Ambiente atmosférico 210 (2019) 132–142

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Ambiente Atmosférico

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Más allá de la tolerancia al ozono: los efectos de la fumigación con ozono sobre oligoelementos y HAP
enriquecido thalli del biomonitor liquen Pseudevernia furfuracea

Elva Cecconi una , Lorenzo Fortuna una , Elisa Pellegrini si , C , Stefano Bertuzzi re , Giacomo Lorenzini si , C ,
Cristina Nali si , C , Mauro Tretiach una , ∗
una Departamento de Ciencias de la Vida, Universidad de Trieste, Via L. Giorgieri 10, 34127, Trieste, Italia.
si Departamento de Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente, Universidad de Pisa, Via Del Borghetto 80, 56124, Pisa, Italia.
C CIRSEC, Centro para el impacto del cambio climático, Universidad de Pisa, Via Del Borghetto 80, 56124, Pisa, Italia
re Via Mazzini 2, 10066, Torre Pellice, Turín, Italia

GRÁFICAMENTE ABSTRACTO

Pseudevernia furfuracea mul exposición al campo de los contaminantes y tratamiento de laboratorio

3
con O

- 2,0
CK O 3
Hs PA
Elements
1,5
+
CK O 3 MDA F
Clásico Sitio de karst ( CK )
1.0 / Fvm
Valores estandarizados

-
RUO 3 0,5

+ 0.0
RUO 3
Antecedentes sitio ( BG ) Rural Urbano sitio ( RU )
-0,5
Colección de -

liquen norte UI O 3 -1.0

+
-1,5
UI O 3
Urban-I polvo sitio rial () UI

-2,0
Exposición de campo mi Tratamiento O - + + -
3
CK O 3 CK O 3 RU O
- 3 RU + O 3 UI O 3 UI O3
(6 semanas) (2 semanas)

RESUMEN
Palabras claves:

Contaminación del aire

En este estudio, los efectos del ozono (O 3) sobre la fisiología del liquen Pseudevernia furfuracea var. furfuracea
O3
previamente sometidos a condiciones de estrés de campo fueron evaluados. Las muestras recolectadas en un sitio prístino fueron expuestas durante 6
Bioacumulación Malondialdehído
semanas en 3 sitios caracterizados por diferentes contaminaciones, p.ej deposiciones elementales y de HAP (sitio RU, cerca de chimeneas de casas de leña;
Clorofila una fluorescencia fuga de
sitio UI, cerca de fundiciones de hierro; sitio CK, en un contexto seminatural). Posteriormente, las muestras se transfirieron a cámaras de fumigación
potasio
controladas, donde estaban O 3- tratado durante 2 semanas (250 ppb O 3 por 5 h día −1, O 3+ muestras) o no (0 ppb O 3, O 3− muestras) Tres marcadores fisiológicos
(F v / F metro,
rendimiento cuántico máximo de la fotoquímica primaria; MDA, contenido de malondialdehído; fuga de potasio), así como las concentraciones elementales
y de HAP se midieron en conjuntos de réplicas de muestras en cada etapa experimental. Los datos se exploraron mediante técnicas multivariadas y los
efectos de la exposición al campo y la fumigación se probaron mediante modelos lineales generalizados (GLM). Efectos perjudiciales sobre MDA y F v / F metro se
observaron limitadas a muestras expuestas en sitios RU y UI. Parámetros fisiológicos en O 3- Las muestras tratadas mostraron patrones de variación
heterogéneos con respecto a los expuestos al campo. Una recuperación de F v / F metro se observó en muestras expuestas a RU y UI, mientras que se destacó
un aumento significativo de MDA limitado a CK O 3+ y CK O 3− muestras, posiblemente relacionadas con un "efecto de cámara". En general, el deterioro
causado por la ozonización fue limitado, lo que demuestra la fuerte O 3-

tolerancia de nuestra especie de prueba. Curiosamente, el contenido de los HAP de 4 anillos más abundantes en RU O 3+ las muestras, que experimentaron el mayor
enriquecimiento de campo de HAP, fueron significativamente más bajas que las de RU O coincidentes 3−

muestras Esto sugirió un posible papel del ozono en la degradación de los HAP a nivel de talo, con interesantes

Abreviaturas Hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP); Ace, acenafteno; Acy, acenaftileno; Ant, antraceno; B [a] Ant, benzo [a] antraceno; B [ah] Ant, dibenzo [a, h] antraceno; B [a] Py, benzo [a] pireno; B
[b] Fl, benzo [b] fluoranteno; B [e] Py, benzo [e] pireno; B [ghi] Per, benzo [g, h, i] perileno; B [j + k] Fl, benzo [j + k] fluoranteno; Chry, criseno; F, fluoreno; Fl, fluoranteno; I [cd] Py, indeno [1,2,3-cd] pireno; N,
naftaleno; P, fenantreno; Py, pireno
∗ Autor correspondiente.

Dirección de correo electrónico: tretiach@units.it (M. Tretiach).

https://doi.org/10.1016/j.atmosenv.2019.03.026
Recibido el 21 de febrero de 2019; Recibido en forma revisada el 21 de marzo de 2019; Aceptado el 23 de marzo de 2019

Disponible en línea el 24 de marzo de 2019

1352-2310 / © 2019 Publicado por Elsevier Ltd.

E. Cecconi, y col.
repercusiones interpretativas en el contexto de encuestas basadas en trasplantes destinadas a evaluar las deposiciones de HAP cuando O 3 los niveles del suelo son
altos.
1. Introducción
Ozono troposférico (O 3) es un contaminante del aire secundario fuertemente oxidante y gases de
efecto invernadero ( Logan, 1985 ; Wu et al., 2008 ), formado por una serie de reacciones fotoquímicas
entre óxidos de nitrógeno (NO X) y compuestos orgánicos volátiles ( Hassan et al., 2013 ; Paoletti et al.,
2017 ;
Lefohn et al., 2018 ), y favorecido por las altas temperaturas. Los promedios anuales de ozono están
aumentando tanto en sitios urbanos como rurales, siendo un componente importante del cambio
global Paoletti et al., 2014 ) En áreas muy contaminadas, los efectos de la exposición al ozono se
reconocen a nivel fisiológico, bioquímico y molecular ( Goumenaki et al., 2010 ) en varios organismos,
incluidos los humanos ( Chen et al., 2017 ;
Nuvolone et al., 2018 ) y plantas ( Nali et al., 2007 ; Paoletti, 2007 ;
Saitanis, 2008 ; Sarkar et al., 2010 ) El O 3- La sensibilidad de las plantas es muy variable ( Schraudner
et al., 1998 ) y principalmente relacionados con su capacidad para desintoxicar especies reactivas de
oxígeno (ROS; Frei et al., 2010 ) Se sabe que existen varios mecanismos de desintoxicación de ROS
en las plantas, y algunos de estos incluso se reconocen como específicos de la variedad. Un caso
puntual a este respecto es Nicotiana tabacum, con su O 3- supersensible y O 3- cultivares tolerantes
(Bel-W3 y Bel-B, respectivamente), que permitieron el desarrollo de un protocolo estandarizado para
biomonitorizar el aire ambiente O 3
concentraciones (EN 16789: 2016), así como para producir kits de plántulas miniaturizadas para
exteriores O 3 biomonitoreo ( Lorenzini, 1994 ; Nali et al., 2007 ; Lorenzini y Nali, 2018 ) Además de las
plantas, los efectos de O 3 También fueron investigados en líquenes. Estos organismos simbióticos,
ampliamente utilizados como biomonitores de la contaminación atmosférica, son sensibles a una
variedad de contaminantes gaseosos, pero su respuesta a O 3 Todavía se debate. Los estudios de
campo llevados a cabo a lo largo de gradientes oxidantes, junto con el análisis de muestras de
herbario, destacaron cantidades residuales o no ocurrieron especies que alguna vez fueron
abundantes (en su mayoría cianoliquenos: Collema nigrescens, Peltigera spp. Pseudociphellaria spp.,
pero también clorolichens del género Usnea) en sitios que experimentaron un aumento sustancial de O 3
concentraciones ( Sigal y Nash III, 1983 ;
Nash III, 2008 ) Sin embargo, varios estudios recientes realizados en cámaras superiores abiertas y
cámaras de fumigación destacaron un notable O 3- tolerancia de clorolichens para una amplia gama de
estudios metodológicos, destinados a proporcionar metodologías estandarizadas ( p.ej, Adamo et al.,
O 3 concentraciones [(0-) 10–250 (-50˙000) ppb]. En estos estudios, la respuesta de líquenes a O 3 generalmente
se investigó (i) en entornos controlados total o parcialmente ( p.ej, Brown y Smirnoff, 1978 ; Nash et al., 2007 ,
1979 ; Ross y Nash III, 1983 ; Sigal y Johnston, 1986 ; Scheidegger y Schroeter, 1995 ;
Tarhanen et al., 1997 ; Riddell et al., 2010 ; Bertuzzi et al., 2013 , 2018 ;
Pellegrini et al., 2014 ; Vannini et al., 2018 ), con la justificación de controlar / minimizar los efectos
relacionados con las causas ambientales accesorias del estrés fisiológico, y (ii) directamente en el
campo, " en plein air ", Con el objetivo de evaluar y / o desenredar los efectos fisiológicos causados
​por O 3 cuando concurre con otros contaminantes gaseosos (como NO X, HNO gaseoso 3 y entonces 2; Eggertodavía conectado a C. Se transportaron ramitas de 15-20 cm de largo al laboratorio en bolsas de
et al., 1993 ; Riddell et al., 2012 ;
Tretiach et al., 2012 ) La evaluación de los efectos compuestos de los contaminantes en la fisiología
de los biomonitores está recibiendo un interés creciente en los últimos años, porque existe una
necesidad urgente de estudiar el comportamiento de los biomonitores en respuesta no a los
xenobióticos únicos, sino a sus mezclas naturales ( p.ej, Sujetovienė y Galinytė, 2016 ) De hecho, este
conocimiento es necesario para convertir correctamente la información que pueden brindar en la
evaluación de la calidad del aire.
El fruticose macrolichen Pseudevernia furfuracea var. furfuracea
(L.) Zopf. es un bioacumulador de amplio uso en biomonitoreo activo ( p.ej, Sloof, 1995 ; Tretiach et al.,
2011 ; Nascimbene et al., 2014 ; Kodnik et al., 2015 ), siendo localmente abundante ( Cecconi et al.,
2018 ) y tolerante a varios contaminantes fitotóxicos gaseosos ( Miszalski y Niewiadomska, 1993 ; Tretiach exposición en el campo y la fumigación posterior.
et al., 2007 ; Malaspina et al., 2018 ), a causa de un
133
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maquinaria antioxidante eficiente, que permite la supervivencia de esta especie en ambientes
caracterizados por altos rayos UV, alta luz y bajas temperaturas. En un estudio basado en cámaras
de fumigación de campo, este clorolichen se definió como O 3- tolerante por Scheidegger y Schroeter
(1995) , porque no se observaron efectos perjudiciales a nivel ultraestructural o funcional (clorofila una
fluorescencia, Chl una F, que se utiliza como proxy de la funcionalidad del fotosistema). En sus
experimentos, como se hizo en la mayoría de los trabajos citados anteriormente, los autores
utilizaron muestras sanas recolectadas a propósito en ambientes "prístinos".
El objetivo de este estudio fue evaluar la respuesta a O 3 de P. furfuracea
thalli, aún recolectado en ambientes "prístinos" como lo hizo Scheidegger y Schroeter (1995) , pero
preliminarmente sometido a una mezcla de contaminantes de origen múltiple y, por lo tanto,
enriquecido en ( p.ej) Partículas ricas en metales pesados, HAP, etc. Nuestra hipótesis de prueba fue
que los thalli previamente estresados ​en el campo exhibirían deterioro fisiológico debido al
tratamiento de ozonización subsiguiente. El estado fisiológico de las muestras se evaluó después de
cada paso experimental utilizando un enfoque de múltiples marcadores que abarca a ambos
compañeros simbióticos. Los biomarcadores incluyen la clorofila. una fluorescencia (Chl una F), el
contenido de malondialdehído (MDA) y la fuga de iones de potasio (fuga de K +), respectivamente
considerados como indicadores de la actividad fotosintética de la población de algas, peroxidación de
lípidos de membrana e integridad de la membrana.
2. Materiales y métodos
2.1. Material de liquen, recolección y preprocesamiento de muestras Pseudevernia furfuracea es un
liquen meso-xerófilo, que crece en sustratos de corteza ácida pobres en nutrientes ( Nimis, 2016 ) La
especie se propaga en áreas templadas frías, donde puede ser localmente muy común ( Rikkinen,
1997 ; Smith et al., 2009 ) El talo dorsi-ventral está muy ramificado con superficies superiores a
menudo cubiertas por crecimientos en forma de dedo (isidia), que aumentan considerablemente la
superficie de intercambio por área y unidad de masa ( Tretiach et al., 2005 ) y el atrapamiento de
partículas ( Bargagli y Mikhailova, 2002 ) El gran tamaño de talo y la fácil identificación en el campo
aseguran un muestreo y preparación rápidos. P. furfuracea También se ha centrado en varios
2008 ; Incerti et al., 2017 ) y mejorar la calidad de los datos en biomonitoreo ( Cecconi et al., 2018 )
Thalli de P. furfuracea var. furfuracea fueron recolectados de alerces aislados ( Larix decidua L.) en
un área de fondo (en adelante BG;
Cecconi et al., 2018 ) de los Alpes Carnic (Lateis, NE Italia) a 1500m sobre el nivel del mar Thalli,
papel y se dejaron secar con poca luz a temperatura ambiente durante 24 h. El material de líquenes
se limpió cuidadosamente de fragmentos de corteza, escombros y otras especies de líquenes y
musgos. Se seleccionaron para la experimentación los talliidos de isidia moderada de tamaño y
ramificación comparables, sin estructuras reproductivas sexuales ( Tretiach et al., 2007 , 2011 ; Incerti
et al., 2017 ) Se obtuvieron diferentes conjuntos de 5 muestras de cada uno del material de liquen a
granel con el objetivo de evaluar los parámetros fisiológicos, el contenido elemental y de HAP antes
de los tratamientos experimentales (en adelante, 'exposición previa' o muestras de BG): estas
muestras se deshidrataron en gel de sílice durante 48 h, sellado al vacío y almacenado a -20 ° C
hasta el final del experimento. El material de liquen restante se montó en dispositivos de exposición.
Un único dispositivo de exposición consistía en una varilla de madera de 120 cm de largo con thalli
todavía unido a sus ramitas en una cantidad suficiente para construir conjuntos de 3 réplicas de
muestra para evaluar los parámetros fisiológicos, el contenido elemental y de HAP después de la
E. Cecconi, y col.
2.2. Diseño experimental: exposición de campo y O 3 fumigación
Para evaluar la respuesta fisiológica de nuestra especie de prueba a O 3, Se planeó un experimento
de doble paso. Primeramente, P. furfuracea los thalli fueron expuestos durante 6 semanas en tres sitios
con diferentes cargas de contaminantes (principalmente deposiciones elementales y de HAP). La
exposición de campo fue seguida por una estancia de 2 semanas en cámaras de fumigación, donde las
muestras eran O 3- tratado o no En cada paso experimental ( es decir, antes y después de la exposición
en el campo y después de la fumigación controlada), el conjunto de marcadores fisiológicos
seleccionados, así como las concentraciones elementales y de HAP se midieron en conjuntos
coincidentes de réplicas de muestras.
La exposición de campo se llevó a cabo en la provincia de Trieste (NE Italia), entre el 18 de
febrero y el 4 de abril de 2016 para evitar el ambiente de verano O 3 niveles ( Nali et al., 2007 ) Las
muestras de liquen, montadas en los dispositivos de exposición, se trasplantaron en tres sitios,
caracterizados por diferentes usos del suelo: i) un sitio seminatural en el Karst clásico (CK), lejos de
las principales fuentes de contaminación antropogénica; ii) un sitio rural-urbano (RU) en el Karst
clásico, donde las muestras de líquenes se colocaron a propósito cerca de las chimeneas de casas
de leña con intensa actividad; iii) un sitio urbano-industrial (IU) en la ciudad de Trieste, cerca de una
gran fábrica de hierro fundido operativo ( ARPA FVG, 2018a ; Suplementario Fig. S1 ) Durante la
exposición en el campo, los registradores de datos EL-USB-2 recolectaron continuamente la
temperatura del aire y la humedad relativa en los tres sitios. Los dispositivos de exposición se
aseguraron a soportes artificiales a 4 m del suelo. Después de 6 semanas, las muestras de liquen
fueron recuperadas, selladas y transportadas en bolsas frías al laboratorio. Un primer conjunto de 3
muestras por sitio de exposición se procesó inmediatamente para medir los parámetros fisiológicos
(sección 2.4), mientras que un segundo conjunto se procesó y almacenó para la determinación del
contenido elemental y de HAP (sección 2.3) al final del experimento ( muestras expuestas en el
campo; tabla 1 ) Otros dos grupos emparejados de 3 muestras por sitio de exposición fueron sellados
y transportados a la Universidad de Pisa, donde se llevó a cabo la fumigación.
Las muestras se colocaron durante 2 semanas en un sistema ventilado de 0.90 × 0.90 ×
Cámara Perspex de 0,65 cm con entrada de aire (dos cambios de aire completos mín. −1) sometido o
no a 250 ± 4 ppb O 3 ( aquí, la notación O 3+ y O 3− se refiere a muestras ya sea O 3- tratado o no; tabla 1 ),
previsto para 5 h día −1 en forma de onda cuadrada generada por un aparato Fisher 500 refrigerado
por aire (Zurich, CH) suministrado con oxígeno puro. El riego de la muestra, necesario para asegurar
un metabolismo mínimo para C. 3 h día −1, se realizó mediante pulverización C. 0,01 ml cm 2 dH 2 O en la
mañana, inmediatamente antes de la entrada de O 3 ( Bertuzzi et al., 2018 ) Una densidad de flujo de
fotones fotosintéticos (PPFD) de 60 μmol de fotones m −2 s −1
fue proporcionado por 12 h día −1 por cuatro lámparas de halogenuros metálicos de cuarzo con bombilla exterior
transparente (400W, MASTER HPI-T Plus, Philips, NL) y por cuatro lámparas de sodio de alta presión con
bombilla exterior tubular transparente (250W, SON-
T, Philips, NL).
Después de la fumigación, las muestras se secaron a temperatura ambiente con luz tenue durante 12
h. En consecuencia, O 3+ y O 3− Las muestras se procesaron para evaluar los parámetros fisiológicos, el
contenido elemental y de HAP como se describe a continuación.
tabla 1
Lista de factores experimentales y descripción de sus niveles.
Factor experimental Niveles y descripción
Exposición de campo ( Exp.) CK Muestras expuestas en el sitio natural próximo en el Karst
clásico.
RU Muestras expuestas en el sitio rural-urbano, cerca de
chimeneas de casas de leña.
UI Muestras expuestas en los sitios urbanos-industriales, cerca de una
fundición de hierro en funcionamiento.
Fumigacion ( Fum.) CK O 3+ Muestras expuestas en los sitios de campo, luego
RU O 3+ ozonizadas en cámaras de fumigación.
UI O 3+
CK O 3− Muestras expuestas en los sitios de campo, no ozonizadas pero
RU O 3− mantenidas en cámaras de fumigación en las mismas condiciones
UI O 3− ambientales de O 3+ muestras
134
Ambiente atmosférico 210 (2019) 132–142
2.3. Procedimientos analíticos
Preexposición (BG), expuesto al campo (CK, RU, UI) y fumigado (CK O 3−, CK O 3+, RU O 3−, RU O 3+,
UI O 3−, UI O 3+) Las muestras se procesaron individualmente para la determinación del contenido
elemental y de HAP.
2.3.1. Contenido elemental
Las muestras destinadas al análisis elemental se secaron durante 12 h, y se seleccionaron
lóbulos terminales de 2,5 cm para ensamblar muestras de 1 g, que se pulverizaron con un molino de
bolas planetario (Retsch PM100); el polvo resultante se secó durante la noche a 40 ° C y se
almacenó en microtubos ( Bargagli y Nimis, 2002 ) Posteriormente, el lote se sometió a la
determinación del contenido de 25 elementos (Al, As, Ba, Ca, Cd, Cr, Cu, Fe, K, Li, Mg, Mo, Mn, Na,
Ni, P, Pb, S, Sb, Sc, Se, Sn, Ti, V, Zn). Se digirieron divisiones duplicadas de 0,25 g en un HNO 3 mi HClO
44 mi Solución de HF hasta humear y luego secar; El residuo resultante se disolvió en una solución de
HCl al 50% y se calentó. El contenido elemental se determinó mediante un espectrómetro de masas
Perkin Elmer Elan 6000 ICP y todos los valores se expresaron sobre una base de peso seco (DW)
(μg g −1). La precisión se expresó en términos de porcentajes de recuperación promedio, calculados
como la relación entre los valores de concentración certificados para el material de referencia
estándar BCR 482 ( Quevauviller et al., 1996 ) y las medidas en partes alícuotas del mismo estándar
incluidas a ciegas en el lote ( Tabla suplementaria S1 )
2.3.2. HAP
Las muestras destinadas al análisis de HAP se secaron durante 12 h, y se seleccionaron lóbulos
terminales de 2,5 cm para ensamblar muestras de 1,5 g, que se cortaron finamente con tijeras de
cerámica, sellaron en frascos de vidrio y se mantuvieron en la oscuridad a 4 ° C hasta la
determinación analítica. ( Augusto et al., 2013 ) El contenido de 16 HAP prioritarios de la EPA ( es
decir, As, Acy, Ant, F, P, Chry, Fl, Py, B [a] Ant, B [ah] Ant, B [a] Py, B [b] Fl, B [e] Py, B [j + k] Fl, I [cd]
Py, B [ghi] Per) más B [e] Py se midió. Antes del análisis, los HAP se extrajeron de muestras de
liquen utilizando 30 ml de una mezcla de hexano / diclorometano (1: 1) en un sistema de extracción
por microondas Milestone Start E, de acuerdo con el método 3546 de la EPA de EE. UU. ( EPA,
2018a ) Posteriormente, las muestras fueron purificadas por Supelclean ™ LC-NH 2 Tubo SPE (lecho
500 mg), filtrado, concentrado a 1 ml y evaporado adicionalmente. El contenido de HAP se determinó
por medio de cromatografía de gases-espectrómetro de masas (GC-MS triple cuadrupolo, Bruker,
modelo TQ300), de acuerdo con el método 8270 de la EPA de EE. UU. ( EPA, 2018b ) Todos los
valores se expresaron en base a DW (ng g −1). La precisión del procedimiento analítico se evaluó en
términos de concentraciones medidas a esperadas de estándares de PAH deuterados añadidos a las
muestras experimentales antes de la extracción.
2.4. Mediciones fisiológicas
El estado fisiológico de las muestras de liquen se evaluó midiendo la clorofila. una fluorescencia
(Chl una F), el contenido de maldendialdehído (MDA) y la fuga de iones de potasio (fuga de K +).
2.4.1 La clorofila una fluorescencia
Chl una F se evaluó en términos del rendimiento cuántico máximo de la fotoquímica primaria en
muestras oscuras adaptadas (F v / F metro) y enfriamiento no fotoquímico (NPQ). Las mediciones se
llevaron a cabo en 6 lóbulos (60 ± 5 mg cada uno) por muestra, seleccionados al azar para cada
grupo experimental. Antes chl una Mediciones F, las muestras se hidrataron en un frasco de vidrio a
100% de humedad relativa (HR) durante 24 h (PPFD, 29 ± 2 μmol fotones m −2 s −1; 18 ± 1 ° C; 12 h
oscuro / 12 h claro) y, en consecuencia, enjuagado durante 3 min en dH 2 O. Luego, los lóbulos
seleccionados se agitaron suavemente para eliminar el exceso de dH 2 O y oscuro adaptado por
30min. Chl una Las mediciones de F se tomaron con un fluorómetro modulado por amplitud de pulso
PAM-2000 (Walz, Effeltrich), colocando la fibra de medición a 60 ° en la superficie superior de los
lóbulos. La luz modulada se encendió para obtener el mínimo Chl una F nivel (F 0). Una saturación
E. Cecconi, y col.
pulso de luz de C. 8000 μmol de fotones m −2 s −1 durante 0,8 s se emitió para obtener el Chl máximo
transitorio una F nivel (F metro) y así calcular la variable Chl una F nivel (F v, es decir F metro −F 0) y la máxima
eficiencia cuántica de la fotoquímica PSII (F v / F metro). Se encendió una luz actínica externa provista por
una unidad de luz FL-460 (Walz, Effeltrich, D) con una lámpara halógena para registrar el efecto
Kautsky a una intensidad de 176 μmol de fotones m −2 s −1. Dicho valor es consistente con el PPFD
específico de la especie. Ik valor, es decir El flujo de fotones fotosintéticos al cual el rendimiento
cuántico de CO 2 la asimilación es la más alta ( Piccotto y Tretiach, 2010 ) Una vez que se alcanzó el
pico de emisión (F ' metro), Se aplicaron pulsos de luz saturantes a intervalos de 60 s durante la
iluminación actínica para determinar NPQ (ver p.ej, Panadero, 2008 ; Bussotti et al., 2011 ) NPQ se
calculó como (F metro −F ′ metro)/ F' metro. Chl una Las mediciones de F se repitieron en los mismos lóbulos
después de 48 h de recuperación, al 100% de HR y 29 μmol de fotones m −2 s −1.
2.4.2 Ensayo MDA
La peroxidación lipídica se determinó mediante el ensayo de sustancias reactivas de ácido
tiobarbitúrico (TBARS) siguiendo el método propuesto por
Candotto Carniel y col. (2017) y basado en Heath y Packer (1968) . Se pulverizaron tres muestras de
lóbulos (200 mg cada una) para cada grupo experimental con nitrógeno líquido, se liofilizaron, se
homogeneizaron en un mortero usando 1,5 ml de ácido tricloroacético al 0,1% (TCA) y se
centrifugaron a 12000 sol durante 20 minutos a temperatura ambiente. Se recogió una alícuota de 0,5
ml del sobrenadante y se mezcló con 1 ml de TCA al 20% con ácido tiobarbitúrico al 0,5% (TBA). La
mezcla se calentó a 95 ° C durante 25 min, se enfrió rápidamente en un baño de hielo y se centrifugó
a 15000 sol durante 10 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante se eliminó y se usó para
determinar la concentración de MDA. Las lecturas de absorbancia se tomaron a 532 nm usando un
espectrofotómetro Jenway 7315 UV-vis (Stone, Reino Unido) y se corrigieron por turbidez no
específica restando la absorbancia a 600 nm. La cantidad de MDA se calculó utilizando un
coeficiente de extinción molar de 155 mM −1 cm −1 y los resultados se expresaron como nmol g −1 ( DW).
2.4.3 K + fuga
Para investigar el daño de la membrana, K + la fuga se midió en 3 lóbulos (60 ± 5 mg cada uno)
por muestra, seleccionados al azar para cada grupo experimental. K + la fuga se midió siguiendo el
método propuesto por Candotto Carniel y col. (2017) . Los lóbulos terminales se enjuagaron en 25 ml
de dH 2 O y continuamente agitado a 100 rpm durante 60 min. Posteriormente, los lóbulos se retiraron
de las suspensiones, se secaron al horno a 80 ° C durante 24 hy se pesaron. El dH restante 2 O se
filtró (0,45 μm) y se almacenó a 4 ° C hasta el análisis. La concentración de K + acuosa se determinó
mediante espectroscopía de adsorción atómica de llama (Perkin Elmer Analyst 400) con una
incertidumbre inferior al 2%. El límite de detección (LOD) en la longitud de onda operativa de 766.5
nm fue 0.01mg l −1. Microtubos con dH 2 O solo fueron utilizados como espacios en blanco. K + la fuga
se expresó como mg de K + lixiviado por g (DW) de lóbulos de líquenes.
2.5. Análisis de los datos
Los datos se organizaron en una matriz de 27 casos (3 réplicas por 9 grupos experimentales) ×
34 variables. Las variables incluyeron 25 elementos químicos (sección 2.3.1), 5 categorías de HAP
(2, 3, 4, 5 y 6 anillos), la suma de todos los HAP ( Σ HAP) y 3 parámetros fisiológicos (F v / F metro, MDA y
K + fuga). Entre los parámetros de fluorescencia, NPQ no se incluyó debido a su alta correlación con
F v / F metro valores (rho de Spearman
0,91, p < 0,01). La matriz se sometió preliminarmente a análisis exploratorio multivariante. En
particular, se realizó un Análisis de Clúster jerárquico (CA) en la matriz de datos después de una
estandarización clásica de valores (los valores estandarizados se obtuvieron de los valores originales
por
135
Ambiente atmosférico 210 (2019) 132–142
resta de la media de todas las muestras, y dividiendo el resultado por la desviación estándar), para
garantizar la total conmensurabilidad de las variables ( Podani, 2007 ) CA se realizó para el conjunto
de 25 elementos con distancia euclidiana como medida de distancia y el método de Ward como
algoritmo de agrupación. Se realizó un análisis de componentes principales (PCA) basado en
correlaciones entre las variables en la matriz de datos que informa valores no estandarizados. En el
PCA, las clases de uso de la tierra de los sitios de exposición ( tabla 1 ) se representaron como
variables suplementarias siguiendo el enfoque sugerido por Legendre y Legendre (1998) . Además,
se probaron diferencias significativas entre los parámetros fisiológicos en las muestras
experimentales utilizando el ANOVA de Kruskal-Wallis y la prueba post hoc no paramétrica de Dunn
( Dinno, 2017 ) Para desenredar los efectos de la exposición de campo y O 3-
Para el tratamiento del estado fisiológico del liquen thalli, se ajustaron modelos lineales
generalizados (GLM), limitados a la matriz de datos de las réplicas de muestras fumigadas
emparejadas. Efectos principales e interactivos de la exposición de campo (efecto fijo con 3 niveles, tabla
1 ) y fumigación (efecto fijo con 2 niveles, tabla 1 ) se evaluaron considerando variables fisiológicas,
HAP y contenido elemental como variables dependientes. En particular, se utilizaron valores
estandarizados para cada variable objetivo, considerando por separado cada valor como una
observación individual.
Todos los análisis de datos y gráficos se realizaron con los paquetes de software Statistica v. 10
(StatSoft Inc., Tulsa, OK, EE. UU.) Y R ( R Core Team, 2013 ) La significación estadística se probó a α
= 0.05 en todos los casos.
3. Resultados
3.1. Oligoelemento y enriquecimiento de HAP en thalli expuestos al campo
Muestras expuestas durante 6 semanas en los sitios de campo CK, RU y UI ( Suplementario Fig.
S1 ) exhibieron diferentes HAP y contenido elemental.
Como era de esperar, las muestras expuestas en el sitio seminatural CK no mostraron una
variación significativa con respecto a la situación de fondo para la HAP general y el contenido del
elemento, así como para cada uno de los tres grupos de elementos, según lo identificado por la AC ( Suplementario
Fig. S2 ) Por el contrario, las muestras expuestas en el sitio RU mostraron un aumento en el contenido
elemental, especialmente para los elementos del grupo I (Ca, Cd, Mg, Na, Sc y V; Figura 1 ), pero
también un aumento notable de HAP (excepto HAP-2; ver también resultados post hoc para el
contenido de HAP en Tabla 2 ) Las muestras expuestas en la IU del sitio también exhibieron mayor
contenido de HAP y elemental, sin embargo, la acumulación de HAP fue menos pronunciada que en
las muestras de RU; en la UI del sitio, se observó el mayor enriquecimiento elemental para elementos
del grupo II (Al, Ba, Cr, Fe, Li, Mo, Pb, S, Se, Ti y Zn; Figura 1 ) En general, el enriquecimiento
elemental en las muestras de RU y UI fue bastante limitado. De hecho, al expresar los datos de
concentración de elementos de muestras expuestas ( MI) con respecto al de las muestras no
expuestas ( U) en términos de su relación ( es decir, la llamada UE proporción, Cecconi et al., 2019 ),
solo unos pocos elementos excedieron el valor de 1.5 ( es decir, El contenido elemental aumentó más
del 50% en muestras expuestas). A saber, Na altamente acumulado en todos los sitios de exposición
(2.72, 7.60 y 4.07 en muestras de CK, RU y UI, respectivamente), Ti y Sb (1.56 y 1.59) en el sitio RU,
y Al, Fe y Sb (1.67, 3.67 y 1.83) en la interfaz de usuario del sitio.
Con respecto a la contribución relativa de las diferentes categorías de HAP a su acumulación
general, los HAP de 3 y 4 anillos mostraron la acumulación más significativa en el sitio RU, seguido por
la IU del sitio (solo para los HAP de 3 anillos); Los HAP de 5 y 6 anillos aumentaron significativamente en
las muestras de RU. Los HAP de dos anillos no mostraron ningún aumento significativo en los grupos de
muestra ( Tabla 2 )
Diferentes grupos de muestras segregadas en el espacio de ordenación definidas por los dos
primeros componentes principales (PC), independientemente de
E. Cecconi, y col. Ambiente atmosférico 210 (2019) 132–142

3.0 Figura 1. HAP estandarizado y contenido elemental (reportado por

HAP
separado para los grupos de 3 elementos derivados de CA, y para

2.5 los 25 elementos) en muestras del liquen epifítico Pseudevernia

furfuracea
2,0 Mg,
Mn, Na, Sc,
Ni,Ti,
P, V)Sn) Elementos de grupo I (Ca, Cd,
Sb, var. furfuracea recolectado en un sitio de fondo (BG) y trasplantado en los
S, Se,
Elementos Zn)
delElementos delBa,
grupo II (Al, grupo III (As,
Cr, Fe, Cu, Pb,
Li, Mo, K,
sitios de exposición (CK, Karst clásico; RU, sitio rural-urbano; UI, sitio

1,5 urbano-industrial). Los datos se muestran como promedio e intervalo de

Contenido estandarizado

confianza del 95%: los valores positivos y negativos de las barras indican
el desplazamiento de la desviación estándar del valor medio.
1.0 Todos los elementos

0,5

0.0

- 0,5

- 1.0

- 1,5

BG CK RU UI

Grupos de muestras

Tabla 2
Desviación media y estándar de las variables objetivo (parámetros fisiológicos y contenido de HAP) en diferentes grupos de muestras (etiquetadas como en tabla 1 ) del liquen epifítico Pseudevernia furfuracea var. furfuracea
( n = 5 para el grupo BG, n = 3 para el resto de grupos). Las variables objetivo incluyen el contenido de malondialdehído (MDA; nmol g −1), fuga de potasio (K + fuga; mg g −1), máxima eficiencia cuántica del fotosistema II
(F v / F metro), la suma de 18 hidrocarburos aromáticos policíclicos, así como la suma de HAP con 2, 3, 4, 5 y 6 anillos (respectivamente, Σ HAP, HAP-2, HAP-3, HAP-4, HAP-5 y HAP-6; expresado en ng g −1). Después de
ANOVA unidireccional, diferentes letras indican grupos significativamente diferentes dentro de cada columna (prueba post hoc de Dunn en p < 0,05). Grupo

Marcadores fisiológicos Contenido de HAP

MDA K + fuga F v / F metro Σ HAP PAH-2 PAH-3 PAH-4 PAH-5 PAH-6

BG 15.9 ± 0.9 una 0.131 ± 0.023 ab 0.719 ± 0.009 C 200,2 ± 129,1 una 22,8 ± 30,0 una 79,3 ± 54,8 una 68,8 ± 57,3 una 22.0 ± 12.4 ab 7.3 ± 3.9 una
CK 12,5 ± 1,2 una 0.124 ± 0.014 ab 0.700 ± 0.021 C 245,5 ± 76,1 una 39,9 ± 13,3 una 96,8 ± 21,0 una 93,2 ± 39,8 ab 11,9 ± 4,3 una 3.8 ± 0.1 una
RU 56.4 ± 5.9 re 0.224 ± 0.013 si 0.505 ± 0.090 una 4023,2 ± 1164,4 C 30,1 ± 10,8 una 1374.5 ± 341.0 C 2510.5 ± 800.3 re 92.8 ± 24.5 C 15,3 ± 7,4 si
UI 24,5 ± 1,9 antes de Cristo 0.145 ± 0.094 ab 0.593 ± 0.034 ab 813,4 ± 191 si 88,3 ± 22,5 una 309,2 ± 39,6 si 368,9 ± 128,0 ab 38,8 ± 24,9 si 8.2 ± 5.8 ab
CK O 3− 21,6 ± 1,1 si 0.105 ± 0.016 ab 0.708 ± 0.007 C 185,4 ± 23,7 una 15.9 ± 7.2 una 82,9 ± 4,3 una 58.7 ± 4.2 una 21,6 ± 11,5 ab 7.1 ± 5.7 una
CK O 3+ 29,3 ± 0,6 C 0.093 ± 0.073 una 0.713 ± 0.013 C 206,0 ± 20,8 una 13,7 ± 7,5 una 75,1 ± 17,1 una 89,2 ± 12,9 ab 22,7 ± 5,9 ab 6.2 ± 4.2 una
RU O 3− 71,2 ± 2,3 mi 0.161 ± 0.059 ab 0.569 ± 0.178 ab 1492,7 ± 169,5 si 31,9 ± 1,8 una 567,1 ± 85,1 si 856,1 ± 61,7 C 39.0 ± 24.6 ab 6,9 ± 5,3 una
RU O 3+ 57,3 ± 3,9 re 0.199 ± 0.137 ab 0.646 ± 0.065 antes de Cristo 1152.7 ± 175.6 si 35,1 ± 29,4 una 558,8 ± 41,5 si 530,2 ± 122,4 si 22,6 ± 11,4 ab 7.0 ± 5.5 una
UI O 3− 26,4 ± 4,3 antes de Cristo 0,205 ± 0,061 ab 0.680 ± 0.021 antes de Cristo 234,5 ± 22,1 una 21,6 ± 6,6 una 86,9 ± 7,8 una 105,6 ± 15,3 ab 17,6 ± 7,8 ab 3.8 ± 0.1 una
UI O 3+ 24.0 ± 0.8 si 0.123 ± 0.079 ab 0.640 ± 0.062 antes de Cristo 236,1 ± 17,3 una 21,3 ± 7,0 una 90,5 ± 13,2 una 110,9 ± 18,7 ab 10.5 ± 1.8 una 3.6 ± 0.2 una

tratamiento de fumigación ( Figura 2 UNA). Las réplicas de muestra expuestas en el sitio CK se
colocaron con puntajes positivos de PC 1, mientras que las muestras RU y UI se colocaron con
puntajes negativos de PC 1, caracterizados respectivamente por puntajes positivos y negativos de PC
2 ( Figura 2 UNA). Se colocaron diferentes categorías de HAP (3 - 6 anillos) en el cuadrante IV del
espacio de ordenación, claramente asociado al uso de la tierra rural-urbana, mientras que los HAP de
2 anillos se asociaron positivamente al uso de la tierra urbano-industrial. Casi todos los 25 elementos
se colocaron en el tercer y cuarto cuadrante: en particular, Na, Mg, V y Sc (grupo I) se asociaron
positivamente al uso de la tierra rural-urbana, mientras que elementos como Fe, Pb y Zn ( grupo II) se
asociaron principalmente al uso del suelo urbano-industrial ( Las figs. 1 y 2B )
la humedad relativa más alta, mientras que la situación opuesta se destacó en el sitio
urbano-industrial (UI), cerca del mar. En cuanto a la temperatura diaria, el sitio RU fue más similar al
sitio CK que al sitio UI, mientras que la humedad relativa en RU fue intermedia entre los sitios CK y
UI ( Suplementario Fig. S3 A ) Después de la exposición de campo, el contenido de MDA mostró las
mayores variaciones con respecto a la preexposición ( Tabla 2 ) El PCA también destacó este patrón
fisiológico: el contenido de MDA mostró la mayor correlación negativa con la PC 1 (−0,65) y positiva
con la PC 2 (+0,58). Especialmente, la MDA estaba claramente asociada al aumento del contenido
de HAP, a su vez asociada al uso de la tierra rural-urbana del sitio de exposición ( Figura 2 SI). Con
respecto a MDA, K + la fuga mostró un patrón de correlación similar con las dos primeras PC, aunque
con correlaciones más bajas en cifras absolutas con ambos ejes (−0.32 con PC 1 y +0.29 con PC

3.2. Efectos de la exposición de campo y O 3- fumigación en fisiología de liquen

Los sitios de campo se caracterizaron por diferentes condiciones meteoclimáticas durante las 6 2) F v / F metro mostró el patrón opuesto, estando positivamente correlacionado con la PC 1 (+0.59) y
semanas de exposición. Como era de esperar, el sitio natural próximo (CK) se caracterizó por la negativamente con la PC 2 (−0.36), muy cerca del contenido de K en el espacio de ordenación ( Figura 2 SI).
temperatura diaria más baja y

136
E. Cecconi, y col. Ambiente atmosférico 210 (2019) 132–142

2,0

MDA
1,5
fuga K + F
/F
1.0 v metro

0,5

0.0

- 0,5

- 1.0

- 1,5

Valores estandarizados
- 2,0
- + + -
CKO 3 CKO 3 RU - O 3 RU +O 3 UI O 3 UI O 3

2,0

Elements
1,5
Elementos de PAH

1.0

0,5

0.0

- 0,5

- 1.0
- + + -
CKO 3 CKO 3 RU - O 3 RU +O 3 UI O 3 UI O 3

Grupos de muestras

Fig. 3. Valores estandarizados de variables fisiológicas (parte superior de la figura), HAP general y contenido
elemental (parte inferior de la figura). Diferentes grupos de muestras de liquen epifítico. Pseudevernia
furfuracea var. furfuracea se etiquetan como en tabla 1 . Los datos se muestran como medias y un intervalo de
confianza del 95% (los valores positivos y negativos de las barras indican el desplazamiento de la desviación
estándar del valor medio).

muestras para CK O 3−, CK O 3+ y RU O 3− (+ 72.8% + 134.4% y

Figura 2. ( A) Gráfico de PCA que muestra puntuaciones factoriales de réplicas de grupos de muestras del liquen
epifítico Pseudevernia furfuracea var. furfuracea, etiquetado como en
Tabla 1 y (B) vectores de carga de HAP, elementos, variables fisiológicas y sus relaciones con el tipo
de sitio de exposición (CK, karst clásico; RU, rural-urbano; UI, urbano-industrial) trazados como
variables suplementarias.
Las muestras de CK mostraron valores sin cambios de contenido de MDA, fuga de K + y F v / F metro
con respecto a las muestras de BG ( Tabla 2 ) Por el contrario, las muestras de RU exhibieron un
aumento significativo del contenido de MDA (+ 254.7%) y una disminución de F v / F m ( −29.8%),
asociado a una fuga de K + sin cambios. Finalmente, las muestras de IU exhibieron un patrón similar
al de las RU, aunque el deterioro fisiológico fue menos pronunciado (variación significativa de MDA y
F v / F metro: + 54,1% y -17,5%, respectivamente; Tabla 2 )
+ 26,2%, respectivamente). Por el contrario, UI O 3+ Las muestras mostraron una disminución no
significativa en el contenido de MDA. Además, F v / F metro los niveles aumentaron significativamente
para RU O 3+ (+ 27,9%). Finalmente, la fuga de K + se mantuvo sin cambios, independientemente de O 3
tratamiento ( Tabla 2 ) Al centrarse en muestras emparejadas emparejadas sometidas al tratamiento
de fumigación (O 3+ y O 3− muestras), la magnitud y el signo de las diferencias entre los parámetros
fisiológicos no se conservaron en los diferentes grupos experimentales. Limitando la descripción a
las variaciones significativas, CK O 3+ las muestras mostraron niveles más altos de MDA que CK O 3− unos
(+ 35.6%), mientras que se encontró lo contrario para RU O 3+ muestras (−19.5%; Tabla 2 , Fig. 3 ) Tal
patrón estaba de acuerdo con el resultado de los GLM. De hecho, los resultados de GLM mostraron
que, entre los marcadores probados, solo el contenido de MDA se vio significativamente afectado por
la exposición de campo y la fumigación ( Tabla 3 ) Además, el contenido de potasio y fósforo ( es decir, K
y P en Fig. 3 , los elementos principales relacionados con el estado fisiológico del liquen thalli) se
vieron significativamente afectados no solo por la exposición al campo, sino también por el
tratamiento de fumigación y su interacción ( Tabla suplementaria S2 ) Cuando se probaron las
diferencias significativas mediante la prueba de pares emparejados de Wilcoxon, el contenido de K y
P fue significativamente menor en la IU O 3+ muestras que en UI emparejada emparejada O 3− unos. El
patrón observado para el contenido de K concuerda bien con el observado para la fuga de K + (ver supra).

Los parámetros fisiológicos en las muestras fumigadas mostraron un patrón heterogéneo de

variación con respecto a las muestras expuestas en el campo. Sus niveles de MDA aumentaron
significativamente con respecto a los expuestos al campo.

137
E. Cecconi, y col. Ambiente atmosférico 210 (2019) 132–142

Tabla 3
Resumen de las pruebas del Modelo lineal generalizado (GLM) para los efectos principales y de interacción de la exposición de campo ( Exp.) y fumigación ( Fum.) sobre las variables fisiológicas (contenido de
malondialdehído, MDA; K + fuga; máxima eficiencia cuántica del fotosistema II, F v / F metro) y el contenido de HAP de 4, 5 y 6 anillos medidos en muestras de liquen epifítico Pseudevernia furfuracea var. furfuracea F-estadísticas
y pags- los valores se informan para cada factor y su interacción ( pags- los valores <0.05 se informan en cursiva). La varianza explicada y la significación estadística de todo el modelo se informan como ajustadas r 2 y el
nivel de significancia asociado debajo del nombre de la variable.

Variables fisiológicas HAP

Variable Efecto F valor p Variable Efecto F valor p Variable Efecto F valor p

MDA r 2 = 0,98 p Exp. 435.543 <10 −4 Σ HAP Exp. 239.947 <10 −4 PAH-4 Exp. 220.317 <10 −4
Fum. 5.398 0,039 r 2 = 0,97 p Fum. 4.936 0,046 r 2 = 0,97 p Fum. 12,267 0.004
<0,001 Exp. × Fum. 25,312 <10 −4 <0,001 Exp. × Fum. 6.037 0,015 <0,001 Exp. × Fum. 17.438 2.8 × 10 −4
K + fuga Exp. 1.734 0.218 PAH-2 Exp. 3.016 0,087 PAH-5 Exp. 2.262 0,147
r 2 = 0.03 p> Fum. 0.240 0.633 r 2 = 0.06 p> Fum. 0.001 0.974 r 2 = 0.11 p> Fum. 1.357 0.267
0.05 Exp. × Fum. 0.869 0,444 0.05 Exp. × Fum. 0,063 0.939 0.05 Exp. × Fum. 0.614 0,557
F v / F metro Exp. 2.353 0.137 PAH-3 Exp. 289.870 <10 −4 PAH-6 Exp. 0,995 0.398
r 2 = 0.07 p> Fum. 0,126 0,728 r 2 = 0,97 p Fum. 0,0491 0.828 r 2 = −0.21 p> Fum. 0,014 0,909
0.05 Exp. × Fum. 0,764 0,487 <0,001 Exp. × Fum. 0,0428 0.958 0.05 Exp. × Fum. 0,023 0.978

4. Discusión
4.1. Un biomonitor bastante tolerante
En este trabajo, evaluamos la respuesta fisiológica de
Pseudevernia furfuracea var. furfuracea a un campo multi-contaminante y exposición de laboratorio.
El estado fisiológico del liquen se evaluó en cada paso experimental en términos de actividad
fotosintética de la población de algas ( es decir, F v / F metro), peroxidación de lípidos de membrana ( es
decir, MDA) y la integridad de la membrana ( es decir, K + fuga).
Los líquenes recogidos en el área de BG mostraron Chl una Los valores de F son totalmente consistentes
con los evaluados previamente para la misma especie. De hecho, F v /
F metro los valores se encuentran dentro del rango informado por varios estudios para personas sin estrés P.
furfuracea thalli (0.610–0.750: p.ej, Calatayud et al., 1997 ;
Niewiadomska et al., 1998 ; Vidergar-Gorjup et al., 2001 ; Tretiach et al., 2007 ; Malaspina et al., 2018 )
Incluso para MDA, nuestros valores de GS fueron consistentes con los pocos datos disponibles para P.
furfuracea de sitios de fondo ( C. 10 nmol g −1 DW: Corapi et al., 2014 ; Lucadamo et al., 2015 ),
después de la corrección de las unidades de medida ( en litt. a Lucadamo). Sobre K + fuga, valores de
referencia para P. furfuracea están perdidos; sin embargo, nuestros valores fueron más bajos que los
reportados para muestras no estresadas del liquen trebouxioide Flavoparmelia caperata ( 0.170–0.300mg
g −1 DW;
Candotto Carniel et al., 2017 )
En general, el deterioro fisiológico de P. furfuracea después de la exposición de campo fue
et al., 2018 ) De hecho, la disminución de F v / F metro fue bastante limitado, confirmando la buena
resistencia de este liquen a las condiciones ambientales urbanas típicas (tales como altas
temperaturas e irradiación, y baja humedad del aire). Sin lugar a dudas, este típico liquen exigente de
luz de ambientes expuestos ( Wirth, 1995 ) posee características fisiológicas y morfoanatómicas
específicas que también le permiten hacer frente a la desecación prolongada ( Rikkinen, 1997 )
Al interpretar el patrón fisiológico de las muestras experimentales, se debe prestar atención a
los efectos de posibles factores de confusión. De hecho, la respuesta fisiológica de los líquenes
trasplantados a entornos urbanos está influenciada por varios factores, especialmente por la
interacción de las condiciones climáticas (ver Métodos suplementarios S1 para una descripción
climática del área de exposición) y contaminantes del aire ( Tretiach et al., 2012 ) Por estas razones, el
monitoreo de las condiciones meteoclimáticas, así como las cargas de contaminación fitotóxica
durante la exposición de muestras de líquenes, es de primordial importancia ( Piccotto et al., 2011 ) En
lo que respecta a las condiciones meteoclimáticas, los sitios en el Karst clásico (CK y RU)
experimentaron mayores precipitaciones que el sitio UI durante la exposición de 6 semanas (125 vs 96mm;
OSMER FVG, 2018 ), que refleja bien las diferencias climáticas entre estos contextos (Métodos
complementarios S1). El régimen del viento durante el período de exposición aclara los niveles de
enriquecimiento generalmente bajos revelados en las muestras expuestas en el sitio de IU. El viento
predominante de Bora, que sopla del noreste hacia el mar, limita definitivamente el enriquecimiento
de liquen relacionado con las deposiciones de partículas. De hecho, solo el Na y el Fe se acumularon
en gran medida (sección 3.1), reflejando respectivamente la influencia del mar (todos los sitios de
exposición) y la presencia cercana de una gran herrería (IU del sitio) ( Suplementario Fig. S1 Las

bastante limitada, aunque a veces significativa. De hecho, se destacaron variaciones significativas condiciones más favorables en los sitios CK y RU (ver sección 3.2 y

para la peroxidación lipídica y la fluorescencia de clorofila en muestras expuestas en el sitio

rural-urbano (RU), donde las deposiciones de HAP fueron las más altas ( Figura 1 ) En cambio, el O 3-

el tratamiento produjo un aumento significativo de MDA limitado a muestras previamente expuestas

en el sitio seminatural del Karst clásico ( es decir, Suplementario Fig. S3 A ) sugieren que el gradiente meteoclimático por sí solo no puede explicar el
CK O 3+ muestras) ( Tabla 2 ; Fig. 3 ) Nuestros resultados mostraron que, entre los marcadores patrón fisiológico observado, ya que los mayores efectos perjudiciales se observaron en los líquenes
fisiológicos probados, MDA y F v / F metro mostró la respuesta más clara a la contaminación y los trasplantados en el sitio RU, lo que significa que los gradientes de contaminantes deben considerarse
cambios ambientales ( Figura 2 ) La fuga de K + se utilizó anteriormente como un biomarcador muy definitivamente como prominentes. A este respecto, no podemos excluir un efecto de contaminantes
eficaz de SO 2 ( Tarhanen et al., 1996 ) y la contaminación por oligoelementos ( Tarhanen et al., 1999 ; Cuny gaseosos fitotóxicos como los óxidos de nitrógeno (NO X) y entonces 2, que se sabe que causan un
et al., 2002 ); sin embargo, en nuestro caso, K + la fuga mostró valores medios generalmente bajos y deterioro del rendimiento cuántico máximo de la fotoquímica del liquen primario ( Rao y LeBlanc,
un patrón de variación no significativo ( Tabla 2 ), así como correlaciones no significativas con 1966. ; Beckett et al., 2008 ; Piccotto et al., 2011 ) Durante la exposición de campo, las
elementos específicos (que van desde −0,26 a 0,40) y otros marcadores (0,37 y −0,42 con MDA y F v concentraciones medias de NO por hora 2 y entonces 2 medidos en una estación de monitoreo cerca
/ del sitio de IU fueron 32.0 ± 21.0 y 2.1 ± 3.4 μgm −3 ( ARPA FVG, 2018b , 2018c ; Suplementario Fig. S3
B ), con valores máximos muy inferiores a los límites de la UE para la salud humana (Directiva de la
F metro, respectivamente). Por un lado, este resultado sugiere que SO 2 y la contaminación por metales UE, 2008/50 / CE). No es posible desenredar completamente los efectos fisiológicos debido a los
experimentada por los thalli expuestos fue relativamente baja y, por otro lado, apoya la idea de que K diferentes contaminantes durante la exposición de muestras de liquen en el campo; sin embargo, NO 2
+ la fuga puede no reflejar únicamente la pérdida de integridad de la membrana causada por la Las emisiones en entornos urbanos están relacionadas principalmente con el tráfico vehicular
peroxidación de lípidos, como se hipotetizó previamente ( Cuny et al., 2004 ) La F v / F metro los valores (definitivamente prominente en el sitio de la IU), mientras que la quema de leña
después de la exposición al campo fueron completamente consistentes con los reportados por otros
autores para la misma especie ( Tretiach et al., 2007 ; Malaspina

138
E. Cecconi, y col.
Las actividades, que caracterizan el sitio RU, son reconocidas como fuentes de SO 2
( Cooper, 1980 ) En consecuencia, estos sitios pueden ser considerados como afectados por los
niveles más altos de NO en invierno 2 y entonces 2, respectivamente. Por lo tanto, una combinación de
material particulado rico en metales y NO X
causó de manera plausible el deterioro fisiológico (bastante limitado) observado en muestras
expuestas en la IU del sitio, mientras que una combinación de altos niveles de HAP y SO 2 causó el
de las muestras expuestas en el sitio RU, incluido el aumento significativo de los niveles de MDA. Sin
embargo, a este respecto, la fuerte coincidencia entre las tendencias de los HAP y el contenido de la
MDA sugiere un papel destacado de los HAP con respecto al SO 2 ( Figura 2 ; Fig. 3 ) Después de la
fumigación, el patrón fisiológico heterogéneo de las muestras (sección 3.2) representaba un
escenario interesante. Contrariamente a nuestra hipótesis original, las muestras de CK, que
experimentaron la contaminación más baja y las condiciones ambientales más favorables durante la
exposición al campo, sufrieron en términos relativos el mayor daño, reflejado por un aumento
significativo en el contenido de MDA que afecta tanto a CK O 3+ y CK O 3− muestras Considerando el
buen estado de salud de estas muestras inmediatamente después de la exposición al campo, es
muy factible que sufrieran el llamado "efecto de cámara" relacionado con el régimen de temperaturas
constantes en las cámaras de fumigación ( Bertuzzi et al., 2013 ), que eran más altas que las del
campo (sección 2.3, Suplementario Fig. S3 A ) Sin embargo, esto no fue suficiente para dañar la
población de algas, porque el Chl una Los niveles de F se mantuvieron estables ( Tabla 2 )
Curiosamente, para las muestras de IU (que experimentaron más condiciones estresantes que
las muestras de CK) se observó una recuperación de la población de algas, independientemente de
O 3 tratamiento. Aunque las variaciones no fueron significativas, F v / F metro aumentado en un 15% y 8%
en O 3− y O 3+ muestras con respecto a los expuestos al campo. F v / F metro los valores también
exhibieron ligeras diferencias entre UI O 3+ y UI O 3− muestras, la última tiene un valor 6% mayor que
la primera ( Tabla 2 ) El patrón de fluorescencia de O 3- Las muestras tratadas de CK y UI coinciden
bien con los resultados del otro trabajo individual que aborda la respuesta fisiológica P. furfuracea también
3( Scheidegger y Schroeter, 1995 ) De acuerdo con nuestros resultados,
P. furfuracea, expuesto durante 80 días a 180 μgm −3 ( día) y 80 μgm −3
(noche) de O 3 ( C. 90 y 40 ppb) en cámaras de fumigación de campo, siempre mostraron una variación
no significativa de F v / F metro valores ( Scheidegger y Schroeter, 1995 ) Este patrón también es
consistente con el resaltado para otras especies de líquenes trebouxioides ( Riddell et al., 2010 ; Pellegrini 4 anillos), los trazadores típicos de las actividades de quema de leña ( Boström et al., 2002 ; Singh et
et al., 2014 ; Bertuzzi et al., 2018 ) Sin embargo, se produjo una recuperación general de algas para
muestras de IU fumigadas. P. furfuracea es una especie tolerante a la desecación y se observó
previamente una recuperación de fotobiontes en un entorno totalmente controlado después de una
exposición de campo estresante ( p.ej, Kranner et al., 2003 ) Por lo tanto, dado que evitamos
deliberadamente la exposición de thalli húmedo a luz relativamente alta durante su estancia en las
cámaras de fumigación ( Bertuzzi et al., 2013 ; Pellegrini et al., 2014 ), el patrón observado contraviene
nuestra hipótesis original.
Las muestras de RU también exhibieron una recuperación general de la población de algas
durante su estadía en las cámaras de fumigación, con F v / F metro aumentó en 13% y 28% en O 3− y O 3+ muestras
con respecto a los expuestos al campo. En este caso, se aplican las mismas consideraciones
enunciadas para las muestras de IU, por lo que definitivamente se demuestra la notable O 3- tolerancia
de P. furfuracea. Por el contrario, el patrón fisiológico de F v / F metro y el contenido de MDA en muestras
de RU fumigadas coincidentes es opuesto al de las muestras de IU. De hecho, RU O 3− las muestras
exhibieron mayor contenido de MDA y menor F v /
F metro que RU O 3+ unos (diferencias que fueron respectivamente significativas o no, sección 3.2). Lo
más probable es que dicho patrón deba interpretarse en relación con los posibles fenómenos de
interacción entre los altos niveles de HAP acumulados durante la exposición al campo y el O 3 proporcionado al., 2014 ) Se podría argumentar por qué no se observó un patrón de agotamiento similar para la
posteriormente, que merece una explicación más detallada.
4.2. ¿Tiene el aire ambiente de verano O 3 afectar el contenido de HAP en biomonitores de liquen?
Un aspecto intrigante, con posibles implicaciones importantes para la interpretación de los
resultados de biomonitoreo, se refiere a las posibles interacciones entre O 3 e hidrocarburos
aromáticos policíclicos (HAP).
139
Ambiente atmosférico 210 (2019) 132–142
De hecho, la capacidad de O 3 en la degradación de los HAP adsorbidos o en fase gaseosa se ha
demostrado repetidamente en diferentes matrices ambientales ( Yao y Masten, 1992 ; Nam y Kukor,
2000 ) como suelos, sedimentos, agua y lodos ( p.ej, Kochany y Maguire, 1994 ; Bernal- Martinez et al.,
2005 ; Haapea y Tuhkanen, 2006 ; Hong et al., 2008 ) Recientemente, Kodnik y col. (2015) hipotetizó
que tales reacciones de degradación oxidativa también podrían ocurrir a nivel de talo en trasplantes
de liquen. A este respecto, encontramos un patrón interesante en relación con las muestras
fumigadas que experimentaron las mayores cargas de campo de HAP.
En primer lugar, el contenido de HAP en nuestras muestras de liquen generalmente se redujo
después de su estancia de 2 semanas en las cámaras de fumigación, especialmente en muestras
previamente expuestas en los sitios RU y UI, y dicha pérdida se extendió entre O 3+ y O 3− muestras
Dado que todas las muestras se almacenaron cuidadosamente en las mismas condiciones de
acuerdo con procedimientos estandarizados ( Augusto et al., 2013 ) y analizada de manera
contemporánea, esta pérdida (relacionada positivamente con el nivel de bioacumulación de HAP
ocurrida en el campo) probablemente se haya producido durante la fumigación. Curiosamente, se
demostró recientemente que la fase gaseosa Fl y B [a] Py se acumulan en la capa de algas
fotosintéticas, pero no se observaron pérdidas importantes durante su estancia en cámaras
climáticas ( Augusto et al., 2015 ) Sin embargo, no hay resultados disponibles para otros compuestos
aromáticos y HAP adsorbidos en partículas. Como las partículas se depositan principalmente en la
superficie del liquen o quedan atrapadas en los espacios intercelulares de la médula ( Garty et al.,
1979 ), tiene sentido suponer que, dependiendo de las características fisicoquímicas específicas del
compuesto, así como de las condiciones ambientales y el tiempo de residencia en un entorno
controlado, podría producirse una pérdida de HAP por liquen thalli. Además, aunque los HAP tienen
baja solubilidad en agua ( Huang et al., 1993 ), también es posible que estos puedan ser eliminados
mecánicamente debido a los procedimientos de rehidratación diarios (sección 2.2), como también se
esperaba Augusto y cols. (2015) , pero contextualmente no observado por los autores ( Augusto et al.,
2015 )
Dicho esto, surgió un patrón claro y notable para RU O 3+ y RU O 3− muestras previamente
expuestas en un sitio donde la leña en las chimeneas tradicionales es la fuente predominante de
compuestos orgánicos aerodispersos ( Mastral y Callén, 2000 ; Kodnik et al., 2015 ) En consecuencia,
estos se caracterizaron en gran medida por el contenido máximo de Fl, Py, B [a] Ant y Chry (HAP de
al., 2013 ) ( Fig. 4 ;
Suplementario Fig. S4 ) Curiosamente, después de la fumigación, F v / F metro en RU O 3+ las muestras
fueron más altas que en RU O 3− unos, mientras que el contenido de MDA y PAH de 4 anillos fue
significativamente menor. En particular, el contenido de Fl, Py, Chry y B [a] Ant en RU O 3+ las
muestras fueron 23%, 46%, 86% y 89% más bajas que en el RU O emparejado 3− muestras (prueba
emparejada de Wilcoxon, p < 0,05; Suplementario Fig. S4 ) Esto sugiere que la ozonización causó la
degradación de los HAP con la posterior mejora fisiológica.
La efectividad de O 3 en los HAP degradantes depende de la matriz objetivo ( Von Gunten, 2003 ; Masten
y Davies, 1997 ; Goi y Trapido, 2004 ), el peso molecular y la estructura de los compuestos, su estado
físico ( Abdel-Shafy y Mansour, 2016 ) y dosis oxidantes ( Siegrist et al., 2011 ) La complejidad
estructural y química de la matriz de líquenes no permite declaraciones concluyentes, y el diseño
experimental no fue concebido para probar esta hipótesis específica. Sin embargo, a la luz de tal
patrón abierto que afecta a las muestras de RU fumigadas, es muy factible que O 3 El tratamiento
actuó como un agente de agotamiento de los HAP residuales más abundantes retenidos en la capa
de algas. De hecho, los líquenes carecen de la cutícula cerosa que caracteriza las hojas de las
plantas vasculares, lo que permite la difusión de O 3 hacia las capas internas de líquenes ( Pellegrini et
segunda clase más abundante de los HAP de 3 anillos. En este sentido, se sabe que el O 3 El
tratamiento de los HAP de 4 anillos generalmente produce subproductos de 3 anillos ( Cochran et al.,
2016 ), que, según su destino, pueden enmascarar una tendencia a la baja, por lo tanto, inducen a
error en la interpretación de los resultados debido a posibles interferencias cromatográficas con HAP
nativos ( Janska et al., 2006 ; Fromberg
E. Cecconi, y col. Ambiente atmosférico 210 (2019) 132–142

PAH-2 PAH-3 PAH-4 PAH-5 PAH-6

A y 0.7 c % Ace B [a] Hormiga 0.7%

PAH 3 2.5% PAH 4 Chry 5%

4)
F 3,3% A t En general:
10,3% n
-1

PAH-2: 4.0%

1800 Py 40.2% Fl PAH-3: 41.7%

HAP (ng g)

54.6%
P 83,2%
1600 PAH-4: 49.5%

1400 PAH-5: 3.8%

1200 PAH-6: 1.0%

1000

0200400600800
- + - + - +
CK O 3 CK O 3 RU O 3 RU O 3 UI O 3 UI O 3

Grupos de muestras

Fig.4. Contenido de HAP en talos expuestos del liquen epifítico Pseudevernia furfuracea var. furfuracea, ozonizado o no (los grupos de muestras están etiquetados como en
tabla 1 ) Los datos se refieren a valores medios de HAP de 2, 3, 4, 5 y 6 anillos y desviaciones estándar generales. Las inserciones de los gráficos circulares muestran la contribución de los HAP de 3 y 4 anillos, los compuestos aromáticos policíclicos

más abundantes revelados en muestras expuestas.

et al., 2007 ) Sin lugar a dudas, se necesita más investigación para aclarar el destino de los diferentes Agradecimientos

HAP en fase en los líquenes, sin embargo, el monitoreo de O 3

los niveles del suelo deberían convertirse en una precaución de rutina durante las campañas de Gracias a Nives Orlić y Daniel A. Puente Anzil (Trieste) por su ayuda en el procesamiento de
verano con líquenes como biomonitores, para evitar la posible subestimación de los HAP muestras y clorofila. una Mediciones de fluorescencia. Este estudio fue financiado bajo el proyecto
bioacumulados. PRIN. N. 20109E8F95 "TreeCity", nat. resp. Prof. G. Lorenzini, y por fondos DTN (foop) del Prof. M.
Tretiach.

5. Conclusiones
Apéndice A. Datos suplementarios
Este estudio proporciona otra pieza al liquen O 3- rompecabezas de tolerancia enfrentado en una
serie de estudios recientes ( Riddell et al., 2010 ; Bertuzzi et al., 2013 , 2018 ; Pellegrini et al., 2014 ) En Los datos complementarios de este artículo se pueden encontrar en línea en https: //
particular, Pseudevernia furfur- acea var. furfuracea se erige como un biomonitor de líquenes bastante doi.org/10.1016/j.atmosenv.2019.03.026 .
tolerante, lo que confirma su capacidad para hacer frente a las condiciones ambientales urbanas típicas.
Una deficiencia fisiológica, principalmente destacada en términos de un aumento significativo en los Referencias
niveles de MDA, fue causada por cargas masivas de HAP (y posiblemente por SO 2) durante la exposición
de campo en chimeneas de leña en el sitio RU. Sin embargo, P. furfuracea no experimentó efectos Abdel-Shafy, HI, Mansour, MS, 2016. Una revisión sobre hidrocarburos aromáticos policíclicos:
fuente, impacto ambiental, efecto sobre la salud humana y remediación. Egipto. J. gasolina. 25, 107-123 .
perjudiciales importantes debido a la O 3 tratamiento. En particular, las muestras que experimentaron
condiciones de campo más estresantes, exhibieron una recuperación de las poblaciones de algas o,
Adamo, P., Crisafulli, P., Giordano, S., Minganti, V., Modenesi, P., Monaci, F., Pittao, E.,
como máximo, no hubo variaciones significativas de otros marcadores. Este resultado contraviene Tretiach, M., Bargagli, R., 2007. Bolsas de liquen y musgo como dispositivos de monitoreo en áreas urbanas. Parte II:

nuestra hipótesis original y destaca que las especies de prueba pueden clasificarse como totalmente contenido de oligoelementos en biomonitores vivos y muertos y comparación con materiales sintéticos. Reinar. Pollut
146, 392–399 .
tolerantes al ozono.
Adamo, P., Bargagli, R., Giordano, S., Modenesi, P., Monaci, F., Pittao, E., Spagnuolo, V.,
Tretiach, M., 2008. Natural y pretratamientos indujeron variabilidad en la composición química y la morfología de
los líquenes y musgos seleccionados para el monitoreo activo de elementos en el aire. Reinar. Pollut 152, 11-19 .

Además, limitado a las muestras expuestas a altas cargas de PAH, el patrón fisiológico peculiar
y de PAH que afecta a las muestras fumigadas sugirió que una disminución significativa de los PAH
en las muestras ozonizadas era posiblemente atribuible a la degradación oxidativa que se produce a
nivel del sistema talo, que consiste específicamente en la degradación de la los HAP de 4 anillos más
abundantes acumulados durante la exposición al campo. Aunque se necesita más investigación para
aclarar el problema, la posibilidad de una subestimación de los niveles de enriquecimiento de HAP
debe considerarse seriamente cuando se realizan encuestas basadas en trasplantes con O
contextualmente alto. 3 niveles del suelo
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☒ Los autores declaran que no tienen intereses financieros competitivos conocidos o relaciones
personales que podrían haber influido en el trabajo reportado en este documento.
☐ Los autores declaran los siguientes intereses financieros / relaciones personales que pueden
considerarse como posibles intereses en competencia.
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