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Características morfológicas:

LINFOCITOS:

Los linfocitos son las células de menor tamaño de la serie blanca.


Tienen generalmente un tamaño ligeramente mayor al de los hematíes.
Morfológicamente se caracterizan porque tienen un núcleo redondo, intensamente teñido, y un
pequeño anillo de citoplasma agranular ligeramente basófilo que lo rodea. La expansión del
citoplasma varía en función de la actividad de la célula. Generalmente predominan los linfocitos
pequeños, no obstante podemos encontrar también linfocitos de mediano tamaño o algunos más
grandes.

GRANULOCITOS SEGMENTADOS:
Según el tipo de granulación específica se identifican:
Granulocitos segmentados neutrófilos: son células redondeadas, de tamaño entre 12 y 14 micras.

Su núcleo estásegmentado en 2 a 5 lóbulos, unidos por unos finos puentes cromatínicos.


El citoplasma contiene numerosos gránulos neutrófilos que se tiñen de color marrón con las
coloraciones panópticas habituales, así como cierto número de gránulos primarios o azurófilos
dificilmente visibles al quedar enmascarados por los neutrófilos.
Granulocitos segmentados eosinófilos: tienen un tamaño semejante a los neutrófilos, se
caracterizan por contener en su citoplasma gránulos acidófilos.
Tienen forma redondeada, ocupan todo el citoplasma de la célula y se tiñen de color naranja o
marrón anaranjado con las coloraciones panópticas.
A diferencia de los gránulos basófilos nunca se disponen por encima del núcleo.

Granulocitos segmentados basófilos: son células redondeadas cuyo tamaño oscila entre 10 y 13
micras.
El núcleo de cromatina densa, posee generalmente dos o tres lóbulos unidos por puentes
cromatínicos, en ocasiones difíciles de visualizar dada la presencia de las numerosas
granulaciones basófilas propias de esta célula.
Los gránulos basófilos se disponen encima del núcleo. la granulación basófila adquiere una
coloración rojo-violácea oscura con las tinciones panópticas y tiene una forma poligonal.

MONOCITOS:
Son las células de mayor talla en la sangre periférica. Su tamaño oscila entre 15 y 30 micras de
diámetro, adquiriendo una forma irregular, cuadrangular u oval.
El nucleo, situado en posición central, es voluminoso y adopta formas abigarradas en herradura,
indentado o doblado; la cromatina es densa y con aspecto como peinada en finas franjas
cromáticas.
El citoplasma es amplio con ocasionales mamelones periféricos, de color azul plomizo y
contiene un número variable de gránulos azurófilos. El citoplasma puede contener alguna
vacuola.

Función de las células de la sangre:


Las células de la sangre son, funcionalmente, de tres tipos principales: las células rojas
(eritrocitos), células blancas (leucocitos) y plaquetas (trombocitos).
Los eritrocitos participan en el transporte de oxígeno y de dióxido de carbono; los leucocitos
constituyen una parte muy importante del sistema inmunitario y de defensa del organismo y las
plaquetas son un componente vital en el mecanismo de la coagulación sanguínea.

Función de los leucocitos:


Los leucocitos constituyen una parte importante de los mecanismos defensivos del organismo
contra agentes extraños.
Los granulocitos y monocitos tienen una gran capacidad fagocítica y fagocitan
microorganismos, restos celulares y partículas. Los monocitos y los neutrófilos son los fagocitos
más activos.
Los linfocitos tienen su papel fundamental en la respuesta inmunitaria, que a diferencia de los
fagocitos, dirigen su actividad principalmente contra agentes extraños específicos.
En general, los leucocitos realizan su función de defensa en el interior de los tejidos y para ello
poseen la capacidad de, mediante movimientos ameboides, abandonar el sistema circulatorio y
migrar por los tejidos.

Las células de la serie blanca. Tipos de leucocitos:


Los leucocitos se dividen en: neutrófilos, eosinófilos, basófilos, linfocitos y monocitos.
La fórmula leucocitaria corresponde al recuento porcentual de cada uno de ellos en sangre
periférica. Tiene un gran valor clínico, si bien las alteraciones cuantitativas hay que referirlas
siempre en términos absolutos.
Los leucocitos son fácilmente reconocibles en el frotis ya que son células nucleadas (a diferencia
de las plaquetas y hematíes):

Granulocitos:
Son leucocitos de 10-14 micras de diámetro. Su núcleo presenta diversas lobulaciones, por esa
razón también se conocen como polimorfonucleares, y su citoplasma contiene granulación. En
función del tipo de granulación se diferencian los tres subtipos de granulocitos: neutrófilos
(granulación fina neutrófila), eosinófilos (granulación eosinófila: de color rosado oscuro) y
basófilos (granulación basófila: color azul oscuro). Los precursores inmediatos se llaman
cayados o bandas y se caracteriza por un núcleo menos segmentado.

Granulocito neutrófilo

Granulocito eosinófilo
Granulocito basófilo
Linfocitos:
Son células mononucleadas cuyo tamaño varía entre 6-8 a 10-20 micras dependiendo de su
estado de activación. Son los principales efectores de la respuesta inmune específica. Su núcleo
es redondo y su citoplasma es en general escaso, basófilo y, en ocasiones, contiene una discreta
granulación azurófila.

Linfocito
Monocitos:
Son células de tamaño grande pero variable. Su núcleo tiene un aspecto reniforme, de cromatina
laxa y con presencia de una granulación azurófila fina en su citoplasma. Su función es fagocitar
restos celulares y partículas, lo que los convierte en elementos clave para la respuesta
inmunitaria no específica.

Monocito
Atendiendo a las características expuestas, también se clasifica a los leucocitos en:
Granulocitos: neutrófilos, eosinófilos y basófilos
Agranulocitos: monocitos y linfocitos
Polimorfonucleares:neutrófilos, eosinófilos y basófilos
Mononucleares: monocitos y linfocitos
Fagocitos: neutrófilos y monocitos

Formación de las células sanguíneas:


La formación de las cálulas de la sangre recibe en nombre de hematopoyesis. En el adulto la
hematopoyesis se desarrolla en la médula ósea, debido a su capacidad para permitir el
anidamiento, crecimiento y diferenciación de las células germinales.
Los progenitores de las plaquetas, hematíes, granulocitos y monocitos realizan todo su proceso
de crecimiento y diferenciación en la médula ósea, englobando por ello todos estos procesos
dentro del nombre de mielopoyesis. Como hemos visto a diferencia de los que ocurre con los
demás tipos celulares de la sangre, los linfocitos también se multiplican y diferencían fuera de la
médula ósea, a este proceso se le llama linfopoyesis.

Mielopoyesis:
Formación de granulocitos (granulopoyesis):
El mieloblasto es el estadio más precoz que se puede reconocer. Los mieloblastos originas a los
promielocitos, que se caracterizan por su contenido en gránulos azurófilos primarios. Desde el
estadio de mielocito, la proporción relativa de gránulos primarios desciende mientras que se
incrementa la de gránulos específicos o secundarios. A partir del mielocito, pasando por el
metamielocito, el núcleo celular se segmenta progresivamente hasta el segmentado maduro. La
granulación secundaria o específica es la responsable de que el granulocito sea un neutrófilo,
eosinófilo o basófilo.
Formación de monocitos (Monopoyesis):
El monoblasto es la única celula precusrora reconocible. La monopoyesis se caracteriza por una
reducción del tamaño celular y una indentación progresiva del núcleo. Los monocitos circulan
por la sangre durante uno o dos días y después originan los macrófagos tisulares.
Aunque ni los hematíes ni las plaquetas se consideran globulos blancos o leucocitos, a
continuación nos referiremos brevemente a su formación:
Formación de hematíes (eritropoyesis):
La eritropoyesis está dirigida a la formación de hematíes, globulos rojos o eritrocitos. Son células
que carecen de núcleo y organelas pero que contienen una elevada concentración de
hemoglobina. El primer precursor reconocible es el proeritroblasto que sigue un proceso de
descenso progresivo del tamaño celular, compactación nuclear, incremento de contendio
citoplasmático de hemoglobina pasando por los estadios de eritroblasto basófilo, policromático y
ortocromático. Al final con la expulsión del núcleo se obtiene un hematíe joven que aun conserva
ciertas organales y que puede ser identificado con tinciones especiales y recibe el normbre de
reticulocito. En unos días se degrada toda la manquinaria metabólica celular resultado un
hematíe maduro.
Formación de plaquetas (trombopoyesis):
La formación de las plaquetas comienza con el megacarioblasto que da como resultado de
procesos de duplicación sin división celular el megacariocito. El megacariocito es una célula
enormes que liberan fragmentos de su citoplasma como protoplaquetas y plaquetas.

Linfopoyesis:
Durante el desarrollo de los linfocitos se reconocen los estadios de linfoblasto y prolinfocito.
La característica principal de la linfopoyesis es la disminución progresiva del tamaño celular y el
incremento de la relación núcleo citoplasma. A diferencia de los que ocurre con el resto de
células sanguíneas, los linfocitos se multiplican y diferencias también fuera de la médula ósea.
Este proceso tiene lugar en los tejidos del sistema inmunitario como respuesta a condiciones y
estímulos inmunológicos determinados.
Termociclador PxE
Un instrumento de
excelencia para aplicaciones de PCR
El Termociclador PxE, ha sido desarrollado para proporcionar todas las características del
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Monocito
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El Monocito es uno de los leucocitos denominados agranulocitos, es el leucocito más grande de
todos con un tamaño de 15 a 20 μm.
Se encuentra en 4-8 % en sangre, presenta un núcleo arriñonado (forma de riñón), que se tiñe de
color violeta-azulado con una proporción 2:1 con respecto al resto de la célula.
El citoplasma es abundante y de color gris azulado pudiendo estar acompañado de vacuolas
blanquecinas.
Los monocitos se generan en la médula ósea y después viajan por la sangre, para luego emigrar a
diferentes tejidos como hígado, bazo, pulmones, ganglios linfáticos, hueso, cavidades serosas,
etc. Después de alrededor de 24 horas de permanecer en el torrente sanguíneo, los monocitos lo
abandonan y atraviesan el endotelio de los capilares o las vénulas poscapilares hacia el tejido
conectivo, donde se diferencian rápidamente a macrófagos.
Su principal función es la de fagocitar o "comerse" a diferentes microorganismos o restos
celulares. Para fagocitar se tienen en cuenta diversos factores como la presencia de los molestos
inhibidores. No obstante, el procedimiento es sencillo, y consiste en rodear con los pseudopodos
la molecula, acción que es inhibida en los casos en que el macrófago reconoce una célula como
propia, por medio de las proteínas del CMH o Complejo Mayor de Histocompatibilidad
presentes sobre las membranas celulares.

Fundamento de la Reacción en Cadena de la


Polimerasa (PCR)
Eva Mas, Julio Poza, Jesús Ciriza, Pilar Zaragoza, Rosario Osta y Clementina
Rodellar.
Laboratorio de Genética, Bioquímica y Grupos Sanguíneos.

Facultad de Veterinaria. Universidad de Zaragoza (España)

La PCR es una técnica para la síntesis "in vitro" de secuencias específicas de ADN. Es una forma
simple y muy rápida de multiplicar el ADN presente en diferentes muestras biológica,
obteniéndose millones de copias de una determinada secuencia de ADN. En poco tiempo esta
técnica ha conseguido ser ampliamente utilizada no sólo en el campo de la genética molecular,
sino en otras muchas ciencias. Las siglas PCR significan "Polimerase Chain Reaction", Reacción
en Cadena de la Polimerasa.
El inventor de esta interesante técnica fue Kary Mullis por la cual se le adjudicó el Premio Nobel
de Química en 1993. Utilizó la PCR para la amplificación del gen de la b-globina humana
(Mullis y cols., 1986; Mullis y Faloona., 1987) y el diagnóstico prenatal de la anemia falciforme
(Saiki y cols., 1985; Saiki y cols., 1986; Embury y cols., 1987), desde entonces la PCR ha
revolucionado todos los campos que estudian y manipula los ácidos nucleicos.
Mullis se basó en la replicación del ADN en los organismos eucariotas realizada por la DNA
polimerasa. Estas enzimas realizan la síntesis de una cadena complementaria de DNA en el
sentido 5´-> 3´ usando un molde de cadena sencilla, pero a partir de una región de doble cadena.
Para crear esta región doble cadena se usan los denominados cebadores (primers). Son una pareja
de oligonucleótidos sintetizados de manera que sean complementarios a cada uno de los
extremos 3´ del fragmento de DNA que se desea amplificar.
Partiendo de este principio, la reacción en Cadena de la Polimerasa se basa en la repetición de un
ciclo formado por tres etapas:
1ª Desnaturalización del ADN doble cadena
2ª Hibridación de los cebadores a la zona 3´específica de cada una de las hebras
3ª Extensión del cebador por actuación de la DNA polimerasa
En la primera etapa (desnaturalización) la doble hélice de ADN se separa en dos hebras. Para
ello se realiza una incubación de la muestra a altas temperaturas (93-97ºC). La
renaturalización se producirá cuando la temperatura disminuya.
En el segundo paso (hibridación) los cebadores se unen a las zonas 3´ complementarias que
flanquean el fragmento que queremos amplificar. Se realiza gracias a la bajada de la
temperatura (50-65ºC).
En la tercera etapa (elongación) se produce la síntesis de una cadena sencilla (produciéndose
un fragmento de doble cadena por la complementariedad) en la dirección 5´-> 3´ mediante la
enzima DNA polimerasa, la cual incorpora los deoxinucleótidos fosfato presentes en el
medio siguiendo la cadena molde. Todos estos pasos se pueden apreciar gráficamente en la
Figura 1.
Figura 1: Pasos básicos de la PCR (de Andy Vierstracte 1999)

El proceso se lleva a cabo en un termociclador (fig.2). Un aparato que realiza los ciclos en
los tiempos y temperaturas programadas de forma exacta.
Figura 2: Termociclador de ADN

Como se muestra en las figuras 3a y 3b, observamos que una vez completado el primer ciclo,
disponemos de 2 copias de la muestra original, al final del segundo ciclo tenemos 4, al final
del tercero 8...Si los ciclos se producen un número "n" de veces y suponiendo que el número
de copias de ADN se duplica en cada ciclo, obtenemos una cantidad de ADN de 2n, por lo
que la amplificación se realiza en forma de progresión geométrica.
Figura 3a: Amplificación exponencial del PCR (de Andy Vierstracte 2001)

Figura 3b: Amplificación exponencial del PCR (de M.E. Gilles-González 1997)

Es importante recalcar que los productos obtenidos tras la tercera etapa son de dos tipos:
"producto corto" y "producto largo". El producto corto tiene una longitud perfectamente
definida por los extremos 5´de los cebadores y contiene exactamente la secuencia que se
desea amplificar. Es el fragmento que se almacena de manera exponencial durante la
reacción. El producto largo es el que incorpora las cadenas de ADN originales de la muestra
y cuyos extremos 3´no están definidos. Sin embargo, es importante aclarar que al final de la
PCR, la cantidad de producto corto sintetizado es muy superior en comparación con el
producto largo, por lo que generalmente para posteriores estudios a partir del producto de la
PCR, se desestima. (Fig.4)

Figura 4: Detalle de los cuatro primeros pasos de la PCR (de Andy Vierstracte 2001)

La detección del producto de la Reacción en Cadena de la Polimerasa se realiza normalmente


mediante corrido electroforético (fig.5). Dependiendo del tamaño de la amplificación y de la
resolución que deseemos usaremos diferentes geles (agarosa, poliacrilamida) a distintas
concentraciones. La posterior visualización se puede realizar con bromuro de etidio (lámpara
de luz UV), tinción de plata, fluorescencia, radiactividad (radiografía).
Figura 5: Preparación del corrido electroforetico

En la actualidad se desarrollan métodos para poder cuantificar el producto de la PCR,


visualizando in situ sobre tejidos (Cao, Y. y cols, 2000). Lo que hace prever un crecimiento,
si cabe mayor, del uso de la técnica de la PCR.
A continuación trataremos de profundizar en los componentes y parámetros más importantes
para obtener una amplificación óptima.

Componentes y optimización de la reacción de amplificación:


Muestra de ADN
Existen una serie de reglas sencillas para que el DNA molde no sea un problema
en la reacción:

· Integridad del ADN: no puede estar fragmentado en trozos más pequeños


de lo que queremos amplificar.

· Origen de la muestra y proceso de extracción: la muestra no debe llevar


agentes quelantes (EDTA) que reducen la concentración de iones de Mg.
en la disolución. Tampoco debe haber determinados factores sanguíneos,
fenol, detergentes... que inhibirían la actividad de la polimerasa.

· Cantidad de la muestra: si se dispone de suficiente cantidad para la


amplificación de ADN genómico de copia única se usan cantidades de
100-500 ng. En el caso de zonas repetidas se puede reducir esta cantidad a
10-50 ng. El mínimo oscila entre 10-100 ng. y el máximo entre 400-500
ng.
Diseño de los cebadores
Para la elección de los primers, existen una serie de normas que nos pueden
ayudar, aunque hay que indicar también que existen programas de ordenador que
nos facilitan esta tarea (DNAsis, Primer3, etc.).

· El contenido en G + C debe ser aproximadamente del 50%. La relación


máxima de purinas/pirimidinas será 60%/40%.

· Deben evitarse zonas con largas secuencias de una sola base.

· No seleccionar cebadores que en su extremo 3´ tenga una importante


estructura secundaria.

· Se recomienda que los extremos las últimas bases sean G o C.

· Se debe evitar la complementariedad entre la pareja de primers. Si ésta


existe entre los extremos 3´, se aumenta la posibilidad de que se creen
dímeros de cebadores.

· Normalmente deben tener un tamaño de 18-30 pb.

· La Tª de hibridación de los cebadores ha de ser similar en ambos y será


variable en función de la secuencia de los mismos. Generalmente oscila
entre 45 y 65ºC.

· Si el primer es menor a 20 pb, la temperatura de fusión (Tm), se calcula en


base a la siguiente fórmula:
Tm= 4 (G+C) + 2(A+T)
Siendo G, C, T y A el número de cada una de las bases que forman cada
uno de los oligos. La temperatura de hibridación debe ser
aproximadamente 5ºC menor que la temperatura calculada.
DNA Polimerasa
Existen diferentes tipos de DNA polimerasa que llevan a cabo la replicación del
ADN, siguiendo el mismo método de síntesis. Se pueden clasificar en:
Termolábiles: Tª óptima de 37-42ºC. Se desnaturalizan con el calor.
Fragmento Klenow DNA polimerasa
DNA polimerasa I T4 DNA polimerasa
TIPO de DNA polimerasa I dependiente de RNA
(E. coli) (E. coli)
(E. coli) (retrovirus)

5´-> 3´
Sí (baja) Sí (baja) Sí (medio) Sí
polimerasa
5´-> 3´
Sí No No Exorribonucleasa
exonucleasa

3´-> 5´
Sí (baja) Sí (baja) Sí (alta) exorribonucleasa
exonucleasa

Termoestables: Tª óptima de 74 ºC. Resiste durante 40-50´a 96ºC.


Taq DNA Taq DNA
Tipo Replicasa Tth polimerasa
polimeras (94 Kda) polimeras (61 Kda)

5´-> 3´
Sí Sí Sí Sí
polimerasa

5´-> 3´
Sí No ? ?
exonucleasa

3´-> 5´
No No No ?
exonucleasa

Tipos Taq Pwo Pfu Pfx

Fidelidad 1x 12x 30x 48x

Amplificación Máxima 1 Kb 4 Kb 5 Kb 12 Kb

U/Reacción 2.5 2.5 1.25-5 1.25-5

Inicialmente se usó el fragmento Klenow de la DNA polimerasa de E. coli (Saiki


y cols., 1985) la cual posee actividad 3´-> 5´ exonucleásica que le proporciona la
capacidad de cambiar el nucleótido que ha sido erróneamente incorporado. La
importancia de esta actividad radica en que aumenta la fidelidad de la replicación
del ADN original. Sin embargo, se trata de una enzima termolábil por lo que no
soporta los ciclos y temperaturas utilizados en una PCR.
Actualmente la polimerasa que se utiliza es la Taq polimerasa (Estivil, 1991). Es
una enzima termoestable aislada de Termus aquaticus (Taq), una bacteria que
soporta altas temperaturas. La Taq polimerasa ha simplificado enormemente la
técnica de la PCR, ya que ha permitido su automatización (desarrollo del
termociclador).
Como se observa en las Tablas anteriormente descritas, las polimerasas
termoestables, como la Taq polimerasa, carecen de actividad 3´-> 5´
exonucleásica, lo que las hace menos seguras a la hora de comparar las
fidelidades. Por ello hay que intentar conseguir las mejores condiciones para que
ésta aumente. Podemos citar:

· No usar un alto número de ciclos, ya que la tasa de error es proporcional al


número de estos. Normalmente el número de ciclos utilizado es de 25-30.

· La concentración de los deoxinucleótidos (dNTPs) debe ser igual para los


4 y debe ser la más baja posible para que nos permita conseguir la
cantidad de ADN necesaria.

· Disminuir en lo posible el tiempo de cada etapa.

· La concentración de Mg++ en la reacción oscila entre 0,50 y 2,5 mM. Se


trata de un ión necesario, pero su exceso hace que disminuya la
especificidad de la PCR.

Deoxinucleótidos trifosfato (dNTPs)


Son cuatro: dATP, dGTP, dCTP y dTTP. Como hemos señalado anteriormente se
deben añadir en la solución de la reacción en concentraciones iguales que
normalmente oscila entre los 20 y los 200 mbol">mM. Los dNTPs pueden captar
Mg++, por lo que las concentraciones de ambos componentes deben guardar
siempre la misma relación. No debemos variar ninguno de ellos de manera
independiente. Se aconseja (Bradley, 1991) que la concentración de Mg++ sea 0,5-
1 mM veces superior a la concentración de dNTPs.

Tampón de la reacción
Por lo general está formado por: 10 mM tris-HCl (pH=8.4 a Tª ambiente), 50 mM
ClK, 0.1% w/v gelatina y 1.5 mM MgCl2.
Algunos autores recomiendan el uso de adyuvantes, los cuales ayudarían en la
práctica a aumentar la especificidad y fidelidad de la reacción en cadena de la
polimerasa. El dimetilsulfóxido (DMSO) añadido al buffer de la reacción en un
10% contribuye a la disminución de la estructura secundaria del ADN (Anderson,
1990). También se pueden usar detergentes como el tween 20, laureth 12 (0.1%) o
Tritón x10, que ayudan a estabilizar la enzima. Existen también protocolos que
incorporan polietilenglicol (PEG), glicerol, formamida, seroalbúmina bovina
(BSA), etc, aunque no son en ningún caso imprescindibles.

Sales
Es de gran importancia la concentración de dos cationes que son añadidos en
forma de sales.

· Cloruro potásico (KCl). Influye en la desnaturalización del ADN.

· Elevadas concentraciones del ión K+ favorece la desnaturalización


de secuencias cortas de ADN.

· Bajas concentraciones de K+ ayudan a la desnaturalización de


secuencias largas de ADN.

· Cloruro de magnesio (MgCl2). Aumenta la temperatura de hibridación del


DNA. La concentración de este ion resulta fundamental para la
optimización de la reacción.

· Altas concentraciones de Mg++ disminuyen la especificidad de la


PCR.

· Bajas concentraciones de Mg++ aumentan la especificidad de la


reacción.

Temperaturas y tiempos de los ciclos


Como hemos explicado anteriormente la Reacción en Cadena de la Polimerasa se
realiza en tres etapas que constituyen un ciclo, que repite durante un número
determinado de veces. El tiempo, la temperatura y el número de ciclos son
factores determinantes en los resultados de la PCR, por lo tanto modificándolos
podemos optimizar la reacción.
Las primeras reacciones se realizaban manualmente cambiando continuamente los
tubos de un baño María a otro de diferente temperatura (la Tª de
desnaturalización, la de hibridación y la de elongación). El proceso resultaba
demasiado tedioso y era difícil alcanzar las temperaturas y los tiempos correctos,
por lo que se desarrolló el termociclador que lo hacía de manera automática.
A continuación describiremos de forma más detallada el tiempo y la temperatura
de cada una de las etapas de un ciclo.
Desnaturalización
Se trata de una etapa crítica ya que es muy importante que el ADN molde
se desnaturalice completamente. Para lograrlo de manera adecuada se
recomiendan temperaturas de 94ºC durante 30´´-1´. Si la muestra tiene alto
contenido de G+C se puede aumentar el tiempo o la temperatura.
Sin embargo hay que tener en cuenta que la actividad de la enzima decrece
de manera muy rápida a partir de los 95ºC, por lo que a estas temperaturas
o superiores es aconsejable disminuir el tiempo de incubación.
En la práctica se suele añadir un período de desnaturalización antes de
comenzar los ciclos para asegurarnos que se produce a lo largo de toda la
muestra de ADN. Esta etapa suele ser de 5´a 94ºC.
Hibridación
En este caso, la temperatura y el tiempo van a depender de 3 factores
relacionados con los oligonucleótidos: la composición de bases, el tamaño
y la concentración.
En la práctica, la temperatura de hibridación puede oscilar entre 45ºC y
65ºC, durante un tiempo comprendido entre 30 segundos y 1 minuto. Un
aumento de temperatura o del tiempo favorece la especificidad ya que
disminuye las uniones incorrectas de los cebadores con la hebra molde.
Elongación
En la mayoría de las reacciones, la etapa de extensión se realiza a 72ºC.
Teóricamente esta temperatura puede variar entre 70-72ºC. El tiempo de
extensión depende del tamaño de la amplificación. Se puede estimar un
tiempo de 1min. para elongar 1 Kb.
En la práctica es normal que al final de todos los ciclos se realice una
última elongación de 5´a 72ºC.

Número de ciclos
También adquiere gran relevancia a la hora de optimizar una PCR el número de
ciclos que se utilizan. Este número depende de la cantidad de ADN que existe en
la muestra una vez que el resto de factores han sido optimizados (normalmente de
manera empírica).
Es importante no realizar un número alto de ciclos ya que puede dar lugar a la
amplificación de productos no deseados originados por hibridaciones no
específicas.
Hay que tener en cuenta que la reacción está producida por una enzima que sufre
el efecto meseta que describe la atenuación en la tasa de la acumulación del
producto. Después de un número determinado de ciclos la amplificación deja
producirse de manera exponencial y llega a una fase estacionaria. Generalmente
cuando el efecto meseta se produce, la cantidad de ADN sintetizado es suficiente
para su posterior utilización.

Contaminación en la PCR
La Reacción en Cadena de la Polimerasa es una técnica muy sensible, por lo que
es de gran importancia evitar contaminaciones, ya que es posible que el ADN no
deseado (aunque se encuentre en una cantidad muy pequeña) se amplifique y
obtengamos un resultado que no es real. Vemos que una de sus mayores ventajas
de la técnica, se convierte a la vez en el principal inconveniente (Kwok y Higuchi,
1989).
Existen una serie de normas que ayudan a evitar las contaminaciones. En el caso
de trabajar con muestras de ARN las precauciones se deben extremar al máximo:

· Lugar físico exclusivo para realizar la PCR

· Uso de instrumental exclusivo para la PCR

· Utilización de reactivos y tubos estériles

· Uso de guantes por el manipulador

· Realización de controles de blanco (se añade agua en lugar de ADN, no


debe existir amplificación).
Bibliografía
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31

· Cao, Y., Kollow K. y Liu. G.Y. (2000) In-situ inmuno-PCR to detect antigens. The Lancet. 356:1002-
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· Embury, S.H., Scharf, S.J., Saiki, R.K., Golson, M.A., Golbus, M., Arheim, N. y Erlich, H.A.
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Enzymatic amplification of b-globin genomic and restriction site analysis for diagnostic of sickle cell
anemia. Science. 230:1350-1354.

· Saiki, R.K., Bugawan, T.F., Horn, G.T., Mullis, K.B. y Erlich, H.A. (1986) Nature 324:163.

· Schnell, S; Mendoza, C. (1997) Theoretical description of the polymerase chain reaction. J. Theor.
Biol. 7, 188 (3):313-8

· Schutzbank, T.E. y Sterm, H.J. (1993) Principles and appications of the PCR. J. Int. Fed. Clin.
Chem. 35 (3):96-105. Review.

O Termociclador TC - 312 possui um design completamente moderno com uma interface de


programação fácil e intuitiva, rápida velocidade de aquecimento, podendo ser conectado em
rede com outros equipamentos ou a um PC.

· O mais compacto termociclador do mercado ( 33,0 x 17,0 cm).

· Rápida velocidade de aquecimento ( até 3,6 °C/seg.).

· Baixo custo.

· Controle por computador e capacidade para operação em rede.

· Teclas alfanuméricas, teclado e identificação de programas.


· Rápida edição de programas utilizando-se templates prontos.

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· Com dois modelos disponíveis para 25 microtubos de 0,2 mL/ microplaca com 25
posições e 20 tubos de 0,5 mL para microcentrífuga .

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Termociclador
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Termociclador, también conocido como máquina de PCR, o reciclador térmico de PCR es un
aparato usado en Biología Molecular que permite realizar los ciclos de temperaturas necesarios
para una reacción de amplificación de ADN o para reacciones de secuencia con el el método de
Sanger. El modelo más común consiste en un bloque de resistencia eléctrica que distribuye a
través de una placa una temperatura homogénea durante tiempos que pueden ser programables,
normalmente con rangos de temperatura de 4°C a 96 °C. Dado que las reacciones incubadas en el
aparato son en soluciones acuosas, suelen incluir una placa de tapa calentada constantemente a
103°C para evitar la condensación de agua en las tapas de los tubos donde ocuirre la reacción, y
así evitar que los solutos se concentren, que de otra forma modificaría las condiciones óptimas
para la enzima polimerizante y la termodinámica del apareamiento de los iniciadores. También
existen otras tecnologías menos populares utilizando distribución de aire caliente en tubos
suspendidos, logrando el mismo objetivo de transferir calor eficientemente a la reacción para que
cambien los ciclos de temperaturas
Obtenido de "http://es.wikipedia.org/wiki/Termociclador"

Neutrófilo
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Presentación de antígeno
1. Proteína invasora/antígeno
2. Macrófago/Célula presentadora de antígeno
3. Complejo antígeno:MHC II] (presentación de antígeno), activación de linfocito Th
4. LinfocitoTh (cooperador)
5. Proteína invasora unido a anticuerpos de membrana
6. Linfocito B
7. Procesamiento de antígeno (MHC tipo II)
8. Complejo antígeno:MHC II (presentación de antígeno)
9. Producción de anticuerpos específicos para el antígeno
10. Activación de linfocitos B con los Th activados.

linfositos
Los linfocitos son un tipo de glóbulos blancos agranulocitos. Es el leucocito de menor tamaño,
su tamaño varía entre 7 y 15 μm, y representa del 24 a 32% en la sangre. Presenta un núcleo
esférico que se tiñe de violeta-azul y en su citoplasma frecuentemente se observa como un anillo
periférico de color azul. Poseen un borde delgado de citoplasma que contienen algunas
mitocondrias, ribosomas libres y un pequeño aparato de Golgi.
Los linfocitos son células de alta jerarquía en el sistema inmune, principalmente encargadas de la
inmunidad específica o adquirida.
Estas células se localizan fundamentalmente en los órganos linfoides. Tienen receptores para
antígenos específicos y, por tanto, pueden reconocer y responder al que se les presente. Por
ultimo, los linfocitos se encargan de la producción de anticuerpos y de la destrucción de células
anormales. Estas respuestas ocurren en el interior de los órganos linfoides, los cuales, para tal
propósito, deben suministrar un entorno que permita la interacción eficiente entre linfocitos,
macrófagos y antígeno extraño.

· Linfocitos B (bursodependientes): son los responsables de la respuesta humoral, es decir,


de la producción de anticuerpos, proteínas (inmunoglobulinas) que se adhieren al agente
patógeno permitiendo que los otros glóbulos blancos puedan localizarlo y destruirlo con
mayor rapidez.

· Linfocitos T (timodependientes): ayudan a detectar los antígenos

· Linfocito T4.

· Linfocito T8.

· Células asesinas naturales, Natural Killer (NK) o linfocito grande granular.

Un agitador magnético consiste de una pequeña barra magnética (llamada barra de agitación) la
cual esta normalemente cubierta por una capa de plástico (usualmente Teflon) y una placa debajo
de la cual se tiene un magneto rotatorio o una serie de electromagnetos dispuestos en forma
circular a fin de crear un campo magnético rotatorio. Es muy frecuente que tal placa tenga un
arreglo de resistencias eléctricas con la finalidad de dotarle de calor necesario para calentar
algunas soluciones químicas. Durante la operación de un agitador magnético típico, la barra
magnética de agitación(también llamada pulga, frijol o bala magnética) es deslizada dentro de un
contenedor ya sea un matraz o vaso de precipitados -de vidrio borosilicato preferentemente-
conteniendo algún líquido para agitarle. El contenedor es colocado encima de la placa en donde
los campos magnéticos o el magneto rotatorio ejercen su influencia sobre el magneto recubierto
y propician su rotación mecánica.
Arthur Rosinger originario de Newark Nueva Jersey, Estados Unidos, obtuvo la patente
2,350,534 bajo el nombre de Agitador Magnético el 6 de junio de 1944, habiéndose registrado su
primera aplicación a partir del 5 de octubre de 1942. La patente contiene una descripción
detallada de la barra magnética recubierta colocada dentro de un contenedor, la cual era
accionada por la influencia magnética de otro magneto colocado debajo de la base de soporte. El
señor Rosinger también explica en su patente que el recubrimiento del magneto agitador (pulga)
debiese ser en vidrio o porcelana a fin de hacerlo químicamente inerte.
El recubrimiento plástico de la barra fue independientemente creado por Edward McLaughlin
empleado de los laboratorios Torpedo Experimental Establishment (TEE), localizados en
Greenock, Escocia, quien nombró precisamente a la barra de agitación, como "pulga" debido a
que comenzaba a saltar rápidamente cuando la velocidad de rotación se elevaba de manera
importante.
Una patente anterior para una mezcladora magnética es la número 1,242,493 extendida el 9 de
octubre de 1917 a nombre de Richard H. Stringham de Bountiful, Utah,Estados Unidos. La
mezcladora de Stringham usaba electromagnetos estacionarios en la base a diferencia del
magneto permanente, rotatorio, para accionar a la barra magnética.
El primer agitador magnético multipunto fue desarrollado por Salvador Bonet de la compañia
SBS en 1977. También introdujo la rotacion para el poder de agitación en "litros de agua", el
cual es el estándar hoy en día.
Los agitadores magnéticos son preferidos en lugar de los de mecanismo de engranes debido a
que son más silenciosos, más eficientes, y no tienen partes móviles que puedan romperse o
desgastarse (simplemente la barra de agitación en sí). Debido a su pequeño tamaño, la barra de
agitación es más fácil de limpiar y esterilizar que otros aparatos de agitación.
Las agitadoras magnéticas resuelven dos problemas mayores al usarse en lugar de los agitadores
motorizados. Primero, los agitadores motorizados requieren el uso de lubricantes, los cuales
pueden en un momento dado contaminar los reactivos. Segundo, en un agitador motorizado el
sellar herméticamente la conexión mecánica rotatoria del agitador motorizado puede ser un
problema en el caso de tratarse de un sistema cerrado, o por regulación ambiental o por tratarse
de un proceso en el cual debe haber ausencia de polvo, agua u oxigeno)
El agitador magnético también tiene sus desventajas, las limitadas dimensiones de la barra de
agitación significan que no puede ser utilizado más que para experimentos a nivel laboratorio (en
pequeña escala o análisis químico). Además los líquidos viscosos o suspensiones espesas, son
muy difíciles de agitar por este dispositivo, aunque existen algunos modelos con imanes
especiales que consiguen el objetivo.

Se denomina basófilo a cualquier célula que se tiñe fácilmente con colorantes básicos. Sin
embargo, cuando se emplea este término sin ninguna aclaración adicional, suele referirse a uno
de los tipos de leucocitos (glóbulos blancos de la sangre) de la familia de los granulocitos. Es
uno de los polimorfonucleares, al igual que los neutrófilos y los eosinófilos.
Los gránulos de los basófilos son gruesos pero escasos. Son células de unas 10 μm de diámetro y
su núcleo tiene una forma que recuerda a una S. Se originan en el mismo lugar que el resto de los
granulocitos (médula ósea), y son los menos numerosos, ya que constituyen sólo el 0,5% del
total. Tienen una activa participación en la respuesta inmunitaria, a través de la liberación de
histamina, serotonina en bajas concentraciones, y otras sustancias químicas.