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Les allergènes recombinants

Pr G. Pauli

Hôpitaux Universitaires de Strasbourg

Cours Capacitéd’Allergologie
22 Fev. 2008- Lille
Provenance : sources d ’allergènes
! Acariens ! Pollens

! Mammifères ! Moisissures

! Insectes : ! Nombreux végétaux


"blattes, "bois et gommes
"criquets, "latex
"chironomides "farine
"graine, feuille, gousse, racine
! Poissons, crustacés
! Enzymes
"fongiques
"végétales
"animales
"bactériennes
Sources biologiques

D t h id t i (St b )

Dermatophagoïdes Blomia tropicalis


pteronyssinus

Extraits
allergéniques

R.A. Cooke
(1880 - 1960)

Allergènes naturels purifiés


ou allergènes recombinants 21ème Siècle
D ’une vision macromoléculaire vers une
vision moléculaire des allergènes
Bet v 1 Bet v 2

Bet v 1, Gajhede 1995


! Sources allergéniques - Culture d ’acariens
- Pollens
- Moisissures et leur milieu de culture

! Extraits allergéniques variation du contenu des allergènes


majeurs peut atteindre 1000

! Molécule allergénique Système multi-allergénique


Système pauci-allergénique
Quelques Dates:

! 1988:clonage de Der p1(Al.Maj.Acariens)Chua J.Exp.Med

! 1989:clonage de Bet v1(Al.Maj.Bouleau)Breiteneder Embo J.

! 1991:clonage de la profilne(panallergène)Valenta Science

! 1993:clonage de Phl p 5(Al.Maj Graminées)Vrtala J Immunol


! 1993:clonage de Sin a 1(All.Maj.Moutarde)Rodriguez,Ier
Progrès dans la biotechnologie
appliquée aux allergènes
! Identification et séquençage de nombreux allergènes
! Production d ’allergènes recombinants (dans E. coli et P.
pastoris).
! Identification des régions immunoréactives : épitopes T et B.
! Connaissance de la structure tridimensionnelle (NMR,
cristallographie, modeling).
! Développement de nouveaux outils diagnostiques et
nouvelles perspectives thérapeutiques.
Défauts des extraits allergéniques naturels
! Composition variable et hétérogène : mélange de protéines allergéniques et
non allergéniques

# Obtenus à partir de sources allergéniques complexes: grains de


pollens, squames et phanères d’animaux, cultures d’acariens ou de
blattes.

# Variation de la composition en fonction des sources, des procédés


d'extraction, de purification et de stockage utilisés.

# Variation de la composition en fonction des propriétés


d'hydrosolubilité des protéines allergéniques.
Préparations n ’ayant pas des qualités
pharmaceutiques
! Manque de régularité
" dans la composition des extraits allergéniques
" dans la concentration relative des différentes molécules
allergéniques.

Ex.1 : Contenus en allergènes majeurs d ’acariens dans


différents extraits d ’acariens peuvent varier jusqu ’à 500
fois (Thomas)
Ex.2 : Phl p 2, un allergène majeur des graminées, peut varier
entre 10 et 500 ng/ml (Valenta)
! Progrès réalisés :
"fabrication industrielle automatisée.
"Effort de standardisation in vitro et in vivo
"dosage d’un ou de plusieurs allergènes majeurs

! Problèmes persistants :
"Impossibilité de préciser à quelle(s) molécule(s) allergénique(s)
le patient est sensibilisé : allergènes majeurs ou mineurs.
"Impossibilité de quantifier les IgE spécifiques dirigées contre
les différents composés moléculaires.
Production des allergènes recombinants :
Principes
! Sélectionner les séquences d'ADNc transcrites à partir des ARNm

(obtenus à partir de l'extrait allergénique)


! Insérer cet ADNc dans un phage et sélectionner les clones de bactéries
infectées par ce phage, qui fixent les IgE spécifiques de l'allergène (IgE
humaines, IgE monospécifiques d'animaux, anticorps monoclonaux
murins).
! Isoler l'ADNc (spécifique de l'allergène), l'insérer dans un plasmide et le
faire produire par une cellule hôte (bactérie, levure).
Valenta et al., JACI 2007
Intérêt du clonage des allergènes (1)

Permet la caractérisation de l'ensemble des


allergènes présents dans un extrait (en
particulier utile pour la recherche
d'allergènes fragiles ou non hydrosolubles),
détermination des caractéristiques
physicochimiques : pI, Mr (parfois difficile).
Intérêt du clonage des allergènes (2)

Le séquençage de l'ADNc :
"permet de déterminer la structure primaire de la
protéine allergénique.
"permet la comparaison avec des banques de
données d'ADN et permet la mise en évidence
d'identités et d'homologies
(ex. > 80 % pour Bet v 1, Aln g 1, Cor a 1, Car b 1)
Différentes caractéristiques d ’un allergène lui
conférant un caractère majeur

! > 50 % de sensibilisations chez les patients sensibilisés


à l ’extrait global.
! Allergène à l ’origine d ’un pourcentage élevé des IgE
spécifiques dirigées contre l ’extrait global.
! Allergène présent en quantité très significative dans
l ’extrait inhalé ou ingéré.
! Parmi les molécules allergéniques, certaines
entraînent une prévalence de sensibilisation élevée !
allergène majeur (prévalence > 50 % parmi les sujets
sensibilisés à l ’extrait global).
Mais :
"différence selon les populations étudiées (ex. pour
le bouleau entre les européens du Nord et du Sud)
"un allergène mineur (qui ne sensibilise que 10 %
des sujets sensibilisés à l ’extrait global) peut être le
seul responsable de la sensibilisation chez certains
patients.
! Learning the importance of molecular allergens involved in
allergic diseases

Prevalence of
sensitization Groupe
1
Groupe 4
Groupe
5
Groupe
2/3
Groupe
50%
13
Groupe
11

Groupe
12
Groupe
Groupe 7
10

Low 40% High


potential potential

% of specific IgE to individual


molecular allergens
Example for grass pollens (given by M. Hrabina, Stallergènes, France)
On peut distinguer :
Des systèmes Des systèmes pauci-allergéniques :
multiallergéniques : ! Bouleau : 5 allergènes identifiés.
! Cupressacea (cyprès) : 3
! Graminées : plus de 12
allergènes identifés.
allergènes identifiés.
! Armoise : 4 allergènes identifiés.
! Oléacées (olivier, frêne ):
! Pariétaire : 3 allergènes identifiés.
9 allergènes identifiés.
! Ambrosia : 9 allergènes
identifiés.
Dénomination des allergènes
Nomenclature de l ’IUIS
(International Union of Immunogical Societies)
! 3 premières lettres du taxon + 1ère lettre du genre.
! Exemples :
"Betula verrucosa - Bet v 1
- rBet v 1 allergène recombinant
correspondant
- nBet v 1 allergène naturel
"Olea europea Ole e 1
"Fraxinus excelsior Fra e 1
"Phleum pratense Phl p 1
"Dactylis glomerata Dag g 1
"Ambrosia artemisoefolia Amb a 1
High degree of cross reactivity among major tree pollen allergens (1)
P.M. Prevalence Sequence
FAGALES of sensit. identity

Betulaceae Birch Bet v 1 Ipsen, JACI 1983 17kDa 95%


Alder Aln g 1 70-80% identity identity
Corylaceae Hazel Cor a 1 Valenta, JACI 1991 with Mal d 1
Hornbean Car b 1 Api g 1,
Dau c 1
Fagaceae Oak Que a 1
ASTARIDAE
Oleaceae Olea Ole e 1 Lanzurica,
Mol. Immunol. 1988 19 kDa
Villalba, identity
J. Biol.Ch. 1994 with
Fraxinus Fra e 1 maize pollen
Exc. Lol p 11,
Ligustrum Lig v 1 Batanero Soyb. I.P.
vul. Clin. Exp. Allergy >70% Tomato
Syringa Syr v 1 1995
vul.
Tree pollen cross reactivity can be linked to « minor allergens »
which elicit IgE antibodies in a lower proportion of patients
P.M. Prevalence of Sequence
sensitization identity
Bet v 2 profilin Valenta, 14 kDa 12% North Europe homology
Science 1991 50% South Europe with
Aulnus Phl p 11,
Platanus Inhibition by Bermuda grass,
Populus alb. rec Bet v 2 tomato profilin,
Quercus alb. at approximately wheat profilin,
Ulmus 14 kDa r Gly m 3

Ole 2 Lesdema, 22%


Allergy 1998

Bet v 4 Calcium binding 9,3 kDa 21% Homology with


Aln g 4 allergens 9,3 kDa grasses Cyn d 7,
Ole e 3 Seiberler (Embo.J. 1994) 8-9 kDa Phl p 7,
Hayek, J. Immunol.(Sub) weeds,
Batanero, Bra r 1
Eur.J.Bioch., 1996
Grass pollen allergens (1)
M.W. Prevalence Sequence
Group I of sensitization identity
Lol p 1 Kahr, Marsh
Mol.Immunol. 86
Perez,
J.Biol.Chem.90
Phl p 1 Ansari, Marsh Homologies
J. Biol. Chem. 89 30 kDa 95% with
Poa p 1 Lin, Lol p 2,
Int.Arch.AAI 88 Lol p 3
Dac g 1 Mecheri, Peltre
Int.Arch.AAI, 85
Hol L 1
Laffer, Valenta (JACI 1994) : recombinant Phl p 1 inhibits IgE binding to group I
allergens from 8 different grass species.
! Systèmes pauciallergéniques :
"Si prévalence de sensibilisation est très élevée (Bet v 1, Fel
d 1), l ’allergène recombinant pourrait être le réactif idéal
pour le diagnostic et le traitement.
! Systèmes multiallergéniques :
"Plusieurs molécules allergéniques ont une prévalence de
sensibilisation élevée (graminées).
- Nécessité d ’utiliser un cocktail d ’allergènes recombinants
pour le diagnostic.
- Sélectionner le ou les allergènes qui sensibilisent les patients
pour désensibilisation ciblée (« à la carte »).
Travaux préliminaires ! validation des
allergènes recombinants
! Vérification de la pureté, de l'absence de toxicité et de la
stabilité de l'allergène recombinant
! Validation de l'activité immunologique de l'allergène
recombinant en comparaison à l'allergène naturel
"In vitro :
$Capacité de fixation des IgE spécifiques (RAST, CAP,
ELISA, tests d ’inhibition)
$Capacité de libération de l’histamine au niveau des
basophiles
"In vivo :
$Tests cutanés
$Tests de provocation
Validation des allergènes recombinants
Indispensable car :
! Les allergènes produits dans les systèmes bactériens
peuvent ne pas être glycosylés, alors que les allergènes
naturels sont souvent des glycoprotéines.
! Un allergène recombinant peut ne correspondre qu ’à un des
isoformes de l'allergène naturel (variant moléculaire).
Techniques in vitro

- Réactivité avec les anticorps Inventaire de l’ensemble des épitopes antigéniques


monoclonaux murins :

- Réactivité avec les IgE Circulantes - ELISA


- RAST détection des épitopes reconnus par les IgE
- CAP
- Immunoblot (comparaison avec l'allergène naturel).
- Réactivité avec les IgE fixées sur les - Histaminolibération
basophiles
- Expériences d’inhibition compétitive - Inhibition du RAST, ELISA, immunoblot (par rapport à l’allergène naturel).

- Immunoréactivité des cellules T - Prolifération de clones de cellules T spécifiques de l’allergène naturel.


T e c h n iq u e s in v iv o : in d u c tio n d ’u n e r é p o n se b io lo g iq u e

D a n s le s m o d è le s e x p é rim en ta u x p a r E v a lu a tio n d e s ré a c tio n s d ’h yp e rse n sib ilité im m é d ia te


im m u n isa tio n d e so u ris, sin g e s, la p in s (te sts c u ta n é s, P C A , Ig E , Ig G 1 )
C h e z l’h o m m e
- T e sts c u ta n é s - C o m p a ra iso n d u se u il d e ré a c tiv ité c u ta n é e d e l'a lle rg è n e
n a tu re l e t d e l'a lle rg è n e re c o m b in a n t.

- T e sts d e p ro v o c a tio n - N asals C o m p a ra is o n d e s e ffe ts o b te n u s


- B ro n c h iq u e s a v e c l’a lle rg è n e n a tu re l
- C o n jo n c tiv a u x e t l’a lle rg è n e re c o m b in a n t.
Démonstration de l’activité biologique des allergènes recombinants
Réactivité avec :
" Les IgE circulantes humaines : - ELISA
- Immunoblot
" Les IgE fixées sur les cellules cibles : basophiles (histaminolibération).

J Allergy Clin Immunol 1996, 97, 1100-9


Basophiles Mastocytes

J Allergy Clin Immunol 1996, 97, 1100-9


! Prick-tests : concentrations varient de 1
à 100 µg/ml (exceptionnellement 1000
µg/ml pour Hev b 2, 5, 7, Api g 1)
Le plus souvent positifs à 10
µg/ml
! Intradermoréactions : doses maximum
injectées varient de
10-2 µg/ml à 10 µg/ml.
Dose de départ raisonnable :
10-2 µg/ml (chez sujets hypersensibles :
positivité possible pour des solutions <
à
2 pmol (Crameri))
Résultats des tests cutanés avec rFra e 1

Barderas R, Purohit A, Papanikolaou I, Rodriguez R, Pauli G, Villalba M. JACI 2005 ; 115 : 51-7
AUTRES TESTS CELLULAIRES

! Lignée de Basophiles de rat

! Cytométrie de flux:marqueurs activés CD-63,CD 203c

! Histaminolibération des basophiles


Performance du diagnostic d ’une allergie aux
graminées par les tests cutanés aux allergènes
recombinants (rPhl p 1, rPhl p 2, rPhl p 5)
% 52 sur 54
51 réagissent à rPhl p 1
32 ! à rPhl p 2
41 ! à rPhl p 5

3 cas : IgE spécifiques (+) pour la phléole mais tests cutanés (-)
1 cas : tests cutanés (+) à rPhl p 1 mais IgE spécifiques anti-phléole (-).
Pas de réaction positive chez 10 témoins non allergiques

S. Heiss et coll., J. Invest. Dermatol., 1999


Tests cutanés : résultats
! r Bet v 1 et r Bet v 2
" 50 sur 50 réagissent à au moins 1 allergène
$47 à r Bet v 1 (27 à 3 µg/ml, 20 à 10 µg/ml)
$10 à r Bet v 2 (3 à 3 µg/ml, 7 à 10 µg/ml)
$7 aux deux allergènes recombinants.
" Pas de réaction positive chez les contrôles.
" Sensibilité : 100 % pour le diagnostic de la sensibilisation
au pollen de bouleau.
" Tests cutanés plus sensibles que les tests in vitro (ELISA,
I.B.)

G. Pauli et coll., JACI 1996


Analyse des IgE spécifiques anti-rFra e 1 and anti-nFra e 1 de 72 serums
provenant de patients sensibilisés au frêne (Strasbourg).
R. Barderas, A. Purohit, R. Rodriguez, G. Pauli, M. Villalba ; Ann Allergy Asthma
Immunol 2006.
CREATE:Certificate Reference
Materials for Allergenic Products
28 collaborations (Coordonateur:R. Van Ree)
! 6 prod.d’allergènes
! 2 comp.de biotechnologie
! 11 cliniciens
! 9 labo.de recherche

! Banque de 961 serums


rBet v1,rPhl p 1,5a,5b,rOle e1,rDer p1,rDer p2,rDer f1,f2
2001-2005 (Allergy 2008;63:310-326)
(CREATE)
RAST (CREATE) RAST (CREATE)

Comparaison nPhl p 5 et rPhl p 5a et rPhl p 5b


Mesures qualitatives et quantitatives
des IgE spécifiques.

! Spectrotype des spécificités des IgE pour


chaque patient (actuellement dosage d ’IgE
polyclonales purifiées contre les extraits
classiques).

! Mesures quantitatives des IgE spécifiques


dirigées contre les allergènes recombinants.
Mesures quantitatives des IgE spécifiques dirigées
contre l ’allergène majeur Lol p 1 (Lollium perrene)

! Tamborini (Eur J Biochem, 1997) :


anti Lol p 1 = 37 % des IgE dirigées contre un
extrait de Lollium perrene.
! Van Ree (Clin Exp Allergy, 1999) :
anti Lol p 1 + anti Lol p 5 = 81 % des IgE
spécifiques contre un extrait de Lollium perrene
(n = 130)
Mesures quantitatives des IgE spécifiques
dirigées contre les allergènes des acariens
Les Ige anti-Der p1 et anti-Der p2 représentent plus de 5
fois

le taux des IgE induites par les autres allergènes

moléculaires des acariens


ETUDE des FREQUENCES de
RECONNAISSANCE des ALLERGENES
=ETUDES EPIDEMIOLOGIQUES des sensibilisations
moleculaires.

(Tres grande étude éffectuée en Espagne)


R. Movérare et coll., Int Arch Allergy Immunol, 2002, 128 : 325-335
Epidémiologie
! Allergènes des pollens de graminées (n = 11)
Prévalence de sensibilisations à 5 allergènes moléculaires dans 7 pays
différents (Laffer, JACI 1996)

100
80
60
40
20
0
Australie Danemark France Suède Suisse Canada Japon
(n=29) (n=26) (n=38) (n=35) (n=20) (n=15) (n=20)

rPhl p 1 rPhl p 2 nPhl p 4 rPhl p 5 profiline


75 sérums de patients Alsaciens
(dosages effectués par S. Vrtala, R. Valenta - Vienne)
Prévalence de sensibilisations aux allergènes d’acariens (Autriche)
G. Pittner, S. Vrtala et col., Clin Exp., 2004, 34, 897-603

% n

n = 78 n Der p 1 91 71

r Der p 2 86 67

n Der p 4 74 58

r Der p 5 18 14

r Der p 7 27 21

r Der p 8 10 8

r Der p 10 6,4 5
Implication pratique des allergènes
recombinants
1. Outil pour améliorer le diagnostic positif.
2. Outil pour confirmer les allergies croisées.
3. Outil pour améliorer l ’interprétation des
sensibilisations cutanées concomitantes.
4. Outil pour améliorer les indications de
l ’immunothérapie spécifique.
Utilisation pour le diagnostic de marqueurs de
sensibilisation spécifiques

! Pour les allergènes les plus fréquents (graminées, acariens,


pollens d ’arbres, etc…

! Pour des sources allergéniques plus exceptionnelles.


Marqueurs de sources
allergéniques fréquentes

Pollen de r Phl p1 Acariens r Der p 1


graminées
r Phl p 13 r Der f 1

Pollens de r Bet v1 Moisissures r Alt a1


fagales

Pollens r Fra e1 Allergènes de r Feld d1


d’oléacées mammifères
r Ole e 1 r Can f1
IgE reactivity profiles to ash pollen and rFra e 1.
Barderas R., Purohit A., Papanikolaou I, Rodriguez R., Pauli G., Villalba M..
JACI ; 2005, 115 : 351-357
Outils diagnostiques actuellement
disponibles
! Dosage des IgE spécifiques sériques par immunoCAP (Laboratoires Pharmacia)
! Pollen de phléole :
"dosages individuels rPhlp 1,2,5,6,7,11,12
"dosages multiples rPhl p1,5b et rPhl p 7,12
! Pollen de Pariétaire
"dosage individuel : rPar j 2
! Pollen de bouleau et pollen d’olivier
"dosages individuels : rBet v 1,2,4 et n Ol e1
"dosages multiples : rBet v 2,4
! Aspergillus :
"dosages individuels : rAsp f 1,2,3,4,6
! Latex :
"dosages individuels : rHev b 1,2,3,5,6.01,6.02,8,9,11
Peche:Pru p3
Chat:Fel d1
Marqueurs de sources allergéniques
exceptionnelles

! Sol i 1 : fire ant venom ; Hoffmann et al, JACI, 2005

! Recombinant mosquito salivary allergens ; Peng et al, Int.


Arch. Allergy Immunol., 2004

! Arg r 1 : pigeon tick argas reflexus : Hilger et al., JACI, 2005


IgE-mediated anaphylaxis caused by bites of the pigeon tick Argas reflexus: Cloning
and expression of the major allergen Arg r 1.
Hilger C, Bessot JC, Hutt N, Grigioni F, de Blay F, Pauli G, Hentges F.
J Allergy Clin Immunol 2005 ; 115 : 617-622
Apport des allergènes recombinants
dans les outils diagnostiques
! Augmentation de la qualité des extraits actuels par un
meilleur choix des sources allergéniques.
"Végétaux ayant un haut degré de maturation (pomme, kiwi,
avocat).
"Espèces particulières riches en allergènes majeurs (Mal d
1 pour les pommes ; Vieth, Allergy 1994).
! Quantification des allergènes majeurs dans les extraits
allergéniques.
Ex.: anticorps monoclonal anti-Cup a 1 permet
standardisation de différents extraits de cupressacées
(Duffort, EAACI 2006)
! Nouveaux materiaux de Reference pour 8 allergènes(Create)
Définition du spectrotype correspondant
à un patient donné avec détermination
quantitative des IgE spécifiques
vis-à-vis des allergènes moléculaires.

! Patients paucisensibilisés ou polysensibilisés.


! Sensibilisation à des pan-allergènes qui expliquent certaines
polysensibilisations :
ex. pour les pollens : profiline, protéines liant le calcium
! En cas de polysensibilisation les mesures quantitatives (Immuno-CAP)
permettent de détecter le composé moléculaire le plus pertinent.
! Guide le choix du traitement de désensibilisation.
Interest of the dosage of rBet v 1 specific IgEs to assess the responsibility of
spring pollinosis.
C. Metz-Favre et coll., Rev Fr Allergol Clin Immunol 2005
n = 83 ; control = 34
sensitivity = 91 % PPV = 92 %
specificity = 82 % PNV = 93 %

30
nombre de patients

25
20

15

10
5
0
0 I II III IV V VI
classes d'IgE spécifiques anti-rBet v1

autre diagnostic pollinose au bouleau

- IgE anti-Bet v 2 are positive in 19.5% of patients ; med: 2.46 KU/L


- Oral syndromes more frequently found in patients with levels of rBet v 1 IgEs
> 54 KU/L
- No predictivity for severity (with and without asthma)
Allergènes recombinants
=
outils pour confirmer
les allergies croisées.
Evolution of diagnosis of « cross reactivities »

1975 1980 1990-2000 21th


RAST Immunoblot Use of
inhibition inhibition purified and/or Newly developed
with with crude recombinant proteomics
crude extracts extracts allergens approaches
(in vitro inhibition
tests, diagnosis
tests) Separation
techniques
Mass
spectrometry
Bioinformatics

establishes detects allows


cross reactivity cross reacting identification Sequence
but does not allergens without of the homologies and
identify the identifying them responsible structure
allergens cross reactive prediction
involved allergen
! Différentes molécules allergéniques peuvent avoir des épitopes en
commun, ce qui constitue le support moléculaire des réactions croisées.
Des molécules ayant plus de 50 % d’homologie de séquences des acides
aminés sont souvent responsables d’allergies croisées. Mais c’est le
degré de similarité des épitopes conformationnels (exposés à la surface
de la molécule) qui est prédominant par rapport au degré de similarité des
séquences d’acides aminés (épitopes linéaires). Par exemple, l’homologie
de séquence entre l’allergène majeur du bouleau (Bet v 1a) et l’allergène
majeur de la pomme (Mald 1) est de 56 %, mais l’homologie des épitopes
exposés (ou conformationnels) est de 71 %.
Sources allergéniques différentes produisant un Sources allergéniques différentes produisant
allergène croisant unique ou un nombre limité essentiellement des allergènes croisants

Betula
Dactyle Dactyle
verrucosa Phléole
glomerata glomerata

Groupe 1
Profiline Groupe 2
Groupe 5

Faible Proximité taxonomique Forte

Communauté épitopique
Faible Forte
Apport des allergènes recombinants
aux bases moléculaires des allergies croisées (1)
% entre pneumallergènes :
a) à l ’intérieur de la famille des bétulacées (bouleau,
aulne, noisetier) inhibition du RAST avec rBet v 1

V. Niederberger, G. Pauli et coll., JACI 1998, 102, 579-91


ALLERGENES CROISANTS DU FRENE

Profiline

Polcalcine
Inhibition studies :
ex. (1) : Fraxinus

rFra e 1 rPhl p 7 rBet v 2


Barderas et coll. V. Niederberger et coll.
JACI 2005 Clin Exp Allergy 2002
Apport des allergènes recombinants
aux bases moléculaires des allergies croisées (3)
% entre pneumallergènes et allergènes alimentaires :
rBet v 1, rBet v 2, rMal d 1 (pomme), rApi g 1 (céleri), rDau c 1
(carotte).
Inhibition de RAST avec des allergènes recombinants rBet v 1
et rBet v 2.

L. Kazemi-Shirazi, G. Pauli et coll., JACI 2000, 105-125


Réactions croisées potentielles entre les composants moléculaires du pollen
de bouleau et différents allergènes alimentaires.

Bet v 1 Mal d 1 (pomme) Pru av 1 (cerise) Api g 1 (céleri)


Dau c 1 (carotte) Pyr c 1 (poire) Cor a 1 (noisette)
Sam m 2 (soja) Ara h 8 (arachide) Pru a r 1 (abricot)
Bet v 2 Cor a 1 (noisette) Lit c 1 (litchi) Lyc e 1 (tomate)
Ara h 5 (arachide) Gly m 3 (soja) Api g 4 (céleri)
Pyr c 4 (poire) Pru av 4 (cerise) Pru p 4 (pêche)
Cap a 2 (piment) Mal d 4 (pomme) Ana c 1 (ananas)
Bet v 6 Pyr c 5 (poire)
Les allergènes recombinants aident à comprendre
les bases moléculaires
% des réactions croisées entre allergènes inhalés (pollens) et
allergènes alimentaires.
Bet v 1 et Mal d 1, Pru a v1, Api g 1, Dau c 1, Pyr c 1
Cor a 1, Sam m 2, Ara h 8, Pru a r1

Bet v 2 et Cor a 2, Lit c 2, Ly e 1, Ara h 5, Gly m 3,


Api g 4, Pyr c 4, Pru a v4, Ana c 1, Pru p 4
Cap a 2, Mal d 4

Bet v 6 Pyr c 5

Art v 3 Pru p 3
Apport des allergènes recombinants
aux bases moléculaires des allergies croisées (4)

% entre allergènes alimentaires :


exemple :
Fruits de la famille des rosacées
(Bet v 1 like protein, profiline,
LTP…)
Poissons : parvalbumine.
Crustacés : tropomyosine,
arginine kinase.
Other important cross reactive food
allergens in plants (1)
Profilins regulatory actin - Pollen and vegetable
binding protein Van Ree, Int Arch Allergy 1992
homologous to - Hazelnut ; Hirschwehr, JACI 1992
Bet v 2 - Lychee ; Fah, Clin Exp Allergy 1995
- Tomato ; Petersen, JACI 1996
Bet v 2 - Peanut, Ara h 5,
Kleber-Jancke, Int Arch 1999
- Soybean, rGly m 3
Rihs, JACI 1999
- Celery, Api g 4 ;
Scheurer, Clin Exp 2000
- Pear, Pyr c 4, Cherry, Pru av 4
Scheurer, J Chromato 2001
- Banana, pineapple
Reindl, Int Arch 2002

1CQA
Illustration with pathogenesis-related proteins PRs (2)
PR5 thaumatin-like antifungal - Apple, Mal d 2 ; Hsieh, JACI 1995
proteins (TLP) activity - Cherry, Pru av 2 Inschlag, Int Arch 1998
- Paprika ; Leitner, Allergy 1998
- Kiwi ; Gavronic-Jankulovic, JACI 2002
PR10 Bet v 1- like plant steroid - Birch, Bet v 1
proteins hormone Breiteneder, Emb J 1989
transporter - Cherry, Pru av 1
Scheurer, Mol Immunol 1999
Neudecker, J Biol Chem 2001
- Apple, Mal d 1
Bet v 1 Pru av 1 Vaneck-Krebitz, Biophysic 1995
- Celery, Api g 1
Breiteneder, Eur J Bioch. 1995
- Carrot, Dau c 1,
Hofman-Sommergruber
Clin Exp Allergy 1999
- Pear, Pyr c 1
Karamloo, J Chrom Bio 2001
1BTV 1E09 - Soy, SAM22, Kleine-Tebbe, JACI 2002
- Hazelnut, Cor a 1,
Luttkopf, Mol Immunol 2002
Neudecker P, Schweiper K, Nerkamp J, Scheurer S, Vieths S, Sticht H,
Rosch P.
Allergic cross-reactiviy made visible: solution structure of the major
cherry allergen Pru av 1.
J Biol Chem 2001
Biochem J 2005

Pru av 1 (green)
Bet v 1 (orange)
Apport des allergènes recombinants
aux bases moléculaires des allergies croisées (4)
% entre trophallergènes :
Protéines de Transfère les lipides - Pêche, Pru p 3
transfert des entre les liposomes Sanchez-Monge, JACI 1999
lipides LTPs et les membranes. - Pomme, Mal d 3
cellulaires Pastorello, JACI 1999
- Abricot, Pru ar 3
Pastorello, JACI 2000
LTP Maïs - Châtaigne, LTP
Diaz-Perales, Clin Exp 2000
- Maïs,
Pastorello, JACI 2000
- Cerise, Pru av 3
Scheurer, JACI 2001
- Prune, Pru d 3
Pastorello, J Chromato 2001
- Noisette, Cor a 8
Pastorello, JACI 2002
Syndrome oral fréquent
CCD allergie croisée avec les rosacées
Réaction in vivo
non confirmée (allergène
Cor a 1
thermosensible)
Cor a 9 (famille Fruits
des vicilines) Profiline Pertinence
Noisette Légumes clinique non
Allergie confirmée ?
Réaction
croisée systémique
avec
LTP
l ’arachide
Cor a 8 rare

Réaction systémique sévère


Allergie croisée avec les rosacées
Illustration de la complexité d ’un allergène alimentaire
(l ’exemple de la noisette)
Allergènes croisants des crustacés
! Tropomyosine :
"Clonage de la tropomyosine de
Crevette (Pen a 1, Met c 1) 1994
Crabe (Cha f 1) 1998
Leung et al., JACI
Homard (Hom a 1) 1998
"Clonage de la tropomyosine d ’huître : Leung, Clin Exp 2001
! Pen m 2, Penaeus monodon: arginine kinase.
Chia-Jung, J Immunol 2003
Similarités :
"Pour les arginines-kinases de crevette, homard et langouste
! 90 % d ’homologie avec Pen m 2
"arginine-kinase de crabe ! 77 % d ’homologie avec Pen m 2
Pen m 2, Penaeus monodon: arginine kinase.
Chia-Jung, J Immunol 2003

Pen m 2
Sand
shrimp
Lobster
Cray fish
Crab

BSA

Dot blot IgE Inhibition


Allergènes recombinants
=
outils pour améliorer l'interprétation des
sensibilisations cutanées concomitantes.
Case n °1, allergological investigations
Case n °1,
allergological diagnosis at a molecular level

! Molecular basis of cross reaction

"Profilin
$IgE against r Bet v 2 8.33 kU/L
$IgE against r Phl p 12 9.10 kU/L

"Calcium binding protein


$IgE against r Phl p 7 9.11 kU/L
Clinical consequences
Seasonal symptoms

Grass pollen allergy with co-sensitization to other


pollens through profilin and polcalcin.
At the moment, artemisia, ambrosia and other pollen allergies
could be confirmed by the clinical observances and/or nasal
provocation tests.

"Desensitization with grass pollen extract available


at present time ?
"Symptomatic treatment
Allergènes recombinants
=
outils pour améliorer les indications de
l’immunothérapie spécifique
Quel avenir pour les allergènes
recombinants ? (1)
! Cartographier les sensibilisations.
94 allergènes différents (VBC - Genomics) FASEB J 2002
34 allergènes différents (Allergopharma) Allergy 2002
(18 allergènes recombinants)
! Plusieurs centaines d ’allergènes dans le futur…
! N ’apporte pas de données sur la relevance clinique.
! Permet une meilleure détection des réactivités croisées par la
reconnaissance des sensibilisations vis à vis de familles
moléculaires.
Quel avenir pour les allergènes
recombinants ? (2)
! Application pour le diagnostic in VITRO (dès à présent)
! Cocktail de composition connue (à adapter en fonction des
prévalences de sensibilisation).
! Application in VIVO : tests cutanés, tests de provocation.
! Repertoire de familles moleculaire indispensable pour
interpréter les tests cutanés et les tests in vitro ! en cas de
sensibilisations concomitantes multiples.
Quel avenir pour les allergènes
recombinants ? (3)
! Immunothérapie sur mesure.

! Technologie des allergènes recombinants ! nombreuses


molécules hypoallergéniques, mais leurs propriétés n ’ont été
affirmées que par :
"des travaux expérimentaux sur l ’animal,
"des techniques d ’inhibition compétitives in vitro,
"des tests cutanés.

! Nécessité de prouver l ’efficacité thérapeutique égale ou


supérieure aux extraits classiques par des essais cliniques
contrôlés de désensibilisation.
Clonage des ADNc des différentes
molécules allergéniques Prévalence des
sensibilisations

100

50
Allergènes
recombinants r1 r2 r3 r4 rn
0
r1 r2 r3 r4

r1 r1r3 r3 r4 rn
allergènes hybrides épitopes T épitopes B Conjugaison
recombinants - CpG
Valenta et al., JACI 2007
P<0.004

150
P<0.001

100
Mean wheal areas (mm2)

50

histamine GP HM HM HM HM
(4) (12) (36) (108)

Molecule Hybride des Graminées.C.Metz-


Favre et col.JACI 2007;120:315-21
Applications thérapeutiques : la désensibilisation
1) Démonstration de l ’hypoallergénicité de molécules recombinantes
modifiées
" fragments Bet v 1 (F1aa1-74, F2aa75-106)
" polymères : dimères, trimères.

G. Pauli, A. Purohit,
J.P. Oster, F. de Blay et coll.,
Clin Exp Allergy 2000, 30, 1076-84
Applications thérapeutiques :
la désensibilisation
2) Désensibilisation avec les extraits hypoallergéniques.
Etude multicentrique : Vienne - Stockholm - Strasbourg
3 groupes : placebo - trimères - fragments
84 patients exploitables (présentation EAACI 2003).

" Efficacité clinique.

" Étude des modifications immunologiques IgE, IgG1,


IgG4, IgA

" Analyse des effets secondaires.


Bet v 1

Fragment 1 (1 - 73) and Fragment 2 (74 - 159)


Specific Immunotherapy with rBet v 1- Derivatives
Bet v 1 specific IgG1(Vienna)
Placebo Fragments Trimer
1000
10 7
1 12 8
5 14 15
6 24 18
13 27
100 SIT P 16 52
21
25
IgG1 [AU/ml]

17 64 26
20 68 33
23
34
29
41
30
10 43
32
46
37
48
38
49
39
50
1 51
56
57
58
61

0 ,1

0,7 0,6 0,8 0,8 0,2 24** 20** 2* 0,2 62** 22** 3**
1,3 1,4 1,8 1,4 0,4 89 30 7 1,5 71 25 7

1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4
Désensibilisation
! Jutel et coll. (injection ) : Phl p 1, Phl p 2, Phl p 5a, Phl p 5b,
Phl p 6.
"Augmentation IgG1 et IgG4 ! réponse immunologique
"29 actifs, 28 placebo
"Différence de score symptômes-médicaments : 38,9 % (p =
0,04)
JACI 2005
! Etude multicentrique (injection) : Bet v 1 (France, Suède,
Danemark, Autriche)
32 nBet 1 33 rBet v 1 33 bouleau 36 placebo
EAACI 2006
ITT
ITTPopulation)
Primary efficacy analysis
Total ( (RC)
Population)
Totalsymptom
symptom score
scoreof
ofrhinoconjunctivitis
rhinoconjunctivitis

Daily average total score of RC by treatment group Daily average total score of RC by treatment group
Pollinic peak 2004 Pollinic peak 2005
9 9
8 8
7 7
6 6

Mean score.
Mean score.

5 5
4 4
3 3
2 2
1 1
0 0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

Day number Day number


Placebo (n=35) n Bet v1 (n=29) r Bet v1 (n=32) Birch (n=29) Placebo (n=29) n Bet v1 (n=27) r Bet v1 (n=29) Birch (n=23)