“AÑO DE LA LUCHA CONTRA LA CORRUPCIÓN E IMPUNIDAD"

UNIVERSIDAD NACIONAL DE BARRANCA

FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD

Escuela Profesional de Obstetricia

TRABAJO:
MECANISMOS DE INFECCIÓN VIRAL Y DISEMINACIÓN DE LOS VIRUS Y
DIAGNOSTICO

Ciclo: V
Autores:
Rodríguez ardían Camila
Santiago Zorrilla Sonia Betty
Ramírez culla Karina
Pumarrumi Marcelo milagros
Ramírez Juárez Valeri

Docente:

Blga. Ms. C. Ana Contreras Contreras

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INDICE

I. MECANISMOS DE INFECCIÓN VIRAL Y DISEMINACIÓN DE LOS VIRUS 3

1. VÍAS DE INGRESO DE LOS VIRUS 3

2. INGRESO POR VÍA RESPIRATORIA 3
3. INGRESO POR VÍA DIGESTIVA 4
4. INGRESO A TRAVÉS DE LA PIEL 4
5. OTRAS VÍAS DE INGRESO 5
6. ESPECIFICIDAD DE HOSPEDADOR Y TROPISMO TISULAR 5

II. MECANISMOS DE DISEMINACIÓN VIRAL E INFECCIÓN DE

ÓRGANOS BLANCO 6

1. DISEMINACIÓN LOCAL EN SUPERFICIES EPITELIALES 6

2. INVASIÓN SUBEPITELIAL Y DISEMINACIÓN LINFÁTICA 6
3. DISEMINACIÓN POR VÍA SANGUÍNEA: VIREMIA 7
4. INTERACCIÓN DE LOS VIRUS CON LOS MACRÓFAGOS 7
5. INTERACCIÓN DE LOS VIRUS CON
CÉLULAS DEL ENDOTELIO VASCULAR 8
6. DISEMINACIÓN POR VÍA NERVIOSA 8

III. MECANISMOS DE DISEMINACIÓN VIRAL 8

IV. DIAGNOSTICO VIRAL 9

1. TÉCNICAS PARA LA DETECCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS 10

2. TÉCNICAS INMUNOLÓGICAS PARA LA DETECCIÓN DE ANTÍGENOS
VIRALES 10
3. TÉCNICAS INMUNOLÓGICAS PARA LA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS
VIRALES 11

V. RECOLECCION, TRANSPORTE YPROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS 12

VI. METODOS DIRECTOS 13

1. AISLAMIENTO VIRAL - CULTIVOS CELULARES 13
2. DETECCIÓN DE ANTÍGENOS - TÉCNICAS INMUNOLÓGICAS 14

VII. METODOS INDIRECTOS 16

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 CONTENIDO DEL TEMA
I. MECANISMOS DE INFECCIÓN VIRAL Y DISEMINACIÓN DE LOS VIRUS

Los virus deben ingresar en el cuerpo del hospedador para poder ejercer sus efectos
patogénicos; la entrada de los virus al hospedador puede darse a través de una variedad de
vías de ingreso, dependiendo de las propiedades particulares del virus.

1. VÍAS DE INGRESO DE LOS VIRUS

Los virus son parásitos intracelulares obligados que se transmiten como partículas inertes.
Para poder infectar a sus hospedadores el virus debe unirse e infectar células en alguna de
las superficies corporales.

La piel que cubre externamente el cuerpo de los animales tiene una capa externa de
queratina relativamente impermeable, mientras que la mucosa epitelial que cubre el tracto
respiratorio y gran parte del tracto gastrointestinal y urogenital carece de esta capa
protectora.

2. INGRESO POR VÍA RESPIRATORIA

El tracto respiratorio, desde la cavidad nasal hasta las vías aéreas distales en los pulmones,
está protegido por la membrana mucociliar, que consiste de una capa de mucus producida
por las células caliciformes, mantenida en un flujo continuo por el movimiento coordinado de
las cilias en la superficie luminal del epitelio respiratorio. Los espacios aéreos (alvéolos)
están protegidos por los macrófagos alveolares.

La distancia a la que pueden penetrar las partículas inhaladas en el tracto respiratorio es

inversamente proporcional a su tamaño; las partículas mayores de 10 µm son atrapadas por
la capa mucociliar en la cavidad nasal y vías aéreas, mientras que las menores de 5 µm
pueden ser inhaladas directamente hasta los espacios aéreos distales, donde son ingeridas
por macrófagos alveolares.

El sistema respiratorio también está protegido por los mecanismos de la respuesta inmune
innata y adaptativa que actúan en todas las superficies mucosas, incluyendo el tejido linfoide
especializado presente en todo el árbol respiratorio. Sin embargo, a pesar de estos
mecanismos de protección, el tracto respiratorio es quizás la vía más común de ingreso de
los virus al organismo.

Los virus pueden infectar al hospedador a través del tracto respiratorio mediante una
primera unión a receptores específicos presentes en las células epiteliales de la mucosa,
evitando de este modo la eliminación por el sistema mucociliar o por las células fagocíticas.

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 3. INGRESO POR VÍA DIGESTIVA

La mucosa que recubre la cavidad oral y el esófago (y el preestómago en los rumiantes) es

relativamente refractaria a la infección viral, con la excepción de la mucosa que recubre las
tonsilas; por lo tanto, las infecciones virales entéricas comienzan principalmente en los
epitelios del estómago y de los intestinos.

El tracto gastrointestinal está protegido por diferentes mecanismos de defensa, entre los que
se incluyen la acides del estómago, la capa de mucus que cubre las mucosas gástrica e
intestinal, la actividad antimicrobiana de las enzimas digestivas, así como de la bilis y
secreciones pancreáticas, y los mecanismos de la inmunidad innata y adaptativa,
especialmente la actividad de los anticuerpos como la inmunoglobulina A, producidos por los
linfocitos B en la mucosa gastrointestinal y tejidos linfoides asociados.

En general, los virus que causan infecciones entéricas, tales como rotavirus (familia
Reoviridae) y enterovirus (familia Picornaviridae), son resistentes a la acidez y a la acción de
las sales biliares. Sin embargo, hay virus sensibles a la acidez y a la bilis que producen
importantes infecciones intestinales; por ejemplo, los coronavirus que producen
gastroenteritis transmisibles son protegidos por el efecto buffer de la leche, durante su
pasaje por el estómago de los animales lactantes. Otros virus entéricos no sólo son
resistentes a la inactivación por las enzimas proteolíticas en el estómago e intestinos, sino
que su capacidad infectante se ve incrementada por la acción de dichas enzimas.

4. INGRESO A TRAVÉS DE LA PIEL

El bajo pH y la presencia de ácidos grasos en la piel aportan una protección adicional, así
como otros componentes de la respuesta inmune innata y adaptativa, incluyendo la
presencia de células dendríticas migratorias (células de Langerhans) en la epidermis.

Lesiones en la piel, como mordeduras, cortes, punciones o abrasiones pueden constituir

una puerta de entrada para una infección viral, la cual puede quedar confinada a la piel –
como son las infecciones por papilomavirus- o bien pueden diseminarse a otras partes del
organismo.

Las heridas profundas pueden introducir virus en la dermis y en el tejido subcutáneo, donde
se encuentra un importante aporte de vasos sanguíneos, linfáticos y nervios que pueden
servir como vías de diseminación viral.

Las picaduras y mordeduras de artrópodos, como mosquitos y garrapatas constituyen una

de las vías más eficientes por la cual los virus son introducidos a través de la piel.

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 5. OTRAS VÍAS DE INGRESO

Varios patógenos virales importantes (algunos herpes virus y papilomavirus) son

diseminados a través del tracto genital. Durante la actividad sexual se pueden producir
pequeños desgarros o laceraciones en la mucosa peneana o en el epitelio vaginal que
facilitan la transmisión venérea de los virus.

La conjuntiva ocular, si bien es menos resistente que la piel a la invasión viral, es

constantemente lavada por el flujo lagrimal y por la acción mecánica de los párpados. De
todos modos, algunos adenovirus y enterovirus pueden lograr ingresar por este sitio, y otros
virus pueden se transmitidos por esta vía en forma experimental.

6. ESPECIFICIDAD DE HOSPEDADOR Y TROPISMO TISULAR

Tropismo es la capacidad de un virus para infectar células selectivamente en un órgano en

particular. El tropismo depende de factores tanto virales como del hospedador. A nivel
celular debe haber una interacción entre las proteínas de unión virales y los receptores
celulares.

Algunos virus requieren de varios receptores y co-receptores celulares, otros utilizan

diferentes receptores sobre diferentes tipos celulares, por ejemplo, la glicoproteína de unión
del virus de la inmunodeficiencia humana puede unirse a varios receptores (incluyendo CD4,
CXCR4, y CCR5), lo cual le permite infectar tanto linfocitos T como macrófagos.

La expresión de los receptores a nivel celular puede variar en forma dinámica; por ejemplo,
se ha demostrado experimentalmente que animales tratados con neuraminidasa tienen una
importante protección contra la infección intranasal con el virus de la influenza.

Los receptores para un virus en particular están generalmente restringidos a ciertos tipos
celulares en determinados órganos, y solamente esas células pueden ser infectadas. Esto
explica en gran parte el tropismo de cada virus por determinado tejido u órgano y la
patogénesis de la enfermedad causada por ese virus.

La presencia de receptores específicos en la superficie de la célula no es el único factor que

determina si puede ocurrir la infección de la misma; hay también factores intracelulares
(potenciadores virales) que ejercen su efecto luego de la unión del virus para que se
desarrolle una infección productiva.

Los potenciadores virales incrementan la unión de la RNA polimerasa DNA dependiente a

los promotores, acelerando el proceso de transcripción.

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El DNA genómico de los papilomavirus contiene este tipo de potenciadores, que se activa
solamente en los queratinocitos, y, de hecho, es solamente en este estrato celular en el que
se produce la replicación viral.

II. MECANISMOS DE DISEMINACIÓN VIRAL E INFECCIÓN DE ÓRGANOS

BLANCO
La replicación viral puede estar restringida a la superficie corporal a través de la cual el virus
ingresa; los virus pueden atravesar la barrera epitelial y ser diseminados por sangre, por vía
linfática o nervios causando una infección generalizada, o infecciones en sitios específicos
como el sistema nervioso central.

1. DISEMINACIÓN LOCAL EN SUPERFICIES EPITELIALES

Los virus replican primero en las células epiteliales en el sitio de entrada y producen una
infección localizada, generalmente acompañada de diseminación viral directamente al
ambiente desde ese sitio.
La diseminación de la infección sobre las superficies epiteliales ocurre por la infección
secuencial de las células vecinas, y dependiendo de cada virus en particular puede o no
haber diseminación a los tejidos subepiteliales adyacentes.
Los virus que ingresan al organismo por el tracto respiratorio o digestivo pueden causar
rápidamente la infección extensiva de la mucosa epitelial, por lo tanto, las enfermedades
asociadas con estas infecciones progresan rápidamente luego de un corto período de
incubación, el daño causado por los rotavirus y coronavirus en la mucosa intestinal, puede
resultar en una enfermedad severa y aún en diarrea mortal, especialmente en neonatos y
animales de corta edad.

2. INVASIÓN SUBEPITELIAL Y DISEMINACIÓN LINFÁTICA

Algunos virus pueden atravesar la barrera epitelial e invadir el tejido subepitelial mediante
estrategias como la migración dentro de células fagocíticas, específicamente células
dendríticas y macrófagos, y la diseminación direccional de las partículas virales desde el
epitelio infectado.
Las células dendríticas migratorias (cómo las células de Langerhans en la piel), circulan
desde las superficies epiteliales hasta los linfonódulos regionales; y la infección de estas
células puede ser el origen de la diseminación inicial de algunos virus como los alfavirus, el
agente de la lengua azul y otros orbivirus.
Los virus pueden diseminarse, mediante de los vasos eferentes, desde los linfonódulos
regionales hacia el torrente sanguíneo, y luego ser distribuidos rápidamente a través del
organismo, ya sea dentro de las células o como viriones libres. Los órganos que actúan
como filtros de la sangre (pulmón, hígado y bazo) son frecuentemente órganos blanco de los
virus que producen infecciones generalizadas.
La inflamación conduce a alteraciones características en el flujo y la permeabilidad de los
vasos sanguíneos locales, así como a la movilización y activación de leucocitos; algunos

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virus aprovechan esta circunstancia para infectar células que intervienen en la respuesta
inflamatoria, lo cual facilita la diseminación local o sistémica de estos virus.

3. DISEMINACIÓN POR VÍA SANGUÍNEA: VIREMIA

La sangre es el vehículo más efectivo para la rápida diseminación del virus dentro del
organismo.

 viremia primaria: El ingreso inicial el virus a la sangre luego de la

infección.

 viremia secundaria: La replicación viral en los grandes órganos blanco

lleva a una producción sostenida de altas concentraciones de virus.
En la sangre, los viriones pueden circular libres en el plasma o bien contenidos o adsorbidos
a leucocitos, plaquetas y eritrocitos.
Los parvovirus, enterovirus, togavirus y flavivirus circulan generalmente libres en el plasma.
Los virus que son transportados en leucocitos (generalmente linfocitos o monocitos)
normalmente no son eliminados con tanta facilidad o de la misma manera que los virus que
circulan libres.
Los virus asociados a células pueden estar protegidos de los anticuerpos y otros
componentes plasmáticos, y pueden ser transportados cuando los leucocitos que los
mantienen ocultos en su interior migran dentro de los tejidos.
Los viriones circulantes en sangre son removidos continuamente por los macrófagos, por lo
tanto, la viremia puede ser mantenida solamente si hay una continua introducción de virus
en sangre desde los tejidos infectados, o si hay una eliminación deficiente por acción de los
macrófagos tisulares

4. INTERACCIÓN DE LOS VIRUS CON LOS MACRÓFAGOS

Los macrófagos son células fagocíticas mononucleares derivadas de la médula ósea que
están presentes en todos los compartimentos del organismo, incluyendo aquellos que se
encuentran libres en plasma (monocitos) o en los espacios aéreos pulmonares (macrófagos
alveolares), y los que se encuentran en los tejidos como el conectivo subepitelial debajo de
las superficies mucosas, macrófagos fijos como los osteoclastos (en hueso), microglía
(sistema nervioso central), y aquellos que cubren los sinusoides de linfonódulos, hígado,
bazo y médula ósea. Junto con las células dendríticas, los macrófagos tienen un rol crítico
en el procesamiento y presentación de antígenos a otras células inmunológicas.
Los macrófagos también inician la respuesta inmune innata por su capacidad para detectar
la presencia de estructuras moleculares asociadas a patógenos mediante receptores
específicos. Los macrófagos tienen una actividad funcional heterogénea
Se pueden observar diferentes tipos de interacciones entre macrófagos y viriones:
 Algunos virus son fagocitados y destruidos por los macrófagos,

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  Otros casos el virión puede ingresar al macrófago y luego ser transferido
pasivamente a las células adyacentes
 En el caso del virus de la hepatitis infecciosa canina (familia Adenoviridae) puede
ingresar a los macrófagos que cubren las sinusoides hepáticas (células de Kupffer),
replicar en ellos y pasar a los hepatocitos, produciendo una hepatitis severa.
 Otro mecanismo de invasión tisular conocido como “caballo de Troya” consiste en el
transporte de los viriones dentro de macrófagos que emigran a través de las paredes
de los vasos sanguíneos.

5. INTERACCIÓN DE LOS VIRUS CON CÉLULAS DEL ENDOTELIO VASCULAR

El endotelio vascular con su membrana basal y sus estrechas uniones celulares constituye
la interfase sangre-tejido y una barrera para partículas como los virus.
La invasión del parénquima por los viriones circulantes depende de la posibilidad de cruzar
esta barrera, generalmente en vénulas y capilares, donde el flujo sanguíneo es más lento y
las paredes vasculares son más delgadas. Los viriones pueden pasar pasivamente entre o a
través de las células endoteliales y la membrana basal de los pequeños vasos, ser
transportados dentro de linfocitos infectados o infectar células endoteliales y “hacer “su
camino a través de esta barrera.
La infección de las células endoteliales es también importante para la patogénesis de las
enfermedades virales caracterizadas por daño vascular que resultan en hemorragias
generalizadas y/o edemas (fiebres hemorrágicas virales). El daño endotelial producido por
virus conduce a la coagulación y trombosis vascular, y en el caso de generalizarse se
produce la coagulación intravascular diseminada.

6. DISEMINACIÓN POR VÍA NERVIOSA

Aunque la infección del sistema nervioso central ocurre luego de la diseminación

hematógena, la invasión por nervios periféricos es también una importante vía de infección,
como en la enfermedad de Borna (familia Bornaviridae) y en diferentes infecciones por
herpesvirus como son la pseudorabia y la encefalitis bovina por herpesvirus.
Los viriones de los herpesvirus viajan al sistema nervioso central a través del citoplasma de
los axones infectando secuencialmente las células de Schwann de la vaina nerviosa.
Los virus de la rabia y de la enfermedad de Borna también migran hacia el sistema nervioso
central por el citoplasma de los axones, pero generalmente no infectan la vaina nerviosa.
Los nervios de los sistemas motor, sensorial y autónomo pueden estar involucrados en la
diseminación neural de estos virus.
Los virus de la rabia y de la pseudorabia pueden cruzar a través de las uniones sinápticas.
Además de migrar centrípetamente desde la superficie corporal a los ganglios sensoriales y
desde ahí al cerebro, los herpesvirus pueden trasladarse en dirección centrífuga desde los
ganglios hacia la piel y mucosas.

III. MECANISMOS DE DISEMINACIÓN VIRAL

La diseminación de viriones infecciosos es crucial para poder mantener las infecciones
dentro de las poblaciones. Para los virus que replican sólo en las superficies epiteliales, la

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salida de viriones infecciosos generalmente se produce desde el mismo sistema orgánico
por donde ingresó el virus.
La diseminación puede darse desde diferentes sitios, y algunos virus pueden diseminarse
por diferentes vías indistintamente. La cantidad de virus diseminado en una secreción es
un aspecto a tener en cuenta en relación a la transmisión.
La diseminación por saliva depende de acciones como el lamido, olfateo, mordidas o
acicalamiento entre los animales.
La piel constituye una importante fuente de virus en enfermedades en las que la transmisión
se produce por contacto directo o por pequeñas lesiones: papilomavirus, algunos poxvirus y
herpesvirus
 Infección viral sin diseminación
Muchos sitios de replicación viral podrían ser considerados como “sitio ciego” desde la
perspectiva de la diseminación natural; sin embargo, la replicación en estos sitios puede
facilitar indirectamente la transmisión viral; por ejemplo, animales carnívoros y omnívoros
pueden infectarse al consumir carne o tejidos que contienen virus.

VIII. DIAGNOSTICO VIRAL

Los métodos para reconocer las infecciones por virus pueden utilizarse para demostrar la
presencia del virus o de antígeno o genoma viral o la respuesta inmune por parte del
hospedador en el curso de la infección.

Métodos de diagnóstico virológico tenemos:

 AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN
Es el método que posibilita la recuperación del virus viable a partir de una muestra
problema al ofrecerle un sustrato adecuado para su replicación como:
 Cultivos celulares:
 Cultivos primarios: se obtiene a partir de las células, tejidos u órganos
tomados directamente del organismo y pueden subcultivarse una o
dos veces.
 Líneas celulares diploides: pueden subcultivarse aproximadamente 50
veces y que conservan por lo menos en un 75% el cariotipo.
 Líneas celulares continuas: permiten en un número infinito de
subcultivos y son heteroploides.
 Huevos embrionados: usualmente utilizados para cultivar virus propios de las
aves como el Virus de la Influenza Aviar.
 Animales de laboratorio: prácticamente no se usan más por razones de
bienestar animal.

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  Microscopia electrónica: permite la visualización de las estructuras
virales y la morfología y tamaño del virión, lo que ayuda a la identificación
de la taxonomía viral.

1. TÉCNICAS PARA LA DETECCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS:

 Reacción en la cadena polimerasa – PCR

Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad se basa en que al
amplificarlo resulta mucho más fácil identificar el genoma viral. Los ingredientes
clave para una reacción de PCR son la Taq polimerasa, cebadores, ADN molde y
nucleótidos. Los ingredientes se colocan en un tubo, junto con los cofactores que
necesite la enzima, y se someten a ciclos repetidos de calentamiento y enfriamiento
que permiten la síntesis del ADN. Los resultados de una reacción de PCR se
visualizan al usar electroforesis en gel de agarosa. La electroforesis en gel es una
técnica en la que una corriente eléctrica impulsa fragmentos de ADN a través de una
matriz de gel y los fragmentos de ADN se separan según su tamaño. Donde se
incluye un estándar, o marcador de peso molecular, para que pueda determinarse el
tamaño de los fragmentos en la muestra de PCR.

 Southern Blot, Northen Blot y Western Blot

Las técnicas Southern blot y Northern blot se utilizan para separar y caracterizar
ADN y ARN, respectivamente. La técnica de Southern fue desarrollada por Edwin
Southern para separar ADN y por analogía la separación de ARN se denominó
Northern y la transferencia de proteínas que se denominó Western blot. Estas
técnicas comienzan con una electroforesis en gel con el objetivo de separar las
moléculas por su tamaño, posteriormente la transferencia a una membrana para
finalmente identificar un fragmento específico de ADN, una molécula de ARN
particular o una proteína de interés mediante la unión específica de otra molécula de
ácido nucleico (sonda) para ADN o ARN o anticuerpo para proteínas.

2. TÉCNICAS INMUNOLÓGICAS PARA LA DETECCIÓN DE ANTÍGENOS VIRALES

 Inmunofluorescencia directa

La muestra que presuntamente contiene antígenos virales es puesta en contacto con

un anticuerpo conjugado con fluoresceína dirigido contra dicho antígeno. Si el
antígeno esperado está presente se formará un complejo antígeno-anticuerpo. Luego
de los lavados, solo quedarán presentes estos complejos y la reacción positiva

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 emitirá fluorescencia que puede verse con la ayuda de un microscopio de
fluorescencia.

 ELISA

Se realiza en placas de 96 pocillos. Uno de los componentes (antígeno o anticuerpo)

se adsorbe sobre un soporte (inmunoadsorbente) y se agregan antígenos o
anticuerpos marcados con una enzima. La reacción antígeno-anticuerpo quedará
inmovilizada y, será fácilmente revelada mediante la adición de un sustrato
específico. Al actuar la enzima sobre el sustrato producirá un color, observable a
simple vista (cualitativo) o cuantificable mediante el uso de un espectrofotómetro,
expresándose como densidad óptica (cuantitativo). En cada placa se colocan
controles positivos y negativos de absorbancia conocida.
Los más utilizados para la detección de Antígeno son:
Elisa directo y Elisa sandwich o de captura.

 Inmunohistoquímica e inmunocitoquímica

La inmunohistoquímica permite evidenciar la presencia de un Ag específico sobre un

corte de tejido determinado y ubicar en qué estructuras del mismo se encuentra.
Para la detección de antígenos, el único Ac a utilizar se encuentra conjugado con la
enzima reconociéndose la unión del mismo con el antígeno tras el agregado del
sustrato cromógeno.
La inmunocitoquímica permite evidenciar la presencia de un Ag específico sobre
células mediante un procedimiento similar.

3. Técnicas inmunológicas para la detección de anticuerpos virales

Técnicas utilizadas de rutina en el gel de agar son:

 Seroneutralizacion
Es la detección de anticuerpos neutralizantes en el suero problema. Se colocan los
sueros, diluidos en medio de cultivo con el virus a neutralizar, en placas previamente
sembradas con células. Luego se incuban las diluciones seriadas en una estufa a
37°C y se determina si hay o no presencia de ECP en un microscopio invertido. Al
realizar diluciones del suero es posible determinar la concentración o título de
anticuerpos neutralizantes presentes en la muestra. El título de anticuerpos se
determina como la dilución más alta que presenta inhibición completa del ECP
después de 72 horas de incubación.

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  Inmunodifusión en el gel de agar (IDGA)
Empleando el medio adecuado (gel de agar), es posible hacer migrar por difusión
tanto Ag como Ac, Es la prueba oficial de SENASA para la Anemia Infecciosa
Equina (Test de Coggins). [ CITATION Ign17 \l 10250 ]

IX. RECOLECCION, TRANSPORTE YPROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS

Un elemento crucial para realizar el diagnóstico de laboratorio de un virus, cualquiera sea el
método empleado, es la toma y el procesamiento de una muestra clínica adecuada. Las
mejores muestras por lo general son las que se obtienen en un estadio temprano de la
enfermedad (dentro de las primeras 72hs), cuando el virus se excreta en concentraciones
relativamente elevadas y todavía no se ha unido con anticuerpos.

Las muestras deben obtenerse de forma aséptica si se va a intentar el aislamiento del virus.
El volumen de la muestra debe ser suficiente como para permitir la realización de los
ensayos apropiados y la conservación, por ejemplo: en caso de tener que repetir el ensayo
en pruebas adicionales, como PCR.

Las muestras pueden obtenerse a partir de:

 Hisopados:
Conjuntivales
Genitales
Rectales
Mucosa oral
Lesiones cutáneas
 Sangre
 Aspirado nasofaríngeo
 Lavado bronquioalveolar
 Expectoración
 Orina
 Líquido cefalorraquídeo
 Materia fecal
 Biopsias
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Dado la gran labilidad de los virus, estos deben ser transportados en un medio de transporte
que les provea estabilidad. Esto se obtiene agregando proteínas como puede ser la
albúmina de bovino o la gelatina.

X. METODOS DIRECTOS

3. AISLAMIENTO VIRAL - CULTIVOS CELULARES

Es la detección del virus o de sus componentes. El aislamiento del virus era la técnica
standard de oro sobre la cual se medían todas las otras pruebas de diagnóstico viral (ya no
es la más sensible), el aislamiento de virus tiene una sensibilidad y una especificidad muy
alta. Debido a que sólo se amplifica el virus, se aumenta la sensibilidad sin disminuir la
especificidad
Los cultivos celulares se dividen en:
Cultivos Primarios: Se obtienen a partir de células, tejidos u órganos tomados directamente
del organismo y pueden subcultivarse una o dos veces.
Líneas Celulares Diploides: Son aquellas que crecen en pasajes sucesivos hasta
aproximadamente 50 subcultivos y que conservan por lo menos en un 75% el cariotipo
correspondiente a la especie de que provienen.
Líneas Celulares Continuas: Permite un número finito de subcultivos y son heteroploides.
Para considerar que se ha logrado establecer una línea continua, esta debe de haber sido
subcultivada por lo menos 70 veces.
Hemadsorción: la célula huésped elementos estructurales virales llamados he aglutininas,
glicoproteínas capaces de unirse a receptores específicos en la membrana de glóbulos rojos
de diferentes especies animales.
Hemaglutinación: se utilizando el mismo fundamento que para la hemadsorción.

2. DETECCIÓN DE ANTÍGENOS - TÉCNICAS INMUNOLÓGICAS

Para la detección de antígenos (métodos directos), como de anticuerpos (métodos

indirectos).
En el caso de detección de antígenos, se utiliza un anticuerpo específico antiviral (por lo
general IgG) a cuya fracción Fc se ha conjugado una molécula marcada, que puede ser
isotiocianato de fluoresceína (Inmunofluorecencia)
2.1. INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA (ID)
Muestras clínicas apropiadas son recolectadas y colocadas sobre portaobjetos donde se
dejan secar y fijar. Luego se agregan anticuerpos especificos marcados con isotiocianato de
fluoresceína que difunden a través de la membrana celular y se combinan con los antígenos
víricos en el interior de las células. La reacción antígeno anticuerpo se visualiza con el
microscopio de fluorescencia, por la aparición de fluorescencia de color verde manzana.
2.2. TEST DE AGLUTINACION

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es un método simple, de un solo paso, que a veces se usa para la detección de antígenos
virales en muestras clínica. Los ensayos de aglutinación, dependen de la fijación inicial de
anticuerpos antivirales específicos sobre eritrocitos o partículas de látex, es una técnica
rápida y barata. También se la ha usado para detectar antígenos de Adenovirus.
2.3. RADIOINMUNOENSAYO (RIA)
para identificar el antígeno de superficie de la Hepatitis B (HBsAg) y el anticuerpo anti-
HBsAg. Estos ensayos tienen una buena sensibilidad y especificidad,
2.4. ENZIMOINMUNOANALISIS (EIA)
Para la detección de antígeno se basan habitualmente en la captura del antígeno por
anticuerpos específicos unidos a una fase sólida

XI. TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR INVESTIGACIÓN DE ÁCIDOS

NUCLEICOS VIRALES

Los anticuerpos contra el virus se fijan a las paredes de la placa de microtubulacion, a la

muestra se da sospecha de partículas virales y se adiciona anticuerpos antivirales y se mide
la cantidad del producto de color
Estudios de la Biología Molecular
1. Sondas de acidos nucleicos
Se extraen de secuencias específicas de ADN, estas secuencias se pueden desnaturalizar y
marcar con enzimas o isotopo radioactivo
2. Determinacion de acidos nucleicos virales por sonda sintetica
Es un ensayo de hibridación molecular con una sonda marcada. las hibridaciones pueden
ser: ADN-ADN, ARN-ARN, ADN-ARN
3. Amplificacion de acidos nucleicos virales mediante una reaccion en cadena de
la polimerasa (pcr)
Fue desarrollada por saiki, es para amplificar las secuencias específicas de ADN que se
basa en secuencias cortas de nucleótidos
4. Determinacion de acidos nucleicos virales por sonda sintetica
Es un ensayo de hibridación molecular con una sonda marcada. Las hibridaciones pueden
ser: DNA-DNA, RNA-RNA y RNA-DNA.
5. Amplificacion de acidos nucleicos virales mediante una reaccion en cadena de
la polimerasa (pcr)
Para incrementar el número de moléculas de DNA blanco en las muestras.

XII. MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA

Es posible observar la morfología de los viriones presentes en muestras clínicas, necesita

una alta concentración de viriones presentes en la muestra (poco sensible)
Rotavirus poseen características en doble rueda y un tamaño distintivo

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Mediante el microscopio electrónico es posible observar la morfología de los viriones
presentes en muestras clínicas.

XIII. . METODOS INDIRECTOS

Son aquellos que reconocen la respuesta inmune (humoral o celular) por parte del
huésped:
. Detección de anticuerpos específicos antivirales
Por técnicas inmunológicas (EIA, IFI, WB,etc.).
. Producción de anticuerpos in vitro.
INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI)
La IFI, es un método rápido y confiable para la determinación de anticuerpos
antivirales en el suero delpaciente. Se basa en la unión de anticuerpos antivirales
presentes
en el suero del paciente a los antígenos virales expresados en la superficie y
citoplasma de células infectadas, que han sido fijadas a un portaobjeto devidrio.
Como control de especificidad se usan células no infectadas.
Los antígenos virales se inmovilizan sobre una fase sólida (esferita, policubetas
para microtitulación u otros elementos de plástico) y se agregan los sueros en
estudio; se incuban, se lavan y se revela la reacción Ag-Ac por el agregado de una
inmunoglobulina antiespecie conjugada con una enzima, seguida por el substrato
apropiado para esta. Los resultados se pueden leer con un espectrofotómetro y en
algunos casos de forma visual.
TEST DE AGLUTINACION
El fundamento y el procedimiento de esta técnica ya fue descripto para el estudio de
Ag viral (método directo).Ahora lo que buscamos es detectar anticuerpos
antivirales, por eso se usan partículas de látex recubiertas
con Ag viral.
WESTERN BLOT (WB)
Las técnicas inmunológicas de Inmunoblot están encontrando amplias aplicaciones
en el diagnósticovirológico. Son particularmente útiles para el diagnóstico
del HIV.La técnica de WB se basa en la separación electroforética de proteínas
virales que sonposteriormente inmovilizadas en papel de nitrocelulosa con el objeto
de determinar la presencia de anticuerpos específicos contra cada una de esas
proteínas.

PRODUCCION DE ANTICUERPOS IN VITRO

Se trata de una técnica nueva que ha sido aplicada para el diagnóstico de la infección
perinatal. Este procedimiento revela la presencia de anticuerpos antivirales producidos

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in vitro a partir de los linfocitos B extraídos de sangre total, lo que indicaría que el sistema
inmune del paciente ha sido estimulado por el virus.

La producción de Ac antivirales in vitro promete ser de gran valor en el diagnóstico temprano

de niños infectados por VIH.

GLOSARIO

 células caliciformes: son células glandulares, o glándulas unicelulares secretoras

de mucus, presentes en los revestimientos epiteliales de las mucosas de las vías
respiratorias y el aparato digestivo.
 Cilios : Son unas estructuras celulares que se caracterizan por presentarse
como apéndices con aspecto de pelo que contienen una estructura central altamente
ordenada, constituida generalmente por más de 600 tipos de proteínas, envuelta por
el citosol y la membrana plasmática. 
 Macrófagos alveolares: El macrófago, una célula de estirpe monocítica, es la célula
con actividad fagocítica más importante del árbol respiratorio, siendo además la más
abundante de todas las células inflamatorias tanto en los alveolos como en las vías
aéreas de conducción.
 Tonsila: Es un tejido linfoide asociado a mucosa. Está conformada por masas
asociadas de tejido linfoide en el paladar, faringe y parte de la lengua.
 Rotavirus: Es un virus que causa gastroenteritis. 
 Enterovirus: Es un género de virus de ARNmc de sentido positivo asociado con
diversas enfermedades en humanos y otros mamíferos. En estudios serológicos se
han identificado 66 serotipos de enterovirus humanos, según los resultados de los
test de neutralización de anticuerpos.
 Tropismo : Es un fenómeno biológico que indica el crecimiento o cambio direccional
de un organismo, normalmente una planta, como respuesta a
un estímulo medioambiental. 

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BIBLIOGRAFÍA
 Ralli, I.(2017). Obtenido de
https://drive.google.com/file/d/1RyMNtoZO3vPUMSA1D2YqLv1HGlVQ6dfM/vi
ew

 file:///C:/Users/ssant/Downloads/MECANISMOS%20DE%20INFECCIÓN
%20VIRAL%20Y%20DISEMINACIÓN%20DE%20LOS%20VIRUS.pdf
 file:///C:/Users/ssant/Downloads/Diagnostico%20viral.pdf
 Brock, D. Clínica y Diagnóstico
 Microbiológico. Biología de Microorganismos.
 Prentice Hall, 1988. New Jersey. 13: 488-489.

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