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El tipo de soporte en el cual se inmovilizan las

sondas puede ser de diferente naturaleza, siendo


2.1.1. Tecnologías de fabricación
las membranas de nylon y los soportes rígidos de microarrays de ADN
como el plástico o el vidrio los más utilizados. En
la actualidad, debido a su adaptación al marcaje La fabricación de un microarray consiste en la
fluorescente, alta sensibilidad, posibilidad de disposición de las sondas sobre la superficie del
realizar distintas funcionalizaciones químicas y mismo en posiciones conocidas y ordenadas.
fácil manejo y resistencia, el vidrio ha suplantado Existen diferentes tecnologías para la producción
a las membranas como soporte para microarray de microarrays que han de cumplir una serie de
de ADN8. requisitos, lo que ha generado la aparición de
diversas plataformas comerciales. Estos
requerimientos han motivado que los avances
tecnológicos relacionados con la fabricación de
microarrays queden reflejados en los sistemas de
producción y las plataformas introducidas por
diferentes empresas.

Requisitos de las tecnologías de producción de microarrays

Robustez Reproducibilidad
Consistencia Uniformidad
Automatización Alta precisión
Velocidad de fabricación Alta resolución
Versatilidad Coste-efectividad

Las principales tecnologías empleadas en la fabricación de microarrays de ADN se pueden clasificar en


función de la metodología empleada para disponer sondas de forma ordenada.

Principales tecnologías empleadas en la fabricación de microarrays

Ink Jetting: impresión de sondas sin contacto.

Pin deposition: impresión de sondas por contacto.

Fotolitografía: síntesis in situ mediante métodos químicos.

Polipirrolización: inmovilización electroquímica de sondas modificadas por pirroles.

Electrodeposición: inmovilización de sondas de ADN sobre nanopartículas de biorreconocimiento en electrodos.


Unión con direccionamiento electrónico.

8
Meloni, R., et al. (2004). DNA microarrays and pharmacogenomics. Pharmacological Research. Vol. 49: 303-308.
La técnica de Ink jetting emplea inyectores
La electrodeposición selectiva se basa en la
piezoeléctricos. Junto al capilar de vidrio que
inmovilización de sondas de ADN sobre
contiene la muestra se localizan cristales
nanopartículas de biorreconocimiento en
piezoeléctricos que se deforman al aplicar voltaje.
electrodos de resolución fotolitográfica. Estas
Esta deformación presiona el capilar y expulsa
nanopartículas consisten en pequeñas esferas de
una pequeña cantidad de fluido por el extremo
oro modificadas con oligonucleótidos.
del capilar, que se deposita en un punto concreto
de la superficie.
El posicionamiento electrónico, técnica
desarrollada por Nanogen, está basada en la
La técnica Pin deposition emplea agujas o pins
concentración electroforética de oligonucleótidos
que se empapan en la solución que contiene la
biotilinizados sobre un gel de agarosa modificado
muestra y se transfiere una pequeña cantidad al
con estreptavidina. Este gel puede direccionarse
extremo de la aguja. Al hacer contacto el extremo
electrónicamente sobre un array con propiedades
con la superficie del chip, se imprime una gota en
de electrodo. La incorporación de campos
una posición determinada de la superficie. Una
eléctricos permite controlar la deposición de las
variante de este método utiliza en vez de agujas,
sondas, así como incrementar la concentración de
cabezales similares a la punta de una pluma
las muestras sobre estas últimas, aumentando
estilográfica.
por tanto la efectividad de la hibridación. Existen
diversos métodos basados en este tipo de técnica,
Respecto a la Fotolitografía, la técnica se basa que combinan los avances producidos en la
en la unión de los nucleótidos protegidos por un investigación con microarrays con los derivados
agente químico fotodegradable sobre un soporte de la microfluídica.
de vidrio que posee determinados grupos
reactivos. Mediante una máscara que se sitúa Algunas de las técnicas anteriormente descritas
sobre el chip se logra enfocar un haz de luz hacia
están confinadas para su uso en laboratorio por
unas posiciones determinadas, degradando al diferentes motivos. Tal es el caso de la
agente químico protector en dichas zonas y
polipirrolización, que si bien presenta ciertas
dejándolo intacto en las zonas protegidas por la ventajas como su bajo coste, existen una serie de
máscara. Posteriormente se añade un medio que
factores que hacen inviable su empleo a escala
contiene uno de los cuatro nucleótidos que se industrial, como son su escasa reproducibilidad de
unirá, mediante enlace covalente, al soporte con
la deposición de sondas, así como el tiempo
los grupos reactivos que hayan quedado necesario para fabricar un array.
desprotegidos. Cada grupo añadido lleva una
molécula receptora fotodegradable. Este proceso
Las tecnologías líderes en el mercado son la
se va repitiendo con los diferentes nucleótidos y
impresión por chorro de tinta o ink-jetting, la
máscaras hasta generar unos oligonucleótidos con
fotolitografía, pin deposition y el posicionamiento
las secuencias de interés. La pionera en el empleo
electrónico. Además, en los últimos años se ha
de esta técnica fue Affymetrix y en el primer chip
desarrollado toda una serie de variantes de estas
que construyó alcanzó una densidad de 106
tecnologías orientadas a mejorar el control sobre
sondas por cm2. En la actualidad, el Genechip®
el tamaño y la morfología de la muestra de ADN
comercializado por esta compañía consigue una
depositada sobre el array. Este es el caso de la
densidad de más de 9.000 sondas de una longitud
tecnología Bubble Jet Printing Technology de
de 30 bases en 1,6 cm2.
Canon10 que es capaz de crear un array de alta
densidad con unos puntos de tamaño uniforme y
La técnica de Polipirrolización está basada en la forma regular.
copolimerización de un grupo pirrol y los
oligonucleótidos que portan parte del pirrol en su
La siguiente tabla recoge las principales
extremo 5’. Las secuencias de oligonucleótidos
tecnologías líderes en el mercado en fabricación
modificados con pirrol se inmovilizan
de microarrays, sus principales características,
electroquímicamente en lugares específicos
ventajas y desventajas, así como las aplicaciones
mediante el encendido secuencial de los
a las que van dirigidas.
diferentes electrodos9.

9
Càmpas, M.; Katakis, I. (2004). DNA biochip arraying, detection and amplification strategies. Trends in analytical
chemistry Vol. 23 (1): 49-62.
10
Bubble Jet Technologies Applied to DNA Chips, Canon (http://www.canon.com/technology/detail/bj/dna_chips).
14

PRINCIPALES TECNOLOGÍAS DE FABRICACIÓN DE MICROARRAYS DE ADN

Empresa Técnica Sonda Densidad Detección Ventajas Desventajas Aplicación

Muestras de
Perfiles de expresión,
Synteni/Incyte Ink-jetting ADN de 500 2.780 Fluorescenci
Bajo coste Baja densidad identificación génica, diagnóstico,
Pharmaceuticals en vidrio nt puntos/ a
análisis de polimorfismos
Fragmentos cm2 Radioisotópi
de PCR ca
Oligos de 5nt 1.024 puntos Perfiles de expresión,
Deposición de
Muestras de en 1,15 cm2 Fluorescencia identificación génica, diagnóstico,
Hyseq pins en Bajo coste Baja densidad
ADN de 500- 64 puntos en Radioisotópica análisis de polimorfismos,
membrana
2.000 nt 0,6 cm2 secuenciación

Fotolitografía
Perfiles de expresión,
con Oligos de 9.000 puntos Alto coste
Affymetrix Fluorescencia Alta densidad diagnóstico, análisis de
nucleótidos 25 nt en 1,6 cm2 Síntesis in situ
polimorfismos
activados

Deposición de
pines en Perfiles de expresión,
Pequeños
Clinical Micro electrodos o 36 dianas en Baja densidad identificación génica, diagnóstico,
fragmentos de Impedancia Bajo coste
Sensors fotolitografía un chip Alto coste secuenciación, análisis de
ADN/ARN
con oligos polimorfismos
activados

Perfiles de expresión,
Posicionamiento 99 puntos identificación génica, diagnóstico,
Nanogen Oligos de 20 nt Fluorescencia Alta densidad Alto coste
electrónico en 2 mm2 identificación de STR (short
tandem repeat)

Tabla 2. Principales tecnologías de fabricación de microarrays.


Fuente: Campàs, M.; Katakis, I. (2004). DNA biochip arraying, detection and amplification strategies.
Trends in Analytical Chemistry. Vol. 23(1): 49-62.
APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA

2.1.2. Técnicas de detección limita el desarrollo de nuevas plataformas de


de la hibridación biochips. Los métodos de detección en los cuales
en microarrays de ADN no se necesita el marcaje de la diana están
tomando relevancia en nuevas aplicaciones de los

La detección de la hibridación es un paso clave biochips, ya que permiten una mayor sensibilidad,
para revelar qué sondas se han unido a sus reducción de la muestra necesaria y simplificación
dianas complementarias procedentes de la del proceso de preparación de la muestra 11.
muestra. Determinadas técnicas de detección de
la hibridación del ADN requieren del marcaje La siguiente tabla muestra las diferentes técnicas de
previo de la sonda a la molécula diana, por lo que detección de la hibridación en los microarrays de
la detección de la hibridación es un proceso que ADN con su transductor y marcaje correspondiente:

TÉCNICAS DE DETECCIÓN DE LA
HIBRIDACIÓN EN MICROARRAYS
DE ADN

Técnicas Transductor Marcaje

Fluorescencia

Óptico

Fluoróforos

Piezoeléctrico

Piezoeléctrico

No necesario

Cronopotenciometría
Voltametría
Impedancia

Electroquímico

Complejos catiónicos
Compuestos redox

Cronoamperometría

Electroquímico

Enzimas redox

Capacitancia

Electroquímico

No necesario

Colorimetría

Óptico

Enzimas

Resonancia de plasmones en superficie

Óptico

No necesario

15
APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA

Quimioluminiscencia electroquímica
amplificación de por sus extremos.
la señal de Para detectar la
Óptico
hibridación que señal, se procede
Quelato rutenio emplea a añadir
oligonucleótidos marcadores
Tabla 3. Técnicas de detección de la hibridación en
microarrays de ADN. circularizados. fluorescentes
Fuente: Campàs, M.; Katakis, I. (2004). DNA biochip Mediante dos complementarios
arraying, detection and amplification strategies. Trends in pasos
SondaAdición dianaAdición sonda 2ADN ligasa sucesivos para su
analytical chemistry. Vol. 23(1)1: 49-62.
con sondas de hibridación con los
hibridación, se múltiples sitios
consigue obtener repetidos en la
una secuencia de secuencia de ADN
ADN inmovilizado elongada. Este
en el soporte método de
capaz de hibridar amplificación es
con un ADN rápido,
Eliminación diana Adición ADN ADN polimerasa
circular. técnicamente
circular
Posteriormente, sencillo, y capaz
la acción conjunta de detectar
del ADN mutaciones en
polimerasa12 y el presencia de una
molde de ADN gran cantidad de
circular ADN original. Esta
desplazándose a técnica cuenta con
lo largo del la desventaja de
fragmento de requerir una gran
ADN inmovilizado cantidad de
11
López, M.; Mallorquín, P.; Vega, M. (2002). genera copias del muestra de ADN
Informe de Vigilancia Tecnológica Microarrays y ADN original de partida (100
Biochips de ADN. Genoma España. unidas entre sí nanogramos).
2.1.3. Siste PCR se ha venido
mas empleando de manera

de habitual en la
amplificación y
ampl
marcaje fluorescente
ificac
de muestras de ADN, e
ión
incluso se ha integrado
de la en sensores y
señal microarrays para
de minimizar el tiempo de
hibri ensayo necesario.
dació Además de la técnica
n del de PCR, existe toda
ADN una serie de métodos
de amplificación de la
El análisis de ADN por señal que pueden ser
medio de microarrays incorporados en el
requiere de la sistema de detección:
amplificación de la – La Amplificación
muestra y/o de la por círculo
señal para alcanzar rodante o Rolling
una sensibilidad Circle Amplification
apropiada, si bien es es una técnica de
cierto que la mayoría
de los sistemas de
A
amplificación realizan
ambas tareas. A dición oligos marcados Eliminación AD
pesar del tiempo que Fig. 1. Amplificación por
requiere, la técnica de
16
APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA

ó
círculo rodante. n
Fuente: Campàs, M., Katakis, I. (2004). DNA biochip A
arraying, detection and amplification strategies. Trends in d
i
analytical chemistry. Vol. 23(1): 49-62.
c
i
ó
n

d
e

s
o C
12
Las ADN polimerasas son las enzimas que realizan la n u
replicación del ADN. d a
a n
– La amplificación s t
hibridaciones
mediante ADN i
simultáneas. Este f
ramificado es
tipo de ADN i
otro de los Lisado de célula para
c
requiere ciertas obtener ARNm
métodos a
características como c
empleados para
son su i
aumentar la señal
ó
homogeneidad,
de la hibridación, n
uniformidad, y el
que en este caso
control de la H
emplea ADN i d
composición y e
ramificado13 o b
tamaño de la r l
hiperpolimérico,
longitud de sus i
que debido a sus d
fragmentos. A
ramificaciones a
R
c
puede realizar i
N
m

S
C M
u
é a
s
l r
u t
c
l r
a
a a
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a e
i
s o
s l
o u
n m
d i
a n
s i
s
c
e
A n
D t
N e
r
a
m
Fig. 2. Amplificación por ADN ramificado.
i
Fuente: Genospectra (http://www.genospectra.com).
f
i
c mediante
a
– La amplificación de nanopartículas
d
o la señal de dendríticas está
hibridación basada en el uso

17
APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA

de nanopartículas
de oro activadas oligonucleótidos
con nucleótidos, que hibridan con
como las la diana una vez
empleadas en los que ésta ha
métodos hibridado con la
piezoeléctricos. sonda
Estas inmovilizada.
nanopartículas Empleando el
contienen tamaño apropiado
fragmentos de de partícula se
pueden conseguir
sensibilidades de
detección muy
elevadas.

13
bDNA (branched DNA o ADN ramificado): el ADN
ramificado contiene múltiples cadenas ramificadas
en forma de árbol y cada una de estas ramas
constituye un sitio de hibridización con una sonda
marcada con una enzima, que reacciona con un
sustrato que permite la demostración colorimétrica o
quimioluminiscente.

18
Nanopartícula
unida a ADN diana
oligonucleótido

Fig. 3. Amplificación mediante nanopartículas dendríticas.


Fuente: Fritzsche, W. & Taton, A. (2003) Metal nanoparticles as labels for heterogeneous, chip-based DNA detection.
Nanotechnology 14, R63-R73.

– El método de amplificación de la Tiramida o


marcaje indirecto que consigue una
TSA (Tyramide Signal Amplification) consiste en
amplificación de la señal hasta 100 veces
una combinación de tres pasos que comienzan
mayor que las técnicas directas de marcaje con
en el marcaje de la molécula diana con un
fluorescencia, sin incrementar el ruido de
anticuerpo unido a peroxidasa o estreptavidina.
fondo. A pesar de ser una técnica laboriosa, la
Tras la hibridación a la sonda, se añaden
amplificación con Tiramida compite con las
múltiples derivados de tiramida marcados con
tecnologías actuales de amplificación por PCR14.
biotina o agentes fluorescentes, que son
Sin embargo, los análisis comparativos son
activados por la enzima peroxidasa, liberando
complicados debido a la variabilidad existente
finalmente radicales de tiramida que emiten
en la eficiencia del marcaje15.
una señal detectable. Este es un método de

Peroxidasa
H2O2

Estreptavidina
Biotina

ADN

Fig. 4. Amplificación de la Tiramida.


Fuente: Tyramide Signal Amplification (TSA) Technology, Molecular Probes, Invitrogen detection technologies
(http://probes.invitrogen.com/lit/catalog/2/sections/4021.html).

– La amplificación de la señal por medio de


donde la sonda está inmovilizada. Existen dos
liposomas funcionalizados se puede emplear
formas de conseguir la transferencia de
en las técnicas de detección electroquímica de
electrones, mediante la activación de los
la hibridación. Este sistema está basado en la
oligonucleótidos cargados negativamente, o
inhibición de la transferencia de electrones
bien mediante la funcionalización de los
entre la sonda y la superficie del electrodo
liposomas con biotina.

14
Càmpas, M.; Katakis, I. (2004). DNA biochip arraying, detection and amplification strategies. Trends in analytical
chemistry Vol. 23 (1): 49-62.
15
Tyramide Signal Amplification (TSA) Technology, Molecular Probes, Invitrogen detection technologies
(http://probes.invitrogen.com/handbook/sections/0602.html).

1.1. Tipos de microarrays de ADN


mecanismos implicados en la resistencia de
Los microarrays de ADN surgieron de la necesidad
patógenos a ciertos agentes antimicrobianos18.
de analizar la ingente cantidad de información
Por último, el uso de microarrays de ADN para
surgida de los grandes proyectos de secuenciación
el análisis de los perfiles de expresión génica en
de genomas desarrollados en los últimos años16. Por
procesos tumorales, ha posibilitado elaborar
tanto, las principales aplicaciones de los microarrays
para ciertos tipos de cáncer una clasificación de
de ADN se centraron inicialmente en el análisis de la
los tumores que ha permitido un diagnóstico y
expresión génica y el diagnóstico genético, basados
pronóstico más preciso que el obtenido
en la búsqueda de mutaciones o polimorfismos de
mediante otras técnicas moleculares.
un solo nucleótido o SNP17. Los nuevos desarrollos
tecnológicos han permitido ampliar estas • Las estrategias de farmacogenética y
aplicaciones hacia nuevas áreas de interés como la farmacogenómica19 constituyen otras de las
farmacogenómica, así como la integración de los áreas de aplicación de los microarrays de ADN.
microarrays de ADN en el proceso de La combinación de los datos obtenidos a partir
descubrimiento e identificación de fármacos. de la identificación de SNPs, junto con la
información obtenida del estudio de perfiles de
• El área de diagnóstico molecular mediante expresión génica, permite establecer una
microarrays de ADN posee entre sus principales correlación entre el genotipo y el fenotipo de un
aplicaciones el cribado genético de mutaciones determinado individuo. El resultado de esta
o polimorfismos relacionadas con enfermedades combinación está resultando de enorme
mediante técnicas de resecuenciación del ADN. importancia para la identificación de genes que
Por otra parte, la identificación de puedan constituir nuevas dianas terapéuticas.
microorganismos patógenos (virus, bacterias,
hongos o protozoos) mediante microarrays de • El proceso de descubrimiento y desarrollo
oligos que contengan secuencias de ARN de fármacos se ha beneficiado del uso de
ribosomal de dichos microorganismos es de herramientas genómicas de alto rendimiento
utilidad en el diagnóstico de patologías como los microarrays de ADN, que hacen
infecciosas. Asimismo, tanto los análisis de posible el análisis de la expresión génica en
SNPs como de expresión génica mediante miles de muestras simultáneamente. El diseño
microarrays de ADN permitirían identificar los y estratificación de los ensayos clínicos en
función del genotipo es otra de las aplicaciones
que los microarrays de ADN han aportado a la
industria farmacéutica.

16
The Sanger Institute: Human Genome Project (http://www.sanger.ac.uk/HGP).
The Institute for Genomic Research, TIGR (http://www.tigr.org/tdb).
17
SNP: Single Nucleotide Polymorphism.
18
Doménech-Sánchez, A. & Vila, J. (2004). Fundamento, tipos y aplicaciones de los arrays de ADN en la microbiología
médica. Enferm. Infecc. Microbiol. Clin. 22(1):46-54.
Bryant, P. A., et al. (2004). Chips with everything: DNA microarrays in infectious diseases. Lancet Infect. Dis. 4:100-111.
19
Farmacogenética: disciplina que se ocupa de estudiar las diferentes respuestas de los individuos frente a los fármacos
basándose en los patrones de variabilidad genética de cada paciente.
Farmacogenómica: término más amplio que persigue buscar genes candidatos de respuesta a determinados fármacos o
personalizar medicamentos empleando herramientas genómicas.
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Áre Aplicaciones Técnicas


as
Cribado genético Resecuenciación

Detección de secuencias de ADN


Identificación de patógenos
procedentes de patógenos
Diagnóst
ico Resistencia a fármacos de Genotipado de SNPs
molecula microorganismos infecciosos Análisis de la expresión génica
r
Diagnóstico y pronóstico oncológico Análisis de la expresión génica

Farmacogenética y
Farmacogenómica Respuesta a fármacos Genotipado de SNPs
Análisis de la expresión génica
Identificación de genes Genotipado de SNPs
Diagnóstico predictivo Genotipado de SNPs
Resecuenciación

Descubrimiento y
desarrollo de fármacos Diseño y estratificación de ensayos
Genotipado de SNPs
clínicos
Cribado de fármacos Análisis de la expresión génica

Tabla 4. Aplicaciones de los microarrays de ADN en salud humana.


Fuente: Elaboración propia.

A continuación se describen las principales técnicas genómicas que emplean los diferentes microarrays de ADN
en función del objetivo que se persiga:

2.2.1. Resecuenciación génica fragmento de ADN a analizar se divide en


fragmentos de entre 200 y 600 nucleótidos, y
El descubrimiento de genes o la identificación
posteriormente se marca e hibrida con las sondas
mediante secuenciación de determinadas
inmovilizadas. Al detectar la localización de la
secuencias de ADN, requiere arrays con sondas
hibridación mediante técnicas de análisis y
que incluyan todas las posibles combinaciones de
procesamiento de las señales, se puede identificar
nucleótidos para una determinada longitud. El
la secuencia total del fragmento de ADN.

La resecuenciación es una las últimas


pone en contacto con las sondas inmovilizadas en
aplicaciones de los microarrays de ADN, que
el microarray. Los fragmentos de ADN que
permite la identificación de mutaciones y SNPs en
contengan una secuencia complementaria
el genoma a partir de una secuencia conocida.
hibridarán únicamente con una de las cuatro
Para cada base nucleotídica de una secuencia se
sondas, dando lugar a una señal fluorescente20.
diseñan cuatro sondas que difieren entre sí en un
La principal ventaja de esta técnica consiste en
nucleótido (A,T,G,C) generalmente en su posición
que permite conocer la secuencia de fragmentos
central. Posteriormente se marca el ADN de la
de ADN de hasta 30 Kb de longitud.
muestra mediante reactivos fluorescentes, y se
Fig. 5. Resecuenciación mediante microarrays de ADN.
Fuente: Cutler, DJ, et al. (2001). High-throughput variation detection and genotyping using microarrays.
Genome Res. 11(11):1913-25.

2.2.2. Análisis de la expresión niveles de proteínas que se producen durante un


génica estado patológico o en una determinada situación
metabólica.
La expresión génica es el proceso por medio del
cual la información codificada en el ADN se El análisis de la expresión génica mediante
transforma en las proteínas necesarias para el microarrays de ADN requiere realizar previamente
desarrollo y funcionamiento de la célula. Este la copia del ARNm a ADN complementario
proceso tiene lugar por medio de una molécula mediante un proceso de transcripción inversa.
intermediaria que transmite la información
Este ADN copia (ADNc) posee una mayor
genética denominada ARN mensajero (ARNm).
estabilidad que el ARNm y además permite la
Una de las principales aplicaciones de los
adición de marcadores para su detección21. Las
microarrays de ADN es la determinación del perfil
moléculas marcadas de ANDc se hibridan a
de expresión, es decir la cuantificación relativa de
microarrays que contienen sondas de ADN
los ARN transcritos, mediante la comparación de
específicas para genes concretos. La señal que
los ARNm aislados de dos muestras diferentes.
emite el ADNc será indicativa de la presencia de
Por tanto, los microarrays de ADN proporcionan
expresión génica, que también puede ser
indirectamente información de los distintos
cuantificada.

20
CustomSeq™ Resequencing Arrays, Affymetrix (http://www.affymetrix.com/products/arrays/specific/custom_seq.affx).
21
López, M.; Mallorquín, P.; Vega, M. (2001). Informe Sectorial de Vigilancia Tecnológica sobre Microarrays y Biochips de
ADN. Genoma España.
Tejido sano
Tejido enfermo Interpretación
Muestra A
Muestra B
A>B

B>A

A=B

Extracción
ARNm

Combinación
A B
de ambas señales
fluorescentes
ADNc marcado
con sondas
fluorescentes

Hibridación con ADN Emisión


inmovilizado de fluorescencia
Incidencia luz
fluorescente

Fig. 6. Análisis de la expresión génica mediante microarrays de ADN.


Fuente: Institute for Mikrobiology and Genetics, Georg-August-University of Göttingen, Functional Genomics Group.
(http://wwwuser.gwdg.de/~aehrenr/arrays/c_arrays.html).

El perfil de expresión génica de una célula No obstante, una de las aplicaciones más
proporciona información sobre su fenotipo y su atrayentes es el empleo de microarrays de
respuesta al medio (estado metabólico, ciclo expresión génica en clínica. La empresa
celular, respuesta a condiciones de estrés, holandesa Agendia22 ha desarrollado microarrays
presencia de toxinas o microorganismos de expresión génica que permiten predecir el
patógenos). La medida de la expresión génica es riesgo de sufrir metástasis en pacientes con cáncer
una importante herramienta para estudiar los de mama, así como arrays de expresión que
mecanismos de regulación, rutas bioquímicas y facilitan la identificación de tumores primarios. La
funciones celulares. empresa californiana Genomic Health23 posee
entre sus productos un microarray de expresión
Las aplicaciones de los microarrays de expresión génica que cuantifica la probabilidad de recurrencia
génica son diversas, y actualmente el número de en pacientes con cáncer de mama, e incluso
productos dirigidos a la industria farmacéutica se proporciona información acerca de las terapias más
ha multiplicado considerablemente (ver Anexo I). efectivas para el paciente.

Aplicaciones de los microarrays de expresión génica

Identificación de genes involucrados en procesos patológicos, fisiológicos y de desarrollo.

Caracterización de tumores.

Estudio de procesos de regulación génica.

Diagnóstico mediante la identificación de patrones de expresión relacionados con diferentes estados patológicos.

Identificación de dianas terapéuticas en el proceso de desarrollo de fármacos mediante la comparación de los genes expresados en
tejido normal y tejido enfermo.

22
MammaPrint®, CupPrint™ (Agendia, BV; http://www.agendia.com).
23
Oncotype DX™ (Genomic Health, Inc.; http://www.genomichealth.com/oncotype/hcphome.aspx).
2.2.3. Genotipado de SNPs
y de experimentos de secuenciación de
fragmentos concretos de ADN. En la actualidad
Menos del 0,1% del genoma humano presenta
varias compañías biotecnológicas disponen de
variaciones entre los distintos individuos, siendo
tests farmacogenómicos que permiten la
las formas más frecuentes de variación los SNPs o
identificación de polimorfismos relacionados con el
polimorfismos de una sola base24, que consisten
metabolismo de fármacos. Los principales tests
en sustituciones de una base por otra. La mayoría
toxicogenómicos se centran en el genotipado de
de los SNPs conocidos hasta hace unos años
genes de enzimas de la familia del citocromo
habían sido identificados a partir de proyectos de
p450, relacionada con la toxicidad de un gran
secuenciación como el Proyecto Genoma Humano,
número de fármacos25.

Fig. 7. Microarray de análisis farmacogenómico AmpliChip CYP450. Fuente: Roche Group, AmpliChip CYP450 Test
(http://www.roche-diagnostics.com/products_services/amplichip_cyp450.html).

2.2.4. Hibridación genómica Un ejemplo de este tipo de microarrays de


comparada hibridación genómica comparada es el
Genosensor System de la compañía Vysis26 que
Los microarrays de hibridación genómica permite establecer correlaciones entre el número
comparada (CGH Arrays) son herramientas de de copias de un gen y una determinada
análisis genómico de escaneado global que se enfermedad. Éste es un sistema que por el
emplean para detectar la presencia de ganancias momento sólo se emplea en investigación en
(duplicación o amplificación) o pérdidas (deleción laboratorios y aún no se ha empleado con fines
o nulisomía) de segmentos del genoma. Su diagnósticos. En la actualidad, el Centro
aplicación en el campo de la oncología incluye la Nacional de Investigaciones Oncológicas
detección de nuevas amplificaciones genómicas (CNIO) está poniendo en marcha una plataforma
asociadas a tumores humanos y murinos, la para la producción de microarrays de hibridación
definición en detalle de regiones comúnmente genómica comparada que posean una cobertura
amplificadas (amplicones), y la detección de completa de los genomas humano y murino27.
deleciones asociadas a tumores.

24
Las diferencias entre las secuencias de ADN de los diferentes individuos y especies se deben primordialmente a
mutaciones que alteran una de las cuatro letras del código ACGT. Tales cambios de una sola letra de posición variable son
los SNP (Single Nucleotide Polymorphism). Además, se conocen otros sistemas de reordenamiento genético, tales como
inserciones o deleciones de fragmentos de ADN.
25
Prometheus Laboratories Inc., PRO-PredictRx TPMT (http://www.prometheuslabs.com).
Roche Diagnostics, con tecnología de Affymetrix (http://www.roche-diagnostics.com).
GE Healthcare, CodeLink P450 Bioarrays (http://www.gehealthcare.com).
Jurilab, DrugMEtTM Genotyping Test (http://www.jurilab.com).
Roche Group, AmpliChip CYP450 Test (http://www.roche-diagnostics.com).
TM Bioscience Corp., Tag-ItTM Mutation Detection Kits (http://www.tmbioscience.com).
26
Vysis (http://www.vysis.com).
27
CNIO, Investigación de Transferencia en Cáncer: del Laboratorio a la Clínica
(http://www.cnio.es/es/news/transferencia.htm).
2. Microarrays de proteínas
Los microarrays y biochips de ADN se han
contenida en el proteoma. El proteoma es el
consolidado como una herramienta fundamental
conjunto de proteínas expresadas por un tejido o
para el análisis de la expresión génica a nivel
por una célula en un momento determinado. Por
genómico. Sin embargo, la determinación de la
tanto, la proteómica es la disciplina que estudia
cantidad de ARNm mediante microarrays de ADN
globalmente la expresión génica a nivel de las
no proporciona la información suficiente sobre las
proteínas, aglutinando proteómica comparativa,
proteínas que se traducen a partir de esta
funcional y estructural.
molécula. Esto es debido a que las proteínas
sufren toda una serie de modificaciones post-
Los microarrays de proteínas son de gran
traduccionales a lo largo de su proceso de
utilidad en el análisis proteómico funcional, y
síntesis, que consisten fundamentalmente en
consisten en chips de proteínas inmovilizadas en
procesamientos proteolíticos, glicosilaciones 28, y
una posición concreta sobre una superficie sólida,
formación de complejos proteicos. Por otra parte,
dispuestas de forma similar a como se disponen
las proteínas han de plegarse correctamente con
las sondas en los microarrays de ADN. A la hora
el fin de ser totalmente funcionales.
de construir un microarray de proteínas es muy
importante plantearse una serie de cuestiones
Para completar el estudio de las funciones de las
previas, al igual que sucedía con el diseño del
proteínas se ha de recurrir a la información
microarray de ADN:

Factores de relevancia en el diseño de microarray de proteínas

Naturaleza de la superficie sobre la cual inmovilizar (soporte).

Proteínas a inmovilizar.

Método de inmovilización.

Formato del microarray.

Agente de captura (en el caso de microarray de detección).

Método de detección a emplear.

28
Glicosilación: proceso químico por el que se añaden cadenas de azúcares a una proteína.
Cada una de estas cuestiones lleva asociada una tecnología concreta, que al combinarse permiten la
generación de microarrays de proteínas. En la siguiente figura se muestran las tecnologías asociadas a
los microarrays de proteínas:

Tecnología de Moléculas de
Superficies Detección Aplicaciones
producción captura

Unión Proteínas fusión


Impresión por contacto
no covalente Fluorescencia
Electrostática Anticuerpos Diagnóstico
Reconocimiento
molecular
Hidrofóbica

Aptómeros
Cribado de fármacos
Unión covalente
Litografía Affibodies
Radioactividad

Espectrometría de
masas
Fig. 8. Tecnologías implicadas en la producción de microarrays.
Fuente: Ojos, T. & Bachmann, J. (2003). Business Briefing: Future Drug Discovery. 1-4.

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