CUARTO PERIODO (Evaluación de pruebas fisiológicas)

Acabada la incubación de los medios inoculados (24 horas), se examinan las placas y los tubos
y se agrega reactivos de prueba a algunos de los cultivos. Algunas de las pruebas deberán
revisarse a las 48 y 72 horas. Después de ensamblar todas las placas y tubos del último
período, examine primero las placas de agar sangre que se rayaron doblemente con las
incógnitas y S. aureus. Tome en cuenta que las pruebas segunda, tercera y cuarta pueden
leerse en estas placas. Se procede de la siguiente forma:

 Reacción CAMP
Si se tiene un microorganismo desconocido que produce una zona hemolítica en forma de
punta de flecha agrandada en la coyuntura donde este se encuentra con S. aureus, el
microorganismo es S. agalactiae, esto se debe al factor CAMP. El único problema que
puede surgir con la prueba es que si la placa se incuba anaeróbicamente se puede producir
una reacción CAMP positiva en las placas inoculadas con S. pyogenes. Registrar las
reacciones CAMP para cada uno de sus aislados o incógnitas en el Informe de laboratorio.
 Susceptibilidad a la bacitracina
Cualquier zona de inhibición observada alrededor de los discos de bacitracina debe
considerarse un resultado positivo de la prueba, existen dos limitaciones:
1. Los discos deben ser del tipo diferencial, no del tipo de sensibilidad
2. La prueba no debe aplicarse a estreptococos hemolíticos alfa.
Motivos: Los discos de sensibilidad tienen una concentración demasiado alta del
antibiótico, y muchos estreptococos alfa hemolíticos son sensibles a estos discos.
Registrar los resultados de esta prueba
 Prueba de sensibilidad SXT
Los discos usados en esta prueba tienen 1,25 mg de trimetoprima y 27,75 mg de
sulfametoxazol (SXT), su propósito es distinguir los grupos A y B de otros estreptococos
beta hemolíticos. Si un estreptococo beta hemolítico es resistente a bacitracina y
susceptible a SXT, se clasifica como estreptococo beta hemolítico no del grupo A o B, lo
que significa que el organismo es probablemente una especie del grupo C. Una cepa de
estreptococos del grupo A ocasionalmente es susceptible a los discos de bacitracina y SXT,
recordar que ocurren excepciones a la mayoría de las pruebas por lo que este
procedimiento de identificación lleva a conclusiones presuntivas. Registrar cualquier zona
de inhibición (resistencia) como positiva para esta prueba.
 Hidrólisis Hipurada
La hidrólisis del hipurato y la prueba CAMP son pruebas positivas para S. agalactiae. Si un
organismo es positivo para ambas pruebas o para cualquiera de las dos, se puede suponer
con casi al 100% que el organismo es S. agalactiae. Proceder de la siguiente manera para
determinar cuáles de sus aislados son capaces de hidrolizar el hipurato de sodio:
Materiales:

o tubos de ensayo serológicos o reactivo de cloruro férrico

o pipetas serológicas de 1 ml o centrífuga

Procedimiento
1. Centrifugue el cultivo de 3 a 5 minutos.
2. Pipetee 0.2 ml del sobrenadante y 0.8 ml de reactivo de cloruro férrico en un tubo de
ensayo serológico vacío. Mezclar bien.
 3. Observe que un precipitado pesado se formará, si el precipitado formado persiste
durante 10 minutos o más, la prueba es positiva. Si el cultivo es débilmente positivo,
incubarlo durante otras 24 horas y repita la prueba.
4. Registre sus resultados
 Hidrólisis de esculina biliar
Es la mejor prueba fisiológica para la identificación de estreptococos del grupo D,
enterococos y no enterococos del grupo D pueden hidrolizar la esculina en agar BE
inclinado haciendo que se ennegrezca esto significa que la prueba es positiva y confirma la
presencia de un estreptococo del grupo D; para diferenciar los dos tipos de estreptococos
del grupo D se usa de la prueba de tolerancia a la sal (es determinante). Examinar los tubos
de agar BE inclinado y ver si hay ennegrecimiento en el agar. Si menos de la mitad de la
inclinación está ennegrecida o si no se produce ennegrecimiento dentro de 24 a 48 horas,
la prueba es negativa.
 Tolerancia a la sal (6.5% NaCl)
Todos los enterococos del grupo D producen un fuerte crecimiento en caldo de NaCl al
6.5% pero ninguno de los no enterococos de este grupo crece en este medio, por lo que es
un buen método para diferenciar los dos tipos de estreptococos del grupo D. El resultado
positivo aparece como turbidez en 72 horas, pudiendo estar presente un cambio de color
de púrpura a amarillo. Si el tubo es negativo a las 24 horas, incubar y verificar de nuevo a
las 48 y 72 horas. Si el organismo es tolerante a la sal y es BE-positivo, se considera como
enterococo. Recuerde que en este medio el 80% aprox. de estreptococos del grupo B
crecen.
 Susceptibilidad a la optoquina
La susceptibilidad a la optoquina se usa para diferenciar a los estreptococos alfa
hemolíticos viridanos de los neumococos, estos últimos son sensibles a estos discos
mientras que los viridanos son resistentes.
Materiales:
o Placas de agar sangre con discos de optoquina
o Regla de plástico
Procedimiento
1. Mida los diámetros de las zonas de inhibición que rodean cada disco, observe si son lo
suficientemente grandes como para considerarse positivas. Para considerarse positiva
la prueba los estándares son los siguientes:
o Para discos de 6 mm de diámetro, la zona debe tener al menos 14 mm de
diámetro.
o Para discos de 10 mm de diámetro, la zona debe tener al menos 16 mm de
diámetro.
2. Registre sus resultados en el Informe de laboratorio.
 Solubilidad Biliar
Si un estreptococo alfa hemolítico es soluble en bilis y positivo en la prueba de optoquina,
se presume que es S. pneumoniae. Realizar la prueba de solubilidad biliar en cada uno de
los aislados alfa hemolíticos de la siguiente manera:
Materiales:

o 2 tubos serológicos vacíos (por o cultivo en TBS desconocido

ensayo) o Solución de bilis al 2%
o rojo fenol (indicador) (desoxicolato de sodio)
o solución de NaOH 0.05N o solución salina normal
 o 2 pipetas serológicas (de 1 ml) o baño maría (37 ° C)

Procedimiento
1. Marque un tubo serológico vacío como BILIS y el otro como SALINO. En los tubos
respectivos pipetee 0.5 ml de bilis al 2% y 0.5 ml de solución salina.
2. Agite el cultivo desconocido de TSB para suspender los organismos y pipetee 0.5 ml del
cultivo en cada tubo.
3. Agregue una o dos gotas de indicador rojo fenol a cada tubo y ajuste el pH a 7.0
agregando gotas de NaOH 0.05N.
4. Coloque ambos tubos en un baño de agua a 37 ° C y examine periódicamente durante
2 horas. Si la turbidez desaparece en el tubo biliar, indica que las células se han
desintegrado y que el organismo es S. pneumoniae. Compare los tubos uno al lado del
otro.
5. Registre sus resultados.

CONFIRMACIÓN FINAL

Todos los procedimientos de laboratorio realizados hasta este momento llevan a una
identificación por lo que para confirmar estas conclusiones se necesita realizar pruebas
serológicas en cada una de las incógnitas, si hay kits comerciales disponibles para tales pruebas
se los debe usar para completar los procedimientos de identificación.