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UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CENTRO

DEL PERU

FACULTAD DE INGENIERÍA EN INDUSTRIAS


ALIMENTARIAS

DIRECCIÓN DE DEPARTAMENTO ACADÉMICO

ASIGNATURA : BIOQUÍMICA GENERAL


CÓDIGO : E053E

DOCENTE

Dr. EMILIO FREDY YÁBAR VILLANUEVA


TEMA

PRINCIPIOS DE CINÉTICA ENZIMÁTICA

HUANCAYO-2020
OBJETIVOS

1. Analizar los mecanismos y factores de una reacción


enzimática
2. Explicar la ecuación de Michaelis y Menten.y su aplicación
en la cinética enzimática
3. Explicar la forma de cálculo de los parámetros cinéticos de
una reacción enzimática con y sin inhibidores

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INTRODUCCIÓN

La cinética enzimática, estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por


enzimas, la cual depende de la concentración de moléculas de sustrato [S],
temperatura, presencia de inhibidores y pH del medio que afecta a la
conformación estructural espacial de la molécula enzimática.
La función principal de una enzima es disminuir la energía de activación necesaria
para que ocurra una reacción química. La energía de activación es la cantidad de
energía necesaria para inducir en una sustancia un estado de reactividad. El
enzima se combina con la sustancia (S) induciéndole una situación transitoria que
requiere una menor energía de activación, para que tenga lugar la reacción.
En 1913, Leonor Michaelis y Maud Menten desarrollaron y propusieron una
ecuación de velocidad que explica el comportamiento cinético de los enzimas.
Para explicar la relación observada entre la velocidad inicial (V 0) y la concentración
inicial de sustrato ([S]0), Michaelis y Menten propusieron que las reacciones
catalizadas enzimáticamente ocurren en dos etapas: En la primera etapa se forma
el complejo enzima-sustrato y en la segunda, el complejo enzima-sustrato da lugar
a la formación del producto, liberando el enzima libre. Sobre la base de esta
ecuación se propusieron varias ecuaciones y para condiciones que incluyen
inhibidores.

1. Mecanismos de una reacción enzimática

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La unión entre un enzima y su sustrato para formar el complejo enzima-sustrato se
ve favorecida por la formación de una serie de interacciones débiles (puentes de
hidrógeno, interacciones iónicas, etc.) entre grupos funcionales complementarios
de ambas moléculas. La formación de cada una de estas interacciones débiles va
acompañada por la liberación de una pequeña cantidad de energía libre que
contribuye a estabilizar el complejo. La suma de todas estas pequeñas cantidades
de energía liberadas por la totalidad de las interacciones débiles formadas
representa la energía de fijación. El papel que juega esta energía en la catálisis
enzimática es de importancia extraordinaria: la energía de fijación no se limita a
producir una estabilización del complejo enzima-sustrato, sino que constituye la
principal fuente de energía libre que los enzimas utilizan para rebajar la barrera de
energía de activación y con ello aumentar la velocidad de la reacción catalizada. El
enzima puede fijar a los sustratos de manera que queden muy próximas entre sí
sobre el centro activo y a su vez próximos a eventuales grupos catalíticos del
propio enzima. El enzima fija a las moléculas reaccionantes de manera que
quedan no sólo próximas entre sí, sino orientadas en la relación geométrica más
favorable para que la reacción tenga lugar, es decir, con sus grupos funcionales
reaccionantes enfrentados.
El modelo, llave-cerradura, ha permitido explicar muchos procesos bioquímicos.
Los enzimas no son exactamente complementarios con sus sustratos sino más
bien con las especies del estado de transición, es decir, las interacciones débiles
que se forman entre el enzima y su sustrato son óptimas en el estado de
transición. Objetivamente ocurre la distorsión estructural (forma de la molécula,
ángulos, distancias de enlace) y electrónica (interacciones débiles, cambios en la
distribución global de la carga eléctrica, aparición de cargas parciales).
El modelo encaje inducido, además de la distorsión estructural y electrónica,
considera una alteración en la conformación de la proteína enzimática. Conlleva
una aproximación de grupos catalíticos esenciales del enzima a los grupos
funcionales del sustrato susceptibles de reaccionar. Estos grupos funcionales
residen en los aminoácidos catalíticos y es su propia naturaleza química la que les
permite funcionar como catalizadores. Pueden actuar de las siguientes formas.

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a) Catálisis covalente.- Algunos enzimas se pueden combinar con el sustrato, a
través de un grupo catalítico, para formar un intermediario covalente inestable que
se descompone con facilidad para formar los productos.
b) Catálisis ácido-base.- Proporcionan grupos funcionales capaces de actuar
como dadores o aceptores de protones (carboxilo, amino, etc.), el enzima puede
efectuar una catálisis general ácido-básica.
Catálisis y especificidad son dos propiedades de los enzimas que, responden en
realidad a un mismo fenómeno: la interacción energéticamente favorable entre el
enzima y el sustrato.
2. Factores que afectan a la actividad enzimática
2.1. pH
Los enzimas presentan un pH óptimo para el cual su actividad es máxima; por
encima o por debajo de ese pH su actividad disminuye. Los enzimas son de
naturaleza proteica, se desnaturalizan y pierden su actividad si el pH varía más
allá de ciertos límites. En la mayor parte de los casos el pH óptimo está próximo a
la neutralidad, en concordancia con el pH intracelular, pero existen enzimas con
pH óptimo muy diverso de acuerdo al pH del medio en el que actúan, los enzimas
proteolíticos del jugo gástrico tienen pHs óptimos próximos a 2 ya que este es el
pH de dicho jugo. Existen algunos enzimas a los que el pH no afecta en absoluto.
Ver figura 1.

Figura 1.- Efecto del pH en la actividad enzimática


2.2. Temperatura

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Al igual que ocurre con la mayoría de las reacciones químicas, la velocidad de las
reacciones catalizadas por enzimas se incrementa con la temperatura. La
variación de la actividad enzimática con la temperatura es diferente de unos
enzimas a otros en función de la barrera de energía de activación de la reacción
catalizada. Sin embargo, a diferencia de lo que ocurre en otras reacciones
químicas, en las reacciones catalizadas por enzimas se produce un descenso de
la actividad cuando se alcanza una temperatura crítica. Este efecto es debido a la
desnaturalización térmica del enzima cuando se alcanza dicha temperatura.
Existen dos procesos contrapuestos: 1) El incremento habitual de la velocidad de
reacción con la temperatura y 2) La desnaturalización térmica del enzima. Ver
figura 2.

Figura 2.- Efecto de la temperatura en la actividad enzimática

2.3. Concentración de sustrato [S]


Cuando se miden las velocidades iniciales (Vo) de una reacción enzimática con
distintas concentraciones de sustrato [S] en las mismas condiciones de pH y
temperatura y manteniendo constante la concentración de enzima [E], se obtiene
una curva como se representa en la figura 3. Para valores bajos de [S] la Vo

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aumenta en forma directamente proporcional a la [S] (cinética de primer orden).
Cuando la Vo es independiente de la [S], ocurre una cinética de reacción de orden
cero.

Figura 3.- Efecto de la [S] en la actividad enzimática


2.4. Concentración de enzima [E]
A medida que la concentración de enzima se incrementa, manteniendo constante
las demás condiciones cinéticas, la velocidad de reacción también se incrementa,
la relación es directamente proporcional. Ver figura 4.

Figura 4.- Efecto de la [E] en la actividad enzimática

3. Cinética enzimática

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La cinética enzimática estudia las velocidades de las reacciones catalizadas por
enzimas y su variación frente a cambios de parámetros experimentales. La
velocidad de una reacción química corresponde al número de moléculas de
reactivo(s) que se convierten en producto(s) por unidad de tiempo y depende de la
concentración de los compuestos incluidos en el proceso y de la constante de
velocidad que es una característica de la reacción. En los primeros minutos de la
reacción existe una relación lineal entre el producto formado y el tiempo, se
denomina velocidad inicial (Vo).
La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones catalizadas
enzimáticamente. La cinética de las reacciones enzimáticas, consideran el
mecanismo de reacción catalítica, la especificidad enzimática y varios parámetros
que caracterizan las propiedades físicas de la enzima.
En 1913, L. Michaelis y M. L. Menten desarrollaron una teoría general acerca de la
acción y cinética de las enzimas, esta teoría, es fundamental para el análisis
cuantitativo de todos los aspectos de la cinética de las enzimas y de la inhibición.
La teoría de Michaelis-Menten supone que la enzima (E) se combina en primer
lugar con el sustrato (S) para formar el complejo enzima-sustrato (ES); a
continuación este último se escinde en una segunda etapa, para formar enzima
libre y producto: Ver tabla 1 y figura 5.
Tabla 1.- Pesos moleculares de las enzimas y sus sustratos

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Figura 5.- Ecuación general de una reacción enzimática y mecanismo de acción

Se supone que estas reacciones son reversibles; las constantes de velocidad para
las ecuaciones directa e inversa poseen un subíndice positivo y otro negativo,
respectivamente. La ecuación de Michaelis-Menten, se deducen de las ecuaciones
(1) y (2)

Ecuación de Michaelis-Menten

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Km es la medida de afinidad de la enzima por el sustrato; es decir, un Km alto
indica poca afinidad de la enzima por el sustrato; un Km bajo indica alta afinidad
de la enzima por el sustrato.
La cinética de las reacciones catalizadas por enzimas muestra un rasgo
característico que no se observa en las reacciones no enzimáticas: la saturación
del enzima por el sustrato (ver figura 6). Cuando se mide la velocidad inicial de
una reacción catalizada enzimáticamente se observa que para concentraciones de
sustrato bajas, la velocidad de reacción es proporcional a dicha concentración,
como ocurre para las reacciones no enzimáticas. A medida que la concentración
de sustrato aumenta la velocidad de reacción deja de ser proporcional a ésta. Con
un aumento posterior la velocidad de reacción llega a ser totalmente
independiente de la concentración del sustrato y se aproxima asintóticamente a un
valor máximo que es característico de cada enzima y que se conoce como
velocidad máxima. Se dice entonces que el enzima se halla saturado por el
sustrato. La concentración de sustrato donde la reacción alcanza la mitad de su
velocidad máxima se conoce con el nombre de Km (constante de Michaelis-
Menten).

Figura 6.- Representación gráfica de la ecuación de Michaelis-Menten (hipérbola)

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4. Determinación experimental de parámetros cinéticos
La ecuación de Michaelis-Menten puede transformarse algebraicamente en otras
formas que son más prácticas para la expresión de los datos experimentales. Una
de las transformaciones más empleadas se obtiene tomando los recíprocos de
ambos miembros de la ecuación. Cuando se grafica 1/Vo versus 1/[S], ajustando a
una línea recta (y = mx + b), se obtiene Vmax de la ordenada al origen y Km de la
pendiente. Ésta expresión obtenida se conoce como ecuación de Lineweaver-
Burk. Ver figuras 7 y 8.

Ecuación de Lineweaver-Burk

Figura 7.- Representación gráfica de la ecuación de Lineweaver-Burk

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Figura 8.- Cálculo de los parámetros cinéticos Km y Vmax

Otra posibilidad de transformar la ecuación de Michaelis-Menten es multiplicarla


por la [S] obteniéndose la ecuación de Hanes-Woolf. Ver figura 9.

Ecuación de Hanes-Woolf

Figura 9.- Representación gráfica de la ecuación de Hanes-Woolf

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En este caso se grafica [S]/Vo versus [S], obteniéndose Vmax de la pendiente y
Km de la ordenada al origen.
Otra transformación útil de la ecuación de Michaelis-Menten es la que se conoce
como la ecuación de Eadie-Hofstee. Ver figura 10.

Ecuación de Eadie-Hofstee

Figura 10.- Representación gráfica de la ecuación de Eadie-Hofstee

La representación de Vo versus Vo/[S], donde Vmax se obtiene de la ordenada y


Km de la pendiente.
La siguiente tabla, muestra los valores representativos de los valores de Km.

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Tabla 2.- Valores de Km de algunas enzimas

5. Inhibición enzimática
Los inhibidores, son aquellas sustancias que inhiben o anulan la acción de los
enzimas sin ser transformados. La inhibición enzimática puede ser irreversible o
reversible, esta última comprende a su vez tres tipos: inhibición competitiva,
acompetitiva y no competitiva.
5.1. Inhibición irreversible
Algunos inhibidores se combinan de modo permanente con el enzima uniéndose
covalentemente a algún grupo funcional esencial para la catálisis con lo que el
enzima queda inactivado irreversiblemente. Por ejemplo algunos compuestos
organofosforados, que se utilizan como insecticidas, actúan inhibiendo

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irreversiblemente al enzima acetilcolinesterasa, la cual interviene en la actividad
del sistema nervioso. Estos compuestos organofosforados inactivan al enzima
formando un enlace éster fosfórico con el grupo hidroxilo de un determinado resto
del aminoácido serina, lo que demuestra que ese grupo funcional es esencial para
la catálisis.

5.2. Inhibición reversible


Los inhibidores reversibles se combinan transitoriamente con el enzima libre o con
el complejo enzima-sustrato. Existen tres tipos de inhibición reversible:
5.2.1. Inhibición competitiva
El inhibidor es una molécula que presenta un cierto parecido estructural con el
sustrato, de manera que puede competir con él por acceder al centro activo, pero
que no posee ningún enlace susceptible de ser atacado por el enzima. El inhibidor
forma con el enzima libre un complejo enzima-inhibidor de características cinéticas
análogas a las del complejo enzima-sustrato, pero que, lógicamente, no puede
descomponerse para dar lugar al enzima libre y a los productos. Ver figuras 11 y
12.
E + I ↔ EI

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Figura 11. Representación de Michaelis-Menten con inhibidor competitivo

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Figura 12. Representación de Lineweaver-Burk con inhibidor competitivo

5.2.2. Inhibición no competitiva


El inhibidor puede combinarse con el enzima libre o bien con el complejo enzima
sustrato, interfiriendo en la acción de ambos. Los inhibidores no competitivos se
unen a un lugar del enzima diferente del centro activo provocando en él una
alteración que dificulta bien la formación del complejo enzima-sustrato o bien la
descomposición de éste para dar lugar a los productos. La unión con el inhibidor
produce dos formas inactivas: los complejos EI y ESI, ninguna de las cuales puede
descomponerse para dar lugar a los productos y al enzima libre. Ver figuras 13 y
14.
E + I ↔ EI
ES + I ↔ ESI

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Figura 13. Representación de Michaelis-Menten con inhibidor no competitivo

Figura 14. Representación de Lineweaver-Burk con inhibidor no competitivo

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5.2.3. Inhibición incompetitiva o acompetitiva
El inhibidor no se combina con el enzima libre ni afecta a la unión con el sustrato,
se une al complejo enzima-sustrato, dando lugar a un complejo inactivo enzima-
sustrato-inhibidor, que no se descompone posteriormente para dar lugar a los
productos. El inhibidor se une próximo al centro activo de tal manera que impide
físicamente la salida de los productos. La tabla 3, resume el efecto de los
inhibidores en los parámetros cinéticos
ES + I ↔ ESI
Tabla 3.- Efecto de los inhibidores en los parámetros cinéticos

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6. Bibliografia
1. Boyer, R. 2000 Conceptos de Bioquímica. Edit. International Thomson
Editores. México.
2. Campbell, M. y Farrell, S. 2004. Bioquímica. Edit. THOMSON. México.
3. Conn, E., Stumpf, P., Bruening, P. y Doi, R. 2001. Bioquímica
Fundamental. Edit. LIMUSA México.
4. Horton, H. 2007. Principios de Bioquímica. Edit. Pearson Educación.
Madrid-España.
5. Macarulla, J., Marino, A. Macarulla, A. 2002. Bioquímica Cuantitativa. II
Cuestiones sobre Metabolismo. Edit. REVERTE S.A. Barcelona España.

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1. http://www.ehu.es/biomoleculas/ENZ/ENZ3.htm#kmb
2. http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzime/
3. http://expasy.org/enzyme/
4. http://themedicalbiochemistrypage.org/spanish/enzyme-kinetics-
sp.html#intro

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