bacteriano. Esta técnica es costosa por la cantidad de material que se utiliza.
filtro que contienen los antibióticos y que después de una incubación de 24 horas, se observan las
zonas de inhibición alrededor de cada disco de antibiótico. La cantidad de antibiótico presente en
el disco difiere para los distintos fármacos.
MATERIALES
PROCEDIMIENTO
2. Sumergir la torunda en el caldo bacteriano, escurrir en las paredes del tubo y sembrar
uniformemente sobre la superficie de la placa de Agar.
4. Con la pinza en condiciones estériles, colocar los discos impregnados con los diferentes
antimicrobianos sobre la superficie del Agar. La distancia entre los discos debe ser de 20mm. 4.
Incubar a 37°C durante 24 horas.
LECTURA
PROTOCOLO
PRACTICA Nº 10
INTRODUCCION
MATERIALES
Placas Petri con Agar hipertónico de Chapman (MH) o Manitol salado
Placas Petri con Agar sangre (AS)
Tubos con Caldo plasma
Láminas portaobjetos
Set de colorantes para Gram
Asa de platino en aro
Reactivo Catalasa
PROCEDIMIENTO:
1. Estudiar la bacteria sembrada en las placas con Agar hipertónico de Chapman y Agar
sangre, por el método de dispersión-agotamiento y con 24- 48 horas de incubación a 37°C
2. Realizar un frotis de las placas sembradas y colorearlas con Gram.
3. Observar placas sembradas con las diferentes especies de Staphylococcus, estudiando las
características de las colonias en medios de Agar sangre y Agar Hipertónico de Chapman
(tamaño, forma, pigmento, hemolisis, etc.)
4. De la placa con Agar sangre y Agar Hipertónico de Chapman, tomar una asada de una
colonia de color amarillo e inocularlo el tubo con caldo plasma e incubar a 37ºC (Prueba de
la coagulasa)
5. Realizar la prueba de la Catalasa.
6. Agar hipertonico de Chapman o manitol salado contiene: Manita, Cloruro de sodio al 6.5%
y como indicador de pH el rojo de fenol
7. Sembrar las especies en una placa Petri con disco de novoviacina
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RESULTADOS:
PROTOCOLO:
GENERO STREPTOCOCCUS
INTRODUCCION
Los Streptococcus desarrollan en medios enriquecidos como el Agar sangre, que permite
diferenciar algunas especies en base a la hemólisis producida. La hemolisis tipo es
incompleta, los glóbulos rojos que rodean a la colonia son parcialmente dañados pero no
lisados como sucede en la hemolisis tipo . Existe un reverdecimiento del medio debido a la
salida del eritrocito de un derivado del tipo de la metahemoglobina, que es oxidado a
compuestos como la biliverdina. El grupo de estreptococos alfa hemolíticos se denominan
S. viridans. La mayoría de Streptococcus pueden desarrollar en presencia o ausencia de
oxígeno. Diversas pruebas bioquímicas permiten la diferenciación de las especies de
Streptococcus.
MATERIAL
Cultivo de Streptococcus en medio de caldo BHI
Placas con Agar sangre de carnero
Torunda estéril y bajalengua
Tubos con Thioglicolato
Tubos con caldo Inulina
Discos de Bacitracina
Discos de Optochin
Solución de Desoxicolato al 2%
Tubo con ClNa al 6.5%
Láminas portaobjetos
Set de colorantes de Gram- Kopeloff
Asas de Kolle, pinzas
Microscopio, aceite de inmersión.
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PROCEDIMIENTO
LECTURA
1. En Agar sangre, S. pyogenes y S. agalactiae son beta- hemolíticos; S. viridans y S.
pneumoniae son alfa- hemolíticos. Realizar el frotis de las colonias y colorear por Gram.
2. Respecto a la sensibilidad a la Bacitracina y Optochina: S. pyogenes es sensible a la
Bacitracina y S pneumoniae es sensible a la Optochina
3. Agregar una gota del Desoxicolato de sodio al 2% sobre una o varias colonias en la placa
de Agar sangre e incubar a 35°C durante 30 minutos. En una reacción positiva se observa
que las colonias son lisadas (desaparecen)
4. Observar que solo S. pneumoniae metaboliza la Inulina.
5. Observar el desarrollo en el medio de Thioglicolato. Este medio es usado para determinar
el efecto del O2 sobre las bacterias (Aerobio, Anaerobio, Facultativo), contiene Agar 0.075%
y ácido tioglicolato que actúa como agente reductor disminuyendo aun más el potencial de
oxido-reducción del medio.
6. En la solución de ClNa al 6.5% , observar que sólo desarrolla Enterococo (Grupo D)
7. Todas las especies del género Estreptococo son catalasa negativa
PROTOCOLO
Realizar un protocolo de trabajo de la práctica realizada
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PRACTICA Nº 11
INTRODUCCION
Las Neisserias son cocos Gram negativos, que se presentan característicamente en pares,
con los lados adyacentes aplanados, simulando “granos de café”. Comprende varias
especies, entre éstas N. gonorrhoeae, y N. meningitidis, causan frecuentemente
enfermedad significativa en el hombre. En muestras clínicas del tracto urogenital u otras, se
tiñen adicionalmente con el colorante azul de metileno, observándose las Neisseria intra y
extracelularmente.
Todas las especies producen catalasa y Citocromo- oxidasa, que permiten diferenciarlos de
otros microorganismos morfológicamente similares.
La diferenciación bioquímica se realiza por pruebas de utilización de hidratos de carbono:
Glucosa, maltosa, sacarosa y lactosa.
MATERIALES
Placa con Agar Thayer Martin sembrada con Neisseria
Placa con Agar chocolate sembrada con Neisseria
Lámina control con frotis de Neisseria coloreada con Gram
Reactivo de Citocromo- oxidasa
Reactivo de catalasa
Solución fisiológica al 0.85%
Láminas portaobjetos
Set de coloración de Gram
Colorante de Azul de metileno
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Microscopio
Asas de siembra en aro y punta
Solución de alcohol yodado
Algodón y alcohol isopropilico
METODOLOGIA
1. Observar en el medio de Thayer Martin y Agar chocolate, las colonias pequeñas, circulares
de bordes continuos, blanco- grisáceos, convexas, brillantes o ligeramente opacas si
corresponden a N. gonorrhoeae y si es N. meningitidis colonias pequeñas de borde entero,
circulares, translúcidas o ligeramente opacas.
2. Dejar caer una gota del reactivo de oxidasa sobre una colonia y observar entre los 2- 3
minutos el cambio de color del rosado al marrón o negro, que corresponde a una prueba de
oxidasa positiva.
3. Realizar un frotis de la colonia oxidasa positiva y colorearla por el Gram. Comparar con la
lámina control.
4. Realizar un frotis de la muestra clínica de secreción endocervical y colorearla con el azul
de metileno.
PROTOCOLO
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PRACTICA Nº 12
INTRODUCCION
MATERIALES
Placas Petri con Agar nutritivo
Placas Petri con Agar sangre
Tubos con Caldo nutritivo
Tubos con Agar semisólido
Tubos con gelatina
Láminas para frotices
Set de coloración de Gram
Set de coloración de Hiss para cápsula
Set de coloración de Wirtz Conklin para esporas
Asa de Kolle
PROCEDIMIENTO
1. Sembrar la muestra en placas de Agar sangre, Agar nutritivo, caldo nutritivo y gelatina.
2. Preparar frotices para colorear con Gram, Hiss, y Wirtz Conklin.
1) Preparar un frotis
2) Cubrir con Fucsina básica y calentar hasta el desprendimiento de vapores por 30
segundos
3) Lavar con solución acuosa de Sulfato de cobre al 20%.
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1) Preparar un frotis
2) Cubrir con verde de malaquita y calentar hasta el desprendimiento de vapores por 5
minutos (adicionar colorante cada vez que falte)
3) Lavar con agua corriente
4) Colorear con safranina al 0.5% por 1 minuto 5) Lavar y secar
6) Observar al microscopio con lente de inmersión
LECTURA:
EN LOS CULTIVOS
En Agar sangre: Las colonias se observan blanco grisáceo, no hemolítica en las especies
patógenas y ß- hemolíticas en las especies saprofitas. En Agar nutritivo: Se observan bacilos
endoesporulados
En caldo nutritivo: Se observa un sedimento en el fondo del tubo.
En Agar semisólido: Se observa un crecimiento en forma de pino invertido En Gelatina: sólo
las especies saprofitas producen hidrólisis.
RESULTADOS
A) DE LOS MEDIOS DE CULTIVO:
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PRACTICA Nº 13
INTRODUCCION
MATERIAL
Tubos con Caldo nutritivo
Tubos con medios semisólidos (Motilidad)
Placas Petri con Agar sangre
Placas Petri con Agar nutritivo
Tubos de 13x100 con:
Agar urea de Christensen
Citrato de Simmons
Caldo rojo de fenol con glucosa
Caldo rojo de fenol con sacarosa
Caldo rojo de fenol con lactosa
Caldo rojo de fenol con manita
Caldo rojo de fenol con salicina
Caldo esculina
Caldo: MR- VP
PROCEDIMIENTO
1. Hacer frotices a partir de una colonia sembrada en Agar nutritivo y colorearla con
Gram.
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2. Preparar una lámina en fresco a partir del tubo con caldo nutritivo sembrado, entre
lámina y laminilla.
3. Sembrar en el Tubo con medio semisólido, placas de Agar sangre, Agar nutritivo, y en
los diferentes medios diferenciales
4. Dejar en incubación por 24 a 48 horas a 37ºC.
LECTURA
FROTICES CON GRAM : Se observaran como bacilos Grampositivos.
LAMINAS EN FRESCO : Se observará la movilidad peritrica, utilizando los
objetivos de 40 aumentos.
EN CALDO NUTRITIVO: Se observará una turbidez tenue y homogénea.
EN AGAR SANGRE : Se observará colonias pequeñas con hemólisis tipo Beta.
EN MEDIOS DIFERENCIALES : Observar
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PRACTICA Nº 14
INTRODUCCION
La flora normal se adquiere con rapidez durante y poco después del nacimiento, y cambia de forma
continua a lo largo de la vida. Los organismos presentes en un determinado momento dependen de
la edad, nutrición y medio ambiente del individuo, por lo que es difícil determinar la flora normal de
cada individuo ya que depende en gran parte de los factores antes enunciados; ejemplo, los
lactantes alimentados con leche materna tienen Estreptococos y Lactobacilos en su tracto
gastrointestinal, en los pacientes que están recibiendo grandes dosis de antibióticos presentan un
gran desarrollo de levaduras.
La nariz y la boca pueden ser intensamente colonizados por bacterias como Estreptococos,
Estafilococos, difteroides, y cocos Gram negativos.
La superficie de los dientes y los surcos gingivales contienen un gran número de bacterias
anaerobias.
La rinofaringe esta habitada generalmente por estreptococos no hemolíticos y diplococos Gram
negativos, en ella puede poblarse un gran número de especies patógenas como Streptococcus
pneumoniae, Neisseria meningitidis, S. pyogenes, Klebsiella pneumoniae y Haemophilus influenzae.
MATERIALES
Caldo nutritivo en tubos (13 x 100)
Agar nutritivo en placas
Agar sangre en placas
Agar chocolate en placas
Medio hipertónico de Chapman en placas
Agar Mac Conkey en placas
Agar Sabouraud en tubos
Torundas estériles (2 x tubo)
Baja lengua
Asa de Kolle en aro
Laminas portaobjetos
Set de colorante
Gram Varillas para coloración
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PROCEDIMIENTO
A. PRIMER DIA
1. Con ayuda de torundas estériles y el baja lengua, tomar una muestra de la orofaringe.
B. SEGUNDO DIA
LECTURA
Con la ayuda del Profesor, el alumno procederá a hacer el estudio de lo que ha desarrollado en los
medios de cultivos.
IDENTIFICACION
PROTOCOLO
PRACTICA Nº 15
GENERO MYCOBACTERIUM.
INTRODUCCION
Este género está conformado por microorganismos que se caracterizan por tener morfología
bacilar, poseen un alto contenido de lípidos complejos en su estructura química y se desarrollan
lentamente en los medios de cultivo frente a los cuales son exigentes con los componentes
nutritivos.
Existen especies patógenas para el hombre y los animales, así como especies saprofitas en el aire,
en el agua y en la tierra.
Las especies patógenas para el ser humano son: Mycobacterium tuberculosis variedad hominis, que
puede infectar cualquier lugar del organismo, siendo la localización pulmonar, renal y digestiva los
mas frecuentes y el esputo es el espécimen clínico más común para establecer el diagnóstico
específico a través de la baciloscopia.
PRUEBAS DIAGNÓSTICAS:
FENOTIPICAS
MATERIALES
PROCEDIMIENTO
2. Tomar una partícula mucopurulenta del esputo y hacer una extensión homogénea sobre la
lámina portaobjetos nueva.
3. Fijar la preparación.
El mismo procedimiento se sigue con muestras de orina, heces, líquido cefalorraquídeo, líquido
pleural, etc.
LECTURA
Observar como los gérmenes visibles por el Gram, no aparecen en la coloración de Ziehl- Neelsen
porque no son ácidos alcohol resistente.
El bacilo de Koch y los otros Mycobacterium en cambio aparecen como elementos bacilares rojos
en un fondo azul.
BACILOSCOPIA
Enfocar con el objetivo de 100x la lámina referencial, cuantificar la cantidad de bacilos en toda la
longitud de los 2/3 del extendido que corresponde aproximadamente a 100 campos y anotar los
resultados, según el siguiente cuadro:
La lectura cuantitativa permite controlar la evolución del paciente que está en tratamiento y
permite detectar aquellos que sean resistentes al tratamiento.
TIPIFICACIÓN DE MICOBACTERIAS
PROTOCOLO DE TRABAJO:
PRACTICA Nº 16
INTRODUCCION
4) Catalasa positivos,
La especie tipo es Corynebacterium diphtheriae que causa la difteria, infección aguda, contagiosa y
febril, caracterizada por inflamación local y formación de una seudomembrana en la orofaringe,
además del daño al corazón y nervios periféricos por acción de una exotoxina (toxina difterica). Es
propagada por portadores sanos y convalecientes, su puerta de entrada es las vías respiratorias
superiores.
Algunas de las especies más frecuentemente halladas en el laboratorio clínico son: C.diphtheriae,
C.pyogenes, C.ulcerus, C.haemolyticus, C.xerosis, C.renale, C.equi, C.ovis, C.bovis, C.ovis y
C.hoffmannii (pseudodiphthericum).
La muestra debe ser tomada con un hisopo, se debe frotar enérgicamente sobre cualquier lesión
inflamatoria, además del hisopado de garganta, se requieren muestras de nasofaringe, y enviar
inmediatamente al laboratorio o inocular directamente en el medio suero de Loeffer o Agar telurito.
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MATERIAL
PROCEDIMIENTO
4. Bioquímica: Sembrar en los medios diferenciales de Agar Urea de Christensen, en el caldo Rojo
de fenol + Glucosa, caldo Rojo de fenol + Maltosa.
COLORACION DE ALBERT
Los gránulos metacromáticos conocidos también como de volutina, son material de reserva de
polifosfato, se distribuyen en el citoplasma, preferentemente en los extremos del bacilo, se tiñen
de color azul intenso y el soma bacteriano se observa muy débilmente.
PROCEDIMIENTO
2. Cubrir con la Solución A de Albert (Azul de toluidina, verde de metilo, ácido acético, alcohol
etílico, agua destilada) por 3 a 5 minutos.
4. Cubrir con la Solución B de Albert (yodo metálico, yoduro de potasio, agua destilada) por 1
minuto.
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LECTURA
En la coloración Gram- Kopeloff observar los bacilos rectos o ligeramente curvados ensanchados
en sus extremos como mazos, pleomórficos (en forma de pera, huso) o dispuestos paralelamente,
o en forma de “letras chinas”.
En la coloración Albert observar la bacteria color verde y los gránulos de color azul oscuro
En el cultivo en Agar chocolate telurito de potasio (medio selectivo inhibidor de Gram negativos)
observar los tres tipos de bacilos diftéricos:
En el cultivo en Agar sangre observar el crecimiento de colonias pequeñas, convexas, con bordes
enteros, color crema o blanco grisáceas, sólo las colonias Tipo mitis producen beta hemolisis.
PRACTICA Nº 17
INTRODUCCION
La especie Pseudomona aeruginosa es un bacilo Gram negativo, casi todas son móviles con flagelos
polares monotricos y multitricos, poseen cápsula, no forman esporas, no son exigentes para su
desarrollo “In Vitro”.
MATERIAL
PROCEDIMIENTO
1. Hacer un frotis a partir de la cepa Pseudomona aeruginosa y colorear por el método de Gram.
2. Sembrar la cepa de P. aeruginosa en los diferentes medios de cultivo, por las técnicas conocidas.
3. Incubar a 37°C por 24- 48 horas.
RESULTADOS
AGAR MAC CONKEY: Observar colonias grises claro, no fermentadoras de lactosa. MEDIO TSI: No
hay cambios, ya que P. aeruginosa y otras especies de este género no fermentan los carbohidratos
[utilizan los carbohidratos sólo por vía oxidativa en el medio de oxidación- fermentación (OF)].
AGAR NUTRITIVO: Describir la colonia, observar la difusión del pigmento en el Agar, y realizar la
prueba de la oxidasa, que es positiva para P. aeruginosa.
PROTOCOLO
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PRACTICA Nº 18
INTRODUCCION
La enfermedad conocida como Brucelosis o “Fiebre Malta” es causada por las siguientes especies
Brucella melitensis, Brucella suis, Brucella abortus.
Su multiplicación y desarrollo “in vitro” es muy lento, necesitan de medios especiales como el Agar
Brucella o Caldo tripticasa soya.
Para la identificación de especies se utiliza una serie bioquímica para observar la producción de
H2S, hidrólisis de la urea, desarrollo en medios especiales con fucsina 0.002 %, Thionina 0.002 % y
requerimiento de CO2.
DIAGNOSTICO DE LABORATORIO
Este microorganismo puede ser aislado de la sangre, líquido cefalorraquídeo, médula ósea o
biopsias de ganglios linfáticos e hígado.
I: HEMOCULTIVO
Para el Hemocultivo se utiliza el medio de doble fase (sólido + líquido) de Ruiz- Castañeda. La
incubación debe hacerse en una atmósfera de 5- 10% de CO2 a 35- 37°C. Las colonias aparecen entre
el 4 al 5 día, pero los cultivos deben ser incubados hasta los 30 días antes de ser descartado como
negativo.
5. ELISA
MATERIAL
PROCEDIMIENTO
I: HEMOCULTIVO
COLORACION
Realizar un frotis de la cepa desarrollada en Caldo trypticase y colorearla por el método de Gram,
siguiendo las recomendaciones señaladas anteriormente.
II: SEROLOGIA
1. Con la pipeta de 0.01 colocar una gota de suero negativo en el primer círculo de la 2da. Línea de
la lámina excavada.
2. Con la pipeta de 0.01 ml colocar en la lámina excavada, las siguientes cantidades de suero
positivo: 0.08, 0.04, 0.02, 0.01 y 0.005 ml respectivamente.
3. A cada alícuota de suero añadir una gota de antígeno, equivalente a 0.03 ml.
4. Mezclar cuidadosamente por rotación, con ayuda de un palito mondadientes empezando por el
suero negativo y la dilución más alta 1:400
5. Dejar en reposo por espacio de 3 minutos, luego rotar la lámina durante un minuto y dejar en
reposo por 4 minutos más.
6. A los 8 minutos no más, observar la presencia de grumos (aglutinación) que indica una reacción
positiva antígeno- anticuerpo y el titulo de anticuerpo alcanzado.
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PRACTICA Nº 19
INTRODUCCION
En el intestino del hombre existe una flora bacteriana constituida por Enterobacterias (Escherichia
coli, Salmonella, Shigella, Klebsiella) y otros microorganismos anaerobios y aerobios, algunos de los
cuales son patógenos para el Hombre y causantes de enfermedades.
La mayoría de las Enterobacterias tienen una acción invasiva penetrando en la mucosa intestinal
produciendo ulceraciones o abscesos, y el modo de transmisión es generalmente por ingesta de
alimentos contaminados con heces humanas.
Klebsiella pneumoniae, bacilos Gram negativos a veces con cápsula producen infecciones
oportunistas en el huésped comprometido (generalmente hospitalizado), el tracto respiratorio y
urinario son los lugares de infección más comunes, es difícil distinguir entre colonización e infección
y son productoras de endotoxinas.
Salmonella typhi, bacilo Gram negativo móvil con flagelos peritricos son exclusivas del hombre y
causan la fiebre tifoidea; otras, causan infecciones intestinales y a veces septicemias como la
Salmonella paratyhi A, B ó C.
El género Shigella, comprende especies que son bacilos Gramnegativos inmóviles, causan la
Disentería bacteriana, enfermedad que produce diarrea, moco, sangre, calambres abdominales y
fiebre. La especie S. dysenteriae es la más virulenta.
El género Proteus, presenta especies que son bacilos Gram negativos rectos, móviles con flagelos
peritricos, anaerobio facultativo. Son habitantes de la flora intestinal y otras causantes de
infecciones urinarias, heridas crónicas adquiridas generalmente en el hospital
MATERIALES
Muestra de heces.
Placas Petri con Agar Mac Conkey
Placas Petri con Agar SS
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PROCEDIMIENTO
a) Suspender aproximadamente un gramo de heces (dos asadas) en un tubo con 3 ml. de solución
salina.
b) Tomar una asada de la suspensión de heces y sembrar en las placas de Agar Mac Conkey, Agar
SS, Agar Manitol, y tubos con Agar Sabouraud e incubar a 37°C por 24 horas.
c) Sembrar las cepas bacterianas aisladas en medios de diferenciación bioquímica: TSI, LIA, Caldo
peptonado, Citrato de Simonns y Caldo MR-VP. Incubar a 37°C por 24 horas.
LECTURA
EN AGAR MAC CONKEY, observarlas colonias rojas (Lactosa +) que han metabolizado la Lactosa y
las colonias Lactosa negativas que no han metabolizado la Lactosa.
EN AGAR SS, observar el desarrollo de colonias Lactosa negativas y presencia de color negro en las
colonias que son SH2.
EN TSI (Glucosa, Sacarosa, Lactosa), cuando las bacterias metabolizan los carbohidratos toma el
medio un color amarillo y cuando producen SH2 se torna de color negro.
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EN CALDO PEPTONADO, observar la producción de Indol por las bacterias, al agregar el reactivo de
Kovac tornándose rojo grosella.
EN CITRATO DE SIMMONS, se tornará de color azul cuando la bacteria utiliza el citrato como fuente
de energía y alcaliniza el medio. (Formación de Hidróxido de amonio). Positivo (color azul), negativo
(color verde).
EN CALDO MR, observar el color rojo que toma cuando se le añade el Rojo de metilo. Cuando hay
producción de ácidos mixtos con un pH < 4.4 (positivo color rojo); pH > 4.4 (negativo color amarillo).
EN CALDO VP, observar el color rojo en anillo que se forma después de 15 minutos cuando se le
añade alfa-naftol y KOH por la producción de acetil-metil-carbinol. Positivo (color rojo), negativo
(color amarillo).
PRUEBA DE CITOCROMO- OXIDASA agregando una gota del reactivo oxidasa sobre la colonia y
observar a los 5 minutos un intenso color azul si son productoras de la enzima en caso contrario no
habrá ningún cambio de color
CON SUERO FISIOLOGICO Y LUGOL observar la muestra de heces y verificar si hay movilidad
utilizando objetivos de 40 aumentos
DIFERENCIACION BIOQUÍMICA
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PRACTICA Nº 20
INTRODUCCION
Los miembros de la familia Vibrionaceae, se encuentran en el agua dulce y salada. Incluye los
géneros: Vibrio, Aeromonas y Plesiomonas. El género Vibrio comprende muchas especies siendo las
de importancia médica Vibrio cholerae, causante del cólera epidémico; V. parahaemolyticus,
causante de gastroenteritis; V. vulnificus, causante de bacteriemia, infecciones en heridas cutáneas,
celulitis; y V. alginoliticus, responsable de otitis externa, infección de heridas cutáneas, tejidos
blandos.
Son bacilos Gramnegativos, curvados, con aspecto de coma de 1-5 m, se presentan solos, en parejas
o en cadenas que semejan espirilos, muy móviles, poseen un flagelo polar, no forman esporas, sin
cápsula, aerobios y oxidasa positivo.
Desarrollan en medios enriquecidos como el agar sangre, el medio selectivo TCBS (tiosulfato,
citrato, sales biliares, sacarosa, indicador Azul de timol y Azul de bromotimol) y medios alcalinos.
MATERIAL
PROCEDIMIENTO Y LECTURA
1. En Agar TCBS (thiosulfato, citrato, sales biliares, sacarosa): Se observan las colonias de V.
cholerae, de 2-4 mm de diámetro, lisas, con un centro opaco y periferia transparente,
circulares, de color amarillo (resultado de la utilización del citrato y formación de ácidos a
partir de la utilización de la sacarosa)
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PROTOCOLO
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RESULTADOS
PRACTICA Nº 21
INTRODUCCION
Las Leptospiras son microorganismos helicoidales, flexibles, con las espiras estrechamente unidas,
muy móviles, con una longitud de 6 a 20 µm y 0.1 µm de diámetro, sus extremos semejan a ganchos
semicirculares (ocasionalmente se presentan rectos).
La Leptospirosis es una zoonosis de distribución mundial. Los reservorios naturales son los roedores
y una gran variedad de animales silvestres y domésticos, los cuales eliminan con la orina el agente
etiológico, contaminando el agua, suelo, alimento, etc. El mecanismo de transmisión puede ser
directo (orina, órganos de animales infectados) o indirecto (a través del agua o material
contaminado. La puerta de ingreso al organismo humano es a través de lesiones de la piel y mucosas
incluyendo la conjuntiva ocular.
Se colorean por métodos especiales como Fontana Tribondeau (contiene nitrato de plata) y
coloración de Kiktenko, ya que toman débilmente los colorantes de anilina. Son visibles al
microscopio de campo oscuro en preparaciones frescas.
Desarrolla en medios especiales líquidos, semisólidos y sólidos enriquecidos con suero de conejo o
carnero al 8-10%, a una temperatura óptima de 28 – 30ºC, en un periodo de incubación de 5- 10
días, en condiciones de aerobiosis.
2. Evidencia serológica en sueros pareados con incremento cuádruple del título de diagnóstico inicial
de 1:100
MATERIAL
Microscopio.
LECTURA
RESULTADOS
PRACTICA Nº 22
INTRODUCCIÓN
Se colorea escasamente con los colorantes de anilina (Gram negativas), pero si tiene afinidad por
los colorantes derivados de Romanowski (Giemsa, Leishman, Wright).
Puede ser aislada de la sangre (Hemocultivo) en la fase hemática de la enfermedad, de las lesiones
eruptivas (fase verrucosa o histioide) y del LCR en los casos de neurobartonelosis.
En el laboratorio se puede aislar la bacteria por Hemocultivo (fase hemática) usando el agar de
fases, medio de aislamiento primario, por cultivo del verrucoma (fase eruptiva); se pueden realizar
pruebas serológicas (aglutinaciones, fijación de complemento, Elisa, etc.), ó por Infección de los
hematíes humanos por Bartonella (Danza de los hematíes) e Inhibición del movimiento de los
hematíes por acción de anticuerpos específicos antibartonella
MATERIAL
PROCEDIMIENTO E INTERPRETACIÓN
En los cultivos observar la turbidez del medio, la formación de sedimento y la formación de películas
o témpanos
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PRACTICA Nº 23
INTRODUCCIÓN
La especie T. pallidum se caracteriza por ser de forma espiral delgados y miden 0.2 m de ancho y 5
a 15 m de largo, son móviles y giran constantemente, no se tiñen bien con los colorantes de anilina
y es difícil su cultivo en medios artificiales.
PRUEBAS DE DIAGNOSTICO
1. Las muestras obtenidas de las lesiones superficiales tempranas (líquidos tisulares) pueden
observarse en un microscopio de campo oscuro buscando las espiroquetas móviles características.
3. Pruebas serológicas para sífilis, estas pueden usar antígenos treponémicos o antígenos no
treponémicos (cardiolipina purificada del corazón de buey)
4. Prueba de Floculación (VDRL), el antígeno VDRL es una solución alcohólica que contiene 0.03% de
cardiolipina, 0.9% de colesterol y lecitina purificada; esta prueba esta basada en que las partículas
del antígeno lípido (cardiolipina) permanecen dispersas en suero normal y en enfermos se combina
con la reagina de la sífilis (la reagina es una mezcla de IgM e IgA dirigidos contra algunos antígenos).
5. Prueba de aglutinación (RPR) En la prueba rápida para reaginas plasmáticas (RPR), las "reaginas"
presentes en el suero de individuos infectados con Treponema pallidum, se detectan por acción de
las mismas con antígeno de cardiolipina, lecitina y colesterol adsorbido sobre partículas de carbón.
La reacción produce una aglutinación visible macroscópicamente, favorecida por las partículas de
carbón. Las reacciones inespecíficas se evitan con el empleo de antígeno altamente purificado y el
agregado de cloruro de colina, por lo que no es necesario inactivar la muestra
MATERIALES
Suero problema
Laminas excavadas
Antígeno VDRL o RPR
Pipetas graduadas
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PROCEDIMIENTO (VDRL)
Tomar con una pipeta 0.05 ml de suero calentado (baño María a 56°C x 30’) sobre la lámina
excavada
Añadir una gota del antígeno VDRL sobre el suero y rotar durante cuatro (4) minutos
PROCEDIMIENTO (RPR)
I.PRUEBA CUALITATIVA
Llevar a temperatura ambiente los reactivos y la muestra antes de realizar el ensayo. En cada uno
de los círculos de la tarjeta de reacción colocar con un gotero plástico provisto: Muestra o Controles
1 gota (50 ul) Con el extremo cerrado del gotero distribuir la muestra uniformemente en todo el
círculo.
Con el gotero metálico provisto, en posición vertical, agregar en el centro del círculo:
SIN MEZCLAR, hacer rotar horizontalmente la tarjeta de reacción en forma manual o con agitador
rotativo a 100 rpm durante 8 minutos. Observar la presencia o ausencia de aglutinación al cabo de
este tiempo. Tiempos de lectura mayores pueden dar lugar a falsos resultados
Efectuar diluciones seriadas 1:2, 1:4, 1:8, hasta 1:64 empleando solución fisiológica y proceder de
la misma manera que en la técnica cualitativa. El título estará dado por la inversa de la última
dilución que se observe reactiva.
Reactivo: presencia de aglutinación visible en forma de grumos negros sobre el fondo claro que
indica presencia de "reaginas" en la muestra.
RESULTADOS
PRACTICA Nº 24
INTRODUCCION
La recolección debe ser con un mínimo de contaminación Establecer el momento óptimo para la
recolección, con el objeto de tener la mejor probabilidad de recuperar microorganismos causales.
Obtener una cantidad suficiente de la muestra para efectuar las técnicas de cultivo necesarias. Toda
vez que sea posible, obtener las muestras antes de la administración de antibióticos.
1. Si existe menos de 10,000 gérmenes por ml. se considera como contaminantes, siendo la muestra
negativa.
2. Cuando la orina tiene más de 100,000 bacterias por ml, se considera que hay infección urinaria.
3. Si el número de gérmenes oscila entre 10,000 a 100,000 se interpreta como dudoso y será
necesario repetir el cultivo.
La orina debe ser procesada en el laboratorio dentro de las 2 horas siguientes a la recolección para
lograr recuentos de colonias exactos, luego se deberá identificarlas y realizar el Antibiograma
correspondiente.
MATERIAL
PROCEDIMIENTO
PRIMER DIA:
1. Obtener una gota del sedimento urinario y observarlo entre lámina y laminilla al microscopio con
objetivos de 10X y 40X
1. Tomar 0.01 ml. de la orina sin centrifugar y sembrar por dispersión agotamiento en las placas con
Agar Mac Conkey, Agar Manitol y Agar Sabouraud
a) Con la pipeta de 1 ml, obtener 0.1 ml de orina sin centrifugar y transferirlo al tubo con suero
fisiológico 0.85% estéril. Mezclar bien.
b) Con la misma pipeta transferir 0.1 ml de la mezcla a cada una de las placas Petri vacías estériles.
c) A cada una de las placas agregar el Agar Mac Conkey licuado y a la otra el Agar nutritivo licuado,
rotar sobre la mesa del laboratorio para obtener una mezcla homogénea.
a) Esterilizar el asa calibrada de 10ul o 100ul, en el mechero y luego enfriarlo introducirlo en la orina
total (no centrifugado)
b) Agitar con la misma asa la muestra de orina y tomar una cantidad (0.01ul, 0.001ul) para el
sembrado
c) Se siembra esta muestra de orina en las placas de Agar Mac Conkey y otra con el Agar nutritivo
LECTURA
1. En el sedimento de la orina los elementos que pueden observarse son: pus, eritrocitos, cristales
anormales, leucocitos, levaduras, parásitos, espermatozoides, células epiteliales, cilindros.
2. En los frotices coloreados por Gram, observar la presencia de bacterias Gram positivas y Gram
negativas, y por el método de Ziehl- Neelsen las bacterias ácido alcohol resistentes(en caso de
infección por Mycobacterium).
SEGUNDO DIA:
1. En la siembra de la orina sin centrifugar, observar en la placa de Agar Mac Conkey el crecimiento
de colonias lactosa positivas; en las placas de Agar Manitol, el desarrollo decolonias resistente a
altas concentraciones de sales, y en el Agar Sabouraud, si hay presencia de levaduras.
2. En la siembra por dilución, observar el desarrollo bacteriano en las placas, contar el número de
colonias en un 1/8 de la placa y multiplicarlo por 8 y luego por 1000.
3.-En la siembra por Asa calibrada observar el desarrollo bacteriano en las placas, contar el número
de colonias , se establece el número de unidades formadoras de colonias (UFC) que en este caso
por utilizar una asa calibrada de 10ul o es 100 ul se multiplica por 100 o 1000 respectivamente.
4. Se deberá seleccionar una colonia lactosa positiva y negativa del Agar Mac Conkey, preparar
suspensiones en caldo nutritivo y realizar las pruebas diferenciales en la serie bioquímica
respectivamente: TSI, Caldo peptonado, MR-VP, Citrato de Simmons, LIA y Urea de Christensen.
Incubar a 37°C por 18-24 horas.
Nota: El agente causal aislado e identificado deberá ser sometido a Pruebas de Susceptibilidad
Antimicrobiana. El Antibiograma se realiza tomando 5 colonias del Agar Mac Conkey, se prepara una
suspensión en un tubo con SF al 0.85%, y se determina la Concentración Mínima Inhibitoria (MIC)
del antibiótico cuya finalidad es orientar en la terapéutica y la concentración del antibiótico
alcanzado en el suero o en foco de infección.
REPORTE FINAL
2. Las características del desarrollo bacteriano, y los principios bioquímicos en cada uno de los
medios selectivos empleados.
PRACTICA Nº 25
INTRODUCCION
Los virus son agentes infecciosos responsables de numerosas enfermedades del hombre, de los
animales, de las plantas y también de las bacterias (bacteriófagos).
En este capítulo analizaremos solamente los virus que producen patología en el ser humano; debido
a sus características especiales como son su pequeño tamaño y su parasitismo intracelular obligado,
los virus no pudieron ser estudiados hasta principios del siglo XX, si bien algunas de las
enfermedades producidas por ellos ya se conocían desde la antigüedad (viruela, rabia, hepatitis,
etc.). Dado que los virus carecen de los constituyentes fundamentales para el crecimiento y
multiplicación deben necesariamente utilizar los sistemas de las célula que parasitan y por ello se
denominan parásitos intracelulares obligados.
En los últimos años, se han desarrollado métodos de diagnóstico rápido para la mayoría de las
infecciones virales así como drogas antivirales específicas para muchos virus.
Se emplean métodos directos para el diagnóstico de los virus, y dado que estos solo se replican en
el interior de las células vivas, para su cultivo in Vitro es necesario el empleo de métodos especiales
en el laboratorio de virología, tales como:
a) Cultivos tisulares de humanos o animales. La mayoría de los virus pueden multiplicarse en cultivo
de células apropiadas.
e) Demostración directa del virus o de antígenos víricos a partir de frotis de las lesiones.
OBJETIVO DE LA PRÁCTICA
Por lo tanto estas prácticas nos orientan a conocer los diversos métodos de aislamiento directo o
indirecto para demostrar los efectos citopáticos de los diferentes virus y sus formas como se deben
evaluar en los diferentes procesos infecciosos que generan en el ser humano.
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Fusarium
Rhizopus
Cephalosporium
Microscópicamente presentan hifas septadas, conidióforos cortos que dan origen a conidias
hialinas agrupadas.
Helmintosporium
Colonias de color gris al inicio, después se torna de color negro en el centro, con la periferia elevada
de color gris.
Rhodotorula
Desarrolla colonias de aspecto cremoso, de color rojo o rosado debido a que forma pigmentos
carotenoides. Microscópicamente se observa células ovoides o redondeadas con o sin yema.
PROTOCOLO
PRACTICA Nº 27
INTRODUCCION
Los dermatofitos son organismos queratinófilos que invaden las estructuras queratinizadas del
cuerpo como la piel, pelo y uñas. Las artrosporas se adhieren a los queratinocitos, germinan y los
invaden, son causantes de las micosis superficiales y constituyen una de las infecciones más
comunes en los humanos.
Los agentes causales mas importantes son los hongos del género Trichophyton, Microsporum y
Epidermophyton, así como también Malassezia furfur que es causante de la Tiña versicolor o
Pitiriasis versicolor y la Piedraia hortai que afecta los pelos y produce nódulos en el tallo piloso de
los cabellos, barba y bigote.
Por su hábitat pueden clasificarse en: Zoofílicos (Microsporum canis), Geofílicos (Microsporum
gypseum), y Antropofílicos (Epidermophyton).
MATERIALES
PROCEDIMIENTO
2. Observar al microscopio las características microscópicas de cada uno de los hongos preparados
en láminas.
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Trichophyton rubrum
Al microscopio se observan hifas septadas con microconidias sésiles piriformes, a veces puede
observarse macroconidias, clamidosporas y cuerpos nodulares.
Trichophyton mentagrophytes
Trichophyton tonsurans
Microsporum gypseum
Microsporum canis
Colonias de color blanquecino poco elevado, con pigmento amarillo- naranja en el reverso de la
colonia.
Epidermophyton floccosum
Al microscopio se observan macroconidios con su extremo distal romo y con 3-4 tabiques
transversales, pueden encontrarse aisladas o en racimo.
Piedraia hortai
Los nódulos se observan en el tallo piloso como costras arenosas, duras de color pardo a negro
que envuelven completamente el tallo piloso.
PRACTICA Nº 28
INTRODUCCION:
Los hongos levaduriformes son frecuentes al estado saprofito en el suelo, aguas, plantas y en las
cavidades naturales del hombre como el tubo digestivo y en las regiones de los pliegues cutáneos.
Muchas especies han sido vinculadas a infecciones humanas como la Candida albicans y otras
especies de Candida que puede producir infecciones agudas o crónicas en la piel o mucosas, aparato
genito- urinario, y respiratorio; otras levaduras como Cryptococcus neoformans pueden causar
infecciones cerebrales y rara vez infecciones cutáneas; en el hombre la infección primaria es casi
siempre pulmonar.
MATERIALES
PROCEDIMIENTO
2. Observar al microscopio las características que presentan cada especie de los hongos en el Agar
harina de maíz, tinta china y en los cortes histológicos.
Candida albicans
Cryptococcus neoformans
Las colonias son de color blanquecino perlado al inicio, luego se tornan de color ocre, de aspecto
mucoide viscosas y brillantes con tendencia a deslizarse hacia el fondo del tubo de cultivo.
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En las láminas con tinta china se aprecia la cápsula como un halo brillante entre el borde de la
levadura y el fondo oscuro dado por la tinta china.
En los cortes histopatológicos, se observan como levaduras a lo largo de los vasos en las lesiones,
las cuales comprimen los tejidos vecinos y los necrosan, escasa infiltración celular.
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PRACTICA Nº 29
INTRODUCCION
Los hongos dimórficos, son hongos causantes de infecciones mucocutáneas y/o sistémicas en el
hombre y algunos animales.
Paracoccidioides brasiliensis
Histoplasma capsulatum
Sporothrix schenckii
Hongo que vive en el suelo, sobre plantas, produce la Esporotricosis en el hombre y algunos
animales, el hongo ingresa generalmente por traumatismo con restos punzantes de vegetales
contaminados con el hongo. La infección esta localizada preferentemente en los ganglios linfáticos
MATERIALES
PROCEDIMIENTO
Paracoccidioides brasiliensis
En los frotices coloreados con Leishman o en cortes histológicos, se presentan como células
esféricas u ovaladas de 10 a 80 micras de diámetro, con doble membrana y multigemantes.
En cultivo en Agar Sabouraud glucosado desarrolla colonias de micelio aéreo de color blanco
compacto, de crecimiento lento. Microscópicamente se observan filamentos hialinos, tabicados con
microconidias esféricas o piriformes.
En Agar Infusión cerebro corazón (BHI), se observan colonias cerebriformes, de color beige claro.
Microscópicamente se observan células esféricas.
Histoplasma capsulatum
En el medio BHI desarrolla colonias pequeñas de aspecto membranoso rugoso, color marrón claro.
Microscópicamente, se observan como células ovaladas a veces gemantes.
Sporothrix schenckii
Microscópicamente se observan hifas finas tabicadas con cortos conidióforos en cuyo extremo se
encuentran las conidias agrupadas dando el aspecto de una margarita.
PROTOCOLO
Muchos de los virus y Rickettsias patógenas para el hombre y los animales pueden propagarse en
las células vivas de las membranas extraembrionarias o en el propio embrión de huevos
embrionados de gallina. Estas técnicas fueron introducidas por Footdpasture y col., en 1931, y
desde entonces están siendo ampliamente usadas.
Las vías de inoculación y la edad del embrión a usar dependen del agente viral que va a ser
inoculado.
MATERIALES
d) Se tapa la abertura con cinta adhesiva o cera calentada y se deja en incubación a 33-35°C por 2-
4 días, luego cosechar y observar.
b) Limpiar con alcohol yodado un área de la cámara de aire que está situada por encima del embrión
y hacer una perforación rectangular de 0.5 cm, con el punzón.
c) Deja caer una gota de suero fisiológico o aceite mineral estéril, para visualizar una zona no
vascularizada de la membrana corioalantoidea subyacente.
d) Con una pinza curva introducir a través de esta área, coger hacia arriba la membrana amniótica,
formando una pequeña “tienda” en la base del cual se inyecta 0.2 ml, de la solución de Azul de
metileno o del inoculo problema.
f) Se sella la abertura del huevo con cinta adhesiva o cera caliente y se deja incubando a 3335°C por
2-4 días (sujeto a la muestra: Influenza)
a) Limpiar con alcohol yodado, la porción de la cáscara que cubre la cámara de aire del huevo
embrionado de 6-7 días.
c) Con una jeringa de 1 ml y aguja de 22x½” inocular 0.5 ml de Azul de metileno, introduciendo la
aguja verticalmente a través de la cámara de aire, hasta 35 mm de profundidad.
d) Sellar la abertura
OBSERVACIÓN DE LÁMINAS:
1. Cultivo de células normales, coloreadas con Hematoxilina eosina (HE), no se tiñe de rosado el
citoplasma.
3. Enterovirus- Virus Polio: En cultivos de células humanas (HEP-2), observar la degeneración celular,
el redondeamiento celular, la picnosis nuclear y desplazamiento del núcleo hacia el borde de la
célula.
4. Herpes simple en cultivos de células: Observar las células gigantes polinucleadas, las inclusiones
eosinofilas intracelulares denominadas cuerpos de Lipschutz.
PRACTICA Nº 26
INTRODUCCION
MATERIALES
PROCEDIMIENTO
1. Estudie las características macroscópicas de los diferentes cultivos, observando el tipo de micelio
aéreo, aspecto de la colonia, producción de pigmento y consistencia de la colonia.
Aspergillus
Colonias al inicio de color blanco, luego varía de acuerdo a la especie en: amarillo, verde azufrado,
marrón o negro.
Penicillium
8. BIBLIOGRAFÍA
Microbiología Clínica Básica, Ramírez Ponce, Rafael, Ed.1, Edit. Jesús G. Bellido M,
2017, Lima/Peru.
Intranet UPSJB.
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