Universidad nacional Jorge Basadre Grohmann

Facultad Ciencias Agropecuarias

Escuela Ingeniería en Industrias Alimentarias

LABORATORIO ANÁLISIS INSTRUMENTAL

PRACTICA N° 03

DETERMINACIÓN DE AZUCARES REDUCTORES POR EL MÉTODO

DE SOMOGYI - NESLSON

DOCENTE: ING LARREA CESPEDES

ALUMNA: JENNY LUZ GOMEZ CURASI
CODIGO: 2011-111082

TACNA- PERU

PRACTICA 3
 DETERMINACION DE PROTEINAS – METODO DE LOWRY

La intensidad de la coloracion varía con la composición de aminoácidos. Es más sensible

que el ensayo de Biuret. El rango es de 0.1 a -1mg/ mL. Presenta muchas interferencias. El
reactivo de Folin (ácido fosfomolibdico-fosfotungstico) es reducido por las proteínas para
formar un complejo azul de molibdeno. Es más sensible que el Biuret, pero más tedioso de
realizar.

Puede detectar cantidades del orden de0.1 mg de proteína; el método se basa en la

reacción de proteínas con el Cu(II) en medio alcalino y también de la reacción de grupos
fenólicos (mayoritariamente tirosina en proteínas) con un reactivo denominado de Folin –
Ciocalteau que contiene fosfomolibdato y fosfowolframato. Las proteínas reaccionas con el
reactivo de Folin – Ciocalteau para dar un complejo coloreado.

El color que se forma se debe a la reacción del cobre con la proteína, La intensidad de
color depende del número de aminoácidos aromáticos presentes en especial la tirosina y el
triptófano. La técnica se basa en la reducción de una mezcla de ácidos que forman el
reactivo cromógeno de Folin – Ciocalteau por la oxidación de los aminoácidos aromáticos
de las proteínas. Se utiliza cobre como catalizador de la reacción ya que el ultimo forma un
quetalo con la estructura peptídica que facilita la transferencia de electrones a la mezcla
cromogenica de ácidos, produciendo una o más especies reducidas las cuales tienen un
característico color azul con una λ Max 745-750 nm. y una λ min a 405 nm. Al producirse
dicha reacción hay un cambio en el color de la muestra que puede ser cuantificado
determinando la absorbancia a 660 nm. Dentro de determinados rangos de concentración
de proteínas existe una relación lineal entre C y Abs660nm.

A concentraciones altas de proteínas la linealidad se pierde y por lo tanto este método no

será adecuado para determinar la C real. El rango adecuado es de entre 5 a 100
microgramos de proteína. Existe una amplia lista de sustancias (como buffers, detergentes,
lípidos, etc.) que interfieren con este ensayo y por lo tanto afectan la determinación de la C
real. La solución a este problema se consigue diluyendo la muestra, y asi la cantidad de
interferente o por precipitación de las proteínas y resuspension en un buffer sin
interferentes. El método de folin Lowry es capaz de medir cantidades de proteínas en
forma más precisa, en microgramos. Por ejemplo en un virus detecta las proteínas con
mucho más exactitud.

Material:
  Tamiz (60 mesh)
 Mortero
 Espectrofotometro
 Agitadores
 Baras magnéticas
 Centrifuga
 Tubos de ensayo
 Pipetas

Reactivos:

 NaCi 0.15 M
 Carbonato de sodio anhidro
 NaOH
 Sulfato de cobre
 Tartrato de sodio y potasio
 Reactivo de Folin
 Albumina de suero bovina

Preparación de las Muestras:

 Tomar 50 gr. de frijol y moles hasta una granulometría < de 60 mesh. Reservar una
porción para determinación de Nitrógeno total.

 Preparar una suspensión de 10% en soluciones de NaCI 0.15 M y agitar por 1 hora

 Determinar el contenido de proteínas por el método de Lowry

 La muestra debe ser preparada a partir del extracto haciendo una dilución de 1/20 y
tomando alícuotas de 0.2 y 0.3 ml.

1. Solución alcalina:
 Carbonato de sodio anhidro 20g
NaOh 4g
Agua destilada 1000 mL

2. Solución de sulfato de cobre:

CuSO4 2g
Agua destilada 100 mL

3. Solución de tartrato de sodio y potasio:

Tartrato de sodio y potasio 4g

Agua destilada 100 mL

4. Mixtura reactiva o Reactivo de Lowry:

Adicionar en ese orden (para no formar pp.). preparar diariamente

Solución numero 2 (CuSO4) 2 mL

Solución numero 3 (tartrato de sodio o potasio 2 mL
Solución alcalina (1) Completar para 100 mL

5. Solución estoque de Folin – Ciocalteau:

 En un balón de 2000 Ml, disolver 100 g de tungstato de sodio y 25 g de molibdato

de sodio (Na2MoO4. 2H2O) adicionar 700 mL de agua destilada
 Adicionar 100 mL de HCI concentrado y 50 mL de H3PO4 (85%)
 Adaptar a un condensador de reflujo y hervir levemente durante 10 horas
 Enfriar
 Adicionar 150 g de LiSO4, 50 mL de agua destilada y algunas gotas de bromo (en
campana extractora)
 Enfriar
 Completar a 1000 mL con agua destilada, el color de este reactivo debe ser
amarillo-dorado. La regeneración puede ser hecha por la adicion de gotas de bromo
y hervor por 15 minutos cuando se presenta verdosa

6. Reactivo de Folin – Ciocalteau diluido:

  Diluir un volumen de reactivo estoque (5) con (2) volúmenes de agua destilada. Es
recomendable titular con NaOH 1N, de tal forma que corresponda a un acido 1N

7. Solucion de NaOh 1N:

 NaOH ……….4 g
 Agua destilada 100 mL

8. Solución padrón de Albumina Bovina

 Pesar 50 mg de suero albumina bovina y 0.1 mL de NaOH 1N

 Disolver con agua destilada y completar para 100 mL (sin mucha agitación)

PROCEDIMIENTO

Mez Folin
Numero Patrón Concent
H2O react Absorb
Tubo SAB (ml) (mg.) (mL) (mL)
(mg.) (660 nm)
1 0.1 0.1 0.9 5.0 0.6
2 0.2 0.2 0.8 5.0 0.6 0.3087
3 0.3 0.3 0.7 5.0 0.6
4 0.4 0.4 0.6 5.0 0.6 0.4737
 5 10 minutos
Esperar 0.5 0.5 0.5 5.0 0.6  
6 0.6 0.6 0.4 5.0 0.6 0.6642
7 0.7 0.7 0.3 5.0 0.6
8 0.8 0.8 0.2 5.0 0.6 0.8038
9 0.9 0.9 0.1 5.0 0.6
10 1.0  1.0 ---- 5.0 0.6 1.0535
Blanco  ------ ----- 1.0  5.0 0.6  

 Esperar 30 minutos y leer la absorbancia a 660 nm.

Calcular la concentración de proteínas a través de:

1. Lectura directa en el grafico

2. Ecuación de la recta
3. Aplicación directa de la ley de Beer, utilizando la inclinación de la recta
4. Promedio de los valores de absortividad obtenida experimentalmente
 5. Discutir y justificar cual es el mejor procedimiento para la determinación

Resultados:

1.2

0.8

0.6

0.4

0.2

0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Grafico1. Curva de calibración (Abs vs C)

Ecuación de la recta:
^y =a+b ^x
Cálculos:

C (mg) A
2 0.3087
4 0.4737
6 0.6642
8 0.8038

Aplicación de regresión lineal:

a = 0.14365
b = 0.08366
r = 0.9981
aplicando la ecuación de la recta
^y =a+b ^x

Teniendo una muestra de absorbancia de 0.4550

^y =0.14365+ 0.08366 ^x

0.4550−0,14365
^x =
0.08366

^x =3.7216
Si: .

 0.3716 mg ------- 0.2 ml

X -------- 86 ml (ml centrifugados)

X= 159.788 mg.

 Convertimos 159.788 mg a gr: 159.788 mg/1000mg = 0.159788 gr.

 Si 0.159788 gr hubo en 10 gr de muestra (harina).

¿Cuánto habrá en total (100%)?

0.159788 gr ----------- 10 gr M
X ------------- 100 %

X = 1.5978 %

 1.5979 % x 1000 = 15.978 g/Kg proteína.

V. CONCLUSIONES

 Se determinó el porcentaje de proteínas por el método de Lowry.

  Para determinar las proteínas de la muestra por el método de Lowry se utilizara el
reactivo de Folin, su presencia dio como resultado una coloración azul. (azul de
molibdeno).

 Las proteínas reaccionan con el reactivo de Folin y el color que se forma se debe a
la reacción del cobre con la proteína y la intensidad del color va depender de la
cantidad de aminoácidos aromáticos presentes.

 El método más conveniente para realizar esta práctica seria el Metodo de Lowry
pero es muy complicada por las preparaciones de soluciones, es recomendable el
Metodo de Biuret que es mas rápida y no tediosa.

VI. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS:

1. Trudy Mc Kee, James R (2003), Bioquímica la base molecular de la vida. 3era edición.
2. Wikipedia/ Metodo Lowry
3. Wikipedia/ Solucion Folin-Ciocalteau