Determinación de la actividad enzimática

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO FACULTAD DE INGENIERÍA
LABORATORIO DE ORGANIZACIÓN Y FUNCIÓN CELULAR Escuela de Ingeniería de Materiales
PRACTICA N° 05
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA:
I.- OBJETIVO:
1.1 Determinar y reconocer la actividad enzimática de la Peroxidasa en tejido animal y
vegetal.
1.2 Determinar y reconocer la actividad enzimática del Lactato deshidrogenasa en
Saccharomyces, cerevisiae “Levadura”.
II. FUNDAMENTO TEÓRICO:
EN
Son proteínas con actividad biocataliticas, producidos por las células vivientes
2.1 IMPORTANCIA BIOLÓGICA
 Facilitan la transformación química.
 Se utilizan en la industria para la FERMENTACIÓN, como las uvas que al
fermentarse se convierte en cachina, vinagre, vino, etc.
MICROSCOPIA DE LUZ PÁGINA 1

 Algunas de las enzimas se utilizan en el diagnostico de tumores cancerígenos,
como la FOSFATASA ACIDA (enzima) en el diagnóstico de tumores
cancerígenos a la próstata.
FIG. N°1: CÉLULA
2.2 ENERGÍA DE ACTIVACIÓN (EA)
Toda reacción bioquímica (anabólica y catabólica) requieren para iniciarse que el
sustrato supere cierta barrera de energía llamada ENERGÍA DE ACTIVACIÓN, la
que se define como la mínima cantidad de energía que debemos suministrar a un
sustrato para transformarlo en producto.
 RX BIOQUIMICA:

FIG. N°2: RX BIOQUÍMICA
La energía de activación en química y biología es la energía mínima que necesita
un sistema antes de poder iniciar un determinado proceso. La energía de activación
suele utilizarse para denominar la energía mínima necesaria para que se produzca
una reacción química dada. Para que ocurra una reacción entre dos moléculas, éstas
deben colisionar en la orientación correcta y poseer una cantidad de energía
mínima. A medida que las moléculas se aproximan, sus nubes de electrones se
repelen. Para superar esto se requiere energía (energía de activación), que proviene
de la energía térmica del sistema, es decir la suma de la energía traslacional,
vibracional, y rotacional de cada molécula. Si la energía es suficiente, se vence la
repulsión y las moléculas se aproximan lo suficiente para que se produzca una
reordenación de sus enlaces. La ecuación de Arrhenius proporciona una expresión
cuantitativa para la relación entre la energía de activación y la velocidad a la que se
produce la reacción. El estudio de las velocidades de reacción se denomina cinética
química.
Un ejemplo particular es el que se da en la combustión de una sustancia. Por sí
solos el combustible y el comburente no producen fuego, es necesario un primer
aporte de energía para iniciar la combustión, que luego es auto sostenida. El aporte
de una pequeña cantidad de calor puede bastar para que se desencadene una
combustión, haciendo la energía calórica aportada el papel de energía de activación,
y por eso a veces a la energía de activación se la llama entalpía de activación.
Según su origen, este primer aporte de energía se clasifica como:
 químico: La energía química exotérmica desprende calor, que puede ser
empleado como fuente de ignición.

 eléctrico: El paso de una corriente eléctrica o un chispazo produce calor.
 nuclear: La fusión y la fisión nucleares producen calor.
 mecánico: Por compresión o fricción, la fuerza mecánica de dos cuerpos
puede producir calor.
Las siguientes representaciones gráficas manifiestan diferencias acerca de cómo la
presencia de un catalizador (ejemplo una enzima en un proceso biológico)
disminuye la energía de activación debido a su complementariedad y por tanto
provoca una disminución en el tiempo requerido para que se forme el producto, o
sea, aumenta la velocidad.
2.3. ESTRUCTURA ENZIMÁTICA:
1. CUERPO: Formado por aminoácidos estructurales.
2. SITIO ACTIVO: Es el lugar de la enzima donde se une el sustrato y presenta
un grupo de aminoácidos que son de dos tipos.
a) Aminoácidos de Fijación: Reconocen al sustrato y forma con el sustrato enlaces
débiles (puentes de hidrogeno).
b) Aminoácidos Catalíticos: Transforman el sustrato en productos.

FIG. N°3: ENZIMA
 Las enzimas debido a su naturaleza proteica se desnaturalizan
fácilmente, perdiendo así su capacidad catalítica, cuando cambia la
temperatura y el PH.
2.4 PRENZIMAS O ZIMÓGENOS.
Son proteína sin actividad catalina, pero son precursores de enzimas, para ello
necesita la acción de un inductor, el zimógeno es fraccionado hasta enzima activa.
FIG. N° 4: ZIMÓGENOS Y ENZIMA ACTIVA
2.5 LA CATALASA:
Es una enzima que se encuentra en organismos vivos y cataliza la descomposición
del peróxido de hidrógeno(H202) en oxígeno y agua. El peróxido de hidrógeno es
un residuo del metabolismo celular de muchos organismos vivos y tiene entre
otras una función protectora contra microorganismos patógenos, principalmente
anaerobios. Esta función la efectúa esta enzima que cataliza su descomposición en

agua y oxígeno. Además la catalasa se usa en la industria textil para la eliminación
del peróxido de hidrógeno, así como en menor medida se emplea en la limpieza de
lentes de contacto que se han esterilizado en una solución de peróxido de
hidrógeno.
2.6 ÁCIDO LÁCTICO
El ácido láctico, o su forma ionizada, el lactato (del lat. lac, lactis, leche), también
conocido por su nomenclatura oficial ácido 2-hidroxi-propanoico o ácido α-hidroxi-
propanoico, es un compuesto químico que desempeña importantes roles en varios
procesos bioquímicos, como la fermentación láctica. Es un ácido carboxílico, con
un grupo hidroxilo en el carbono adyacente al grupo carboxilo, lo que lo convierte
en un ácido α-hidroxílico (AHA) de fórmula H3C-CH(OH)-COOH (C3H6O3). En
solución puede perder el hidrógeno unido al grupo carboxilo y convertirse en el
anión lactato.
El ácido láctico es quiral, por lo que se pueden encontrar
dos enantiómeros (isómeros ópticos). Uno es el dextrógiro ácido D-(+)-láctico o d-
ácido láctico (en este caso, el ácido (R)-láctico); el otro es el levógiro ácido L-(-)-
láctico o ℓ-ácido láctico (en este caso, ácido (S)-láctico), que es el que tiene
importancia biológica. La mezcla racémica(cantidades idénticas de estos isómeros)
se llama d, ℓ-ácido láctico.
 IMPORTANCIA BIOLÓGICA
El ácido ℓ-láctico se produce a partir del ácido pirúvico a través de
la enzima lactato deshidrogenasa (LDH) en procesos de fermentación. El
lactato se produce continuamente en el metabolismo y sobre todo durante el

ejercicio, pero no aumenta su concentración hasta que el índice de
producción no supera al de eliminación. Este depende de varios factores,
como los transportadores monos carboxilatos, concentración de LDH y
capacidad oxidativa en los tejidos. La concentración de lactatos en la sangre
usualmente es de 1 o 2 mmol/l en reposo, pero puede aumentar hasta
20 mmol/l durante un esfuerzo intenso. Se debe considerar que, a pH
fisiológico en el cuerpo humano, es decir 7.35, se encuentra solo en su
forma disociada, es decir, como lactato y no como ácido.
El aumento de la concentración de lactatos ocurre generalmente cuando la
demanda de energía en tejidos (principalmente musculares) sobrepasa la
disponibilidad de oxígeno en sangre. Bajo estas condiciones la piruvato
deshidrogenasa no alcanza a convertir el piruvato Acetil-CoA lo
suficientemente rápido y el piruvato comienza a acumularse. Esto
generalmente inhibiría la glucólisis y reduciría la producción de Adenosín
trifosfato (el ATP sirve para acumular energía), si no fuera porque la lactato
deshidrogenasa reduce el piruvato a lactato:
Piruvato + NAD + H+ → lactato + NAD+
La función de la producción de lactato es oxidar NADH + H para regenerar
la nicotina mida adenina di nucleótido (NAD+) necesaria para la glucólisis,
y por tanto para que continúe la producción de ATP.
El lactato producido sale de la célula muscular y circula por el torrente
sanguíneo hasta el hígado, dónde se vuelve a transformar en glucosa
por gluconeogénesis. Al ciclo que comprende la glicólisis en la célula

muscular y su reciclaje por gluconeogénesis en el hígado se le conoce
como ciclo de Cori.
El hígado y el corazón tienen la facultad de oxidar el lactato de la sangre
convirtiéndolo de nuevo a piruvato.
La fermentación de ácido láctico también la producen las
bacterias Lactobacillus. Estas bacterias pueden encontrarse en la boca, y
pueden ser las responsables del progreso de la caries previamente iniciada
por otras bacterias.
 EN MEDICINA
En condiciones normales, el valor de referencia para el lactato en sangre es
inferior a 2 mmol/L. Durante el ejercicio, la concentración de lactato puede
incrementarse desde un nivel medio de 0.9 mmol/L hasta 12 mmol/L;
durante la hipoxia tisular se aumenta la producción de este y es un
marcador de gravedad. (Rev Med Inst Mex Seguro Soc. 2015;53(3):316-21)
En medicina es uno de los compuestos de la solución láctica de Ringer, que
es una solución que se inyecta intravenosamente a las personas cuando han
sufrido una pérdida de sangre a causa de
un traumatismo, cirugía o quemadura. La solución está compuesta por
129 mmol/L de Na, 109 mmol/L de cloro y 28 mmol/L de L-lactato. Es una
solución que se usa alternativamente a la salina fisiológica (0.9%) para
recuperar volumen. La diferencia de iones fuertes hace que
el hartman (solución láctica de Ringer) sea utilizado por algunos como
terapia en la hipovolemia. No obstante, por tener menos tonicidad
(osmolaridad) que la solución salina, algunos prefieren esta. El efecto sobre

el equilibrio ácido-base de la salina será promover acidosis (por el cloro),
mientras el efecto del hartman será más alcalinizante por la diferencia de
iones fuertes y por el ácido láctico.
III.- EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS.
3.1.- Materiales
 Tubos de ensayos.
 Pipeta graduada.
 Gradilla
 Agua destilada
 Mechero
 Hígado.
 Papa.
 Manzana.
3.2.- Reactivos
 Ringer Mamífero.
 Levadura Muerta.
 Levadura Viva.
 Azul de Metileno.
 Vaselina.
 Agua Oxigenada.
IV.- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
 ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA PEROXIDASA

TUBO N° 1 TUBO N° 2 TUBO N° 3

 Se corta el hígado con la navaja  Se pela y corta con la navaja un  Se corta con la navaja un
un trozo pequeño. trozo pequeño de papa cruda. trozo pequeño de manzana.
 En un tubo de ensayo se inserta el  En un tubo de ensayo se inserta el  En un tubo de ensayo se
trozo de hígado. trozo de la papa pelada. inserta el trozo de la manzana.
 Se agrega unos dos ml aprox. De  Se agrega unos dos ml aprox. De  Se agrega unos dos ml aprox.
agua oxigenada al tubo de agua oxigenada al tubo de ensayo. de agua oxigenada al tubo de
ensayo.  Se toma unos minutos. ensayo.
 Se toma unos minutos.  Segundo en producir Oxigeno.  Se toma unos minutos.
 Primero en producir Oxigeno  Algo mínimo en producir

oxigeno
- Se necesita tres tubos de ensayos: el primero para el Hígado, el segundo
para la papa y el tercero para la manzana.
 ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LACTATO - DESHIDROGENASA
- Se necesita tres tubos: el primero lleva la levadura viva, el segundo lleva
levadura muerta y el tercero lleva levadura viva.
TUBO N°1 TUBO N°2 TUBO N°3

 Se pipetea dos ml de levadura  Se pipetea dos ml de levadura  Se pipetea dos ml de
viva y se agrega al tubo N°1. muerta y se agrega al tubo N°2. levadura viva y se agrega al
 También agregamos un ml de  . También agregamos un ml de tubo N°3.
ringer mamífero. . ringer mamífero. .  Se agrega al tubo de ensayo
 Se agrega al tubo de ensayo dos  Se agrega al tubo de ensayo dos dos ml de azul de metileno.
ml de azul de metileno. ml de azul de metileno.  Por ultimo agregamos

 Por ultimo agregamos vaselina  Por ultimo agregamos vaselina vaselina para no entre
para no entre oxígeno al tubo de para no entre oxígeno al tubo de oxígeno al tubo de ensayo.
ensayo. ensayo.  Después de un minuto se
 Después de unos diez segundos  Después de un tiempo aprecia de verde a blanco
se aprecia de verde agua a determinado de color verde agua lechoso.
blanco leche. no hay cambio de color.
V.- RESULTADOS
 A. RESULTADOS DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA
PEROXIDASA

FIG. N°5: MUESTRA DE LA PAPA Y MANZANA
FIG. N°6: RESULTADOS FINALES DE LA PRÁCTICA

FIG. N°7: MUESTRA DEL HÍGADO
FIG. N°8: MUESTRA DE LA PAPA

PRODUCCIÓN
DE OXIGENO
MICROSCOPIA DE LUZ PÁGINA 13 EN GRAN
CANTIDAD
PRODUCCIÓN
DE OXIGENO
EN MÍNIMA
CANTIDAD
FIG. N°9: MUESTRA DE LA MANZANA

 RESULTADOS DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LACTATO -
DESHIDROGENASA
TUBO TUBO
TUBO
N°2 N°3
N°1
FIG. N° 10: MUESTRAS FINALES


FIG. N°11: TUBO DE ENSAYO N°3
SE PUEDE
APRECIAR
EL CAMBIO
DE COLOR
FIG. N° 12: TUBO DE ENSAYO N°2
SE PUEDE
APRECIAR
EL CAMBIO
DE COLOR
FIG. N°13: TUBO DE ENSAYO N° 1
VI.- CONCLUSIONES
6.1 Los agentes precipitantes inhiben la actividad enzimática por desnaturalización
de la enzima.
6.2 La velocidad de una reacción enzimática depende de varios factores. Entre éstos
está el pH. Cada enzima tiene un rango de pH en el que su actividad enzimática es
óptima. Fuera de este rango la enzima por ser una proteína empieza a

desnaturalizarse por la protonación o desprotonación de sus aminoácidos
constituyentes.
6.3 La temperatura es otro factor importante en la actividad enzimática. Se puede
decir que a mayor temperatura aumenta la velocidad de la reacción hasta que llega
un punto en el que la velocidad disminuye con el aumento en el calor.
VII.- BIBLIOGRAFÍA
[1] Acido Láctico. Fecha y hora de búsqueda: (15/06/16) 10:14 a.m.
Disponible en:
https://es.wikipedia.org/wiki/%C3%81cido_l%C3%A1ctico
[2] Enzimas. Fecha y hora de búsqueda: (17/06/16) 11:30 a.m.
Disponible en:
http://www.wilkipedia.org/enzima.hpt
[3] Catalasa. Fecha y hora de búsqueda: (17/06/16) 12:30 a.m.
Disponible en:
http://html.wikipedia.com/catalasa_5.html
[4] Energía de Activación. Fecha y hora de búsqueda: (17/06/16) 01:30 p.m.
Disponible en:
https://es.wikipedia.org/wiki/Energ%C3%ADa_de_activaci%C3%B3n

VII ANEXOS

FIG. N° 14: AZUL DE METILENO
FIG. N°15: AGUA OXIGENADA

FIG. N°16: MECHERO
FIG. N° 17: RINGER MAMÍFERO
FIG. N°18: HÍGADO, PAPA Y MANZANA

FIG. N°19: LEVADURA MUERTA Y VIVA

Determinación de la actividad enzimática

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LABORATORIO DE ORGANIZACIÓN Y FUNCIÓN CELULAR Escuela de Ingeniería de Materiales

DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA:

1.1 Determinar y reconocer la actividad enzimática de la Peroxidasa en tejido animal y

1.2 Determinar y reconocer la actividad enzimática del Lactato deshidrogenasa en

Saccharomyces, cerevisiae “Levadura”.

II. FUNDAMENTO TEÓRICO:

2.1 IMPORTANCIA BIOLÓGICA

 Facilitan la transformación química.

 Se utilizan en la industria para la FERMENTACIÓN, como las uvas que al

fermentarse se convierte en cachina, vinagre, vino, etc.

MICROSCOPIA DE LUZ PÁGINA 1

 Algunas de las enzimas se utilizan en el diagnostico de tumores cancerígenos,

como la FOSFATASA ACIDA (enzima) en el diagnóstico de tumores

FIG. N°1: CÉLULA

2.2 ENERGÍA DE ACTIVACIÓN (EA)

Toda reacción bioquímica (anabólica y catabólica) requieren para iniciarse que el

sustrato supere cierta barrera de energía llamada ENERGÍA DE ACTIVACIÓN, la

que se define como la mínima cantidad de energía que debemos suministrar a un

sustrato para transformarlo en producto.

MICROSCOPIA DE LUZ PÁGINA 2

FIG. N°2: RX BIOQUÍMICA

La energía de activación en química y biología es la energía mínima que necesita

un sistema antes de poder iniciar un determinado proceso. La energía de activación

deben colisionar en la orientación correcta y poseer una cantidad de energía

mínima. A medida que las moléculas se aproximan, sus nubes de electrones se

de la energía térmica del sistema, es decir la suma de la energía traslacional,

vibracional, y rotacional de cada molécula. Si la energía es suficiente, se vence la

repulsión y las moléculas se aproximan lo suficiente para que se produzca una

reordenación de sus enlaces. La ecuación de Arrhenius proporciona una expresión

cuantitativa para la relación entre la energía de activación y la velocidad a la que se

produce la reacción. El estudio de las velocidades de reacción se denomina cinética

Un ejemplo particular es el que se da en la combustión de una sustancia. Por sí

solos el combustible y el comburente no producen fuego, es necesario un primer

combustión, haciendo la energía calórica aportada el papel de energía de activación,

y por eso a veces a la energía de activación se la llama entalpía de activación.

Según su origen, este primer aporte de energía se clasifica como:

 químico: La energía química exotérmica desprende calor, que puede ser

empleado como fuente de ignición.

MICROSCOPIA DE LUZ PÁGINA 3

 eléctrico: El paso de una corriente eléctrica o un chispazo produce calor.

 nuclear: La fusión y la fisión nucleares producen calor.

 mecánico: Por compresión o fricción, la fuerza mecánica de dos cuerpos

puede producir calor.

Las siguientes representaciones gráficas manifiestan diferencias acerca de cómo la

presencia de un catalizador (ejemplo una enzima en un proceso biológico)

disminuye la energía de activación debido a su complementariedad y por tanto

provoca una disminución en el tiempo requerido para que se forme el producto, o

sea, aumenta la velocidad.

2. SITIO ACTIVO: Es el lugar de la enzima donde se une el sustrato y presenta

un grupo de aminoácidos que son de dos tipos.

a) Aminoácidos de Fijación: Reconocen al sustrato y forma con el sustrato enlaces

débiles (puentes de hidrogeno).

b) Aminoácidos Catalíticos: Transforman el sustrato en productos.

MICROSCOPIA DE LUZ PÁGINA 4

FIG. N°3: ENZIMA

 Las enzimas debido a su naturaleza proteica se desnaturalizan

fácilmente, perdiendo así su capacidad catalítica, cuando cambia la

2.4 PRENZIMAS O ZIMÓGENOS.

necesita la acción de un inductor, el zimógeno es fraccionado hasta enzima activa.

FIG. N° 4: ZIMÓGENOS Y ENZIMA ACTIVA

Es una enzima que se encuentra en organismos vivos y cataliza la descomposición