PRÁCTICA Nº 3

PREAPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO, MEDIOS SELECTIVOS

Y DIFERENCIALES
1 1 1 2
Vivas, E. 1120100 ; López, S. 111092 ; Ortiz, L. 112072 ; Victoria, J. 510567
1 2
Ingenieria Agronómica. Ingenieria Ambiental.
Universidad Nacional de Colombia – Sede Palmira

RESUMEN
Esta práctica se desarrollo en el curso de microbiología enfocada en la preparación de los medios de cultivos comúnmente utilizados para
la siembra y multiplicación de especies de interés microbianos. En este caso se realizo la preparación de cuatro medios de cultivo de
diferente naturalidad, por lo cual cada uno tuvo una finalidad y característica especifica. Se siguió las instrucciones del profesor, lo que
conllevó a un adecuado aprendizaje y preparación de los medios. Se realizaron cálculos, se siguió recomendaciones y se mantuvo las
normas de bioseguridad. Por tanto, es claro tener en cuenta que bien la preparación de medios de cultivos fue una tarea repetitiva, no se
pudo dejar de tener en cuenta la importancia de las normas de bioseguridad, los cálculos asertivos y las recomendaciones del fabricante y
maestro para la obtención de medios de cultivos apropiados para la siembra, esterilizados y en facultad para ser utilizado en la siembra
de microorganismos.

Palabras claves: nutrición, medio de cultivo, microorganismos, esterilidad.

INTRODUCCIÓN 500 de agua destilada

Un medio de cultivo apropiado para el crecimiento de 4 estufas eléctrica
microorganismos debe contener los nutrientes esenciales; por 4 magnetos
ejemplo, para el aislamiento de bacterias la mayoría de los medios 4 frascos de vidrio de boca ancha de 500 mL
son ricos en proteínas o derivados como proteasas, peptonas, 1 PDA en polvo
péptidos o aminoácidos. 3 tipos de Agar
Los medios de cultivo solidos incluyen algún agente solidificante; el 1 balanza de precisión
primero que se utilizo en bacteriología fue la gelatina; sin embargo, 1 guante térmico
muchos microorganismos la hidrolizan y a la temperatura de 4 espátulas
incubación optima de un buen numero de bacterias (35 °C) se licua. 4 recipientes para pesaje
El segundo agente solidificante que se ha empleado es el agar, 1 mechero Bunsen
introducido por Robert Koch (1843-1910) y todavía hoy sigue 1 autoclave
siendo el agente solidificante mas utilizado. El agar se obtiene a 1 cámara de Flujo laminar
partir de algas marinas de la familia Rhodophyceae, que se 1 probetas de 500 mL
encuentra en el océano Pacifico, Indico y Mar de Japon, tiene Toallas desechables
características deseables como solubilidad en agua, resistencia a la
actividad de la mayoría de los microorganismos, fusión a 98 °C y Para la preparación de medios de cultivos se tuvo en cuenta el
solidificación entre 42 y 45 °C; tiene el inconveniente del precio número de cajas Petri y el número de tubos taparosca.
elevado, por lo que debe racionarse su uso. Cada agar y PDA estuvo compuesto por
Antes de 1930, la preparación de los medios de cultivo incluia la
incorporación y medición de cada uno de los componentes del
medio e incluso la preparación de algunos de ellos; por ejemplo, los -Infusión de patata……..….4,0 g.
extractos de carne. En la actualidad, la preparación de la mayoría (infusión de 200gr de patatas)
de los medios de uso rutinario es un proceso mucho mas simple, PDA
-D (+) – glucosa……….…20,0 g.
debido a que están disponibles comercialmente en forma de polvo -Agar –agar………………...5,0g.
deshidratados completos y solo hay que disolverlos en la cantidad
de agua indicada, ajustarles el pH, distribuirlos en tubos y -Extracto de levadura……..2,0 g.
1
esterilizarlos. -Peptona……………………5,0 g.
Los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes que, en Agar nutritivo -Cloruro de Sodio………….5,0 g.
concentraciones adecuadas y en condiciones físicas óptimas, -Agar………………………15,0 g.
permiten el crecimiento de los microorganismos. Estos medios son -Polvo “LAB – LEMCO”... 1,0 g.
esenciales en el Laboratorio de Microbiología por lo que un control
en su fabricación, preparación, conservación y uso, asegura la
-Peptona esencial……….10,0 g.
exactitud, confiabilidad y reproducibilidad de los resultados
-Lactosa…………………..10,0 g.
obtenidos.
Desoxicholat – -Cloruro de Sodio…………5,0 g.
En los laboratorios de microbiología se utilizan diferentes tipos de
Lactose – Agar -Citrato de Sodio................2,0 g.
medios de cultivo que pueden ser preparados en forma líquida o en
-Desoxilato de Sodio..........0,5 g.
forma sólida. Usualmente para preparar un medio sólido, se parte
-Rojo neutro...................0,033 g.
de un medio líquido al que se le añade un agente solidificante como
2 -Agar – agar…...…………12,5 g.
el agar, la gelatina o la sílicagel.

MATERIALES Y METODOLOGÍA.
20 cajas Petri estériles
20 tubos taparosca estériles

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 -Sulfato de Magnesio…….0,2 g. Desoxicholat – Lactose – gf ……………. 40 g
-Fosfato de Hidrogeno del Agar mLr …………. 300 mL
Amonio...............................1,0 g. 20 cajas c/u 15 mL g …………….. 12 g
Agar Citrato de -Fosfato dipotásico.............1,0 g. gf ……………. 24,2 g
Simmons -Citrato de Sodio…………..2,0 g. Agar Citrato de Simmons
mLr …………. 300 mL
-Cloruro de Sodio………….5,0 g. 20 cajas c/u 15 mL
g …………….. 7,26 g
-Bacto Agar……………….15,0 g.
-Azul de Bromo………......0,08 g. Esterilizados los medios de cultivo se apreció que presentan
características diferentes entre si.
Se realizo los cálculos que determino la cantidad de gramos que
requirió cada agar para la elaboración de cada medio de cultivo, se Medio de cultivo Característica
utilizó una espátula y diferente recipiente de pesaje para cada uno
de los medios, con lo que se evito una posible combinación de Se observo color amarillo opaco y en punto
PDA
ingredientes. de ebullición se apreció cristalino
Para los agares, con la ayuda de la probeta se saco 900 mL de
Se obtuvo un color anaranjado oscuro, por lo
agua destilada, los cuales se repartió en igual cantidad a los 3
Agar nutritivo general es más claro. Pero aun así permitió
frascos de vidrio. Luego cada frasco se dejo encima de cada una
ver atreves del frasco.
de las estufas, se activaron los sistemas de calor llevando cada
frasco con agua a 50 °C aprox., se introdujo un magneto por frasco, Desoxicholat – Fue de color marrón oscuro sin espuma con
e igualmente se activaron las revoluciones. Con ayuda del Lactose – Agar una mancha en la parte superior
recipiente para pesaje se vertió poco a poco la cantidad de gramos
correspondiente de agar a cada frasco hasta la dilución, se Agar Citrato de Se observo de un color verde oscuro, con
aumento la temperatura hasta 350 °C aprox. lo que ocasiono que Simmons: espuma.
cada agar llegara a punto de ebullición en menor tiempo, lo que
corroboro que se tuvo la homogenización y esterilización de los Pese a la diversidad de técnicas y medios de cultivos que se pudo
medios. Se bajo cada frasco de la estufa con el guante térmico utilizar para la práctica, se usaron medios listos para diluir, por
dejándolo reposar por un par de minutos sobre los mesones. Se practicidad y ahorro de tiempo en preparación.
hizo una especie de aislante con las toallas absorbentes entre los Indiferente de la procedencia de los medios de cultivo, se debió
frascos y los mesones, lo que evito que la temperatura del frasco mantener una adecuada manipulación de los implementos, el
entrara en contacto directo con la del mesón, y así una posible ambiente y los materiales con el fin de garantizar su total
ruptura. Se llevaron los frascos a esterilizar a la autoclave según las esterilización.
especificaciones del fabricante. Se dejo enfriar el medio de cultivo Al haber mezclado en las proporciones correctas todos los
hasta llegar una temperatura aproximada de 39 °C (temperatura ingredientes, se conformó una solución de contextura ideal para la
cachete) lo que permitió servir los medios a cada caja Petri (15 mL
alimentación de los microrganismos.
por c/u) en la cámara de flujo laminar. Servido los medios de cultivo
se dejo reposar hasta temperatura ambiente.
BIBLIOGRÁFIA.
A diferencia del agar, el PDA se preparo de manera similar excepto
por la activación del sistema de calor, además, solo se utilizo 6,3 g 1
Rodríguez Cavallini, Evelyn. Preparación de medios de cultivo.
de PDA que se diluyo en 160 mL de agua destilada. Con ayuda del
Bacteriología General: Principios y practicas de
mechero se sirvió el medio de cultivo a los tubos taparrosca (8 mL
laboratorio. 2001. p 116. [Consultado Abril, 27], disponible
por c/u), y se inclinaron (más o menos 15°) hasta que el medio se
en internet:
solidifico.
<http://books.google.com.co/books?id=vwB0fgirgN0C&pg=
PA117&lpg=PA117&dq=preparacion+de+medios+de+culti
vo&source=bl&ots=xXuiEZqewe&sig=yk7LyiLrZbKx0-
RESULTADOS Y DISCUSION gaGuYuBuTAtlc&hl=es&sa=X&ei=xG15UYm7LpDC9QTph
La cantidad de gramos que se requirió para la preparación de cada oH4CQ&ved=0CC8Q6AEwATgK#v=onepage&q=preparaci
medio de cultivo se obtuvo a partir de aplicar regla de tres, on%20de%20medios%20de%20cultivo&f=false>
basándonos en las especificaciones técnicas del cada agar,
suministrado por los fabricantes. 2
Gutiérrez de Gamboa, Sofía. Preparación de Medios de
Cultivo. 2001. [Consultado Abril, 27], disponible en
internet:
<http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmaci
a/catedraMicro/10_Preparaci%C3%B3n_de_medios_de_c
g = gramos a utilizar ultivo.pdf>
gf = gramos recomendado por fabricante
mLr = mililitros que necesito preparar
 Rojas, T. E. Conceptos y prácticas de microbiología general.
Por tanto, 2011. (En línea). Colombia: Universidad Nacional de
Colombia–Sede Palmira. Facultad de Ciencias Agropecuarias.
gf ……………. 36 g [Consultado Abril, 15], disponible en Internet:
PDA
mLr.………..... 160 mL <http://www.bdigital.unal.edu.co/4999/1/albertorojastrivino.201
20 Tubos c/u 8 mL
g …………….. 6,24 g 1.pdf>
Agar nutritivo gf ……………. 28 g
20 cajas c/u 15 mL mLr…………. 300 mL
g …………….. 8,4 g

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CUESTIONARIO

Medios de Microorganismo Composición del Interpretación del

Forma de Preparación
Cultivo Objeto Medio Medio
Peptona, Sales 46 g/ L de agua destilada, calentar a 100° C
Salmonella spp.
Caldo biliares, Na2CO3, y enfriar a 45°C, agregar 20ml de solución Blanco lechosa
Escherichia Coli
Tetrationato S2O32Na2SO3, yodada y distribuir 10ml en tubos estériles
Agar, Dextrosa,
Extracto de carne,
52 g/L de agua destilada, calentar a 100°C
Agar Bismuto Na3PO4, Peptona,
Salmonella Typhi por 1 minuto, no se esteriliza en autoclave,
Sulfito FeSO4, Sulfito de
se deja enfriar 45 °C y se distribuye en Amarillo-verde pálido
bismuto, Verde
Cajas Petri
brillante
Peptona de caseína, 60 g en 940ml de agua destilada, calentar
Extracto de carne, por 1 minuto agitando, se esteriliza en
Extracto de autoclave y se enfría a 45°C, se le agrega
Agar Baird
Staphylococcus levadura, LiCl, Agar, 50ml de Yema de huevo y 10ml de Solución Ámbar claro
Parker
Glicina, Piruvato de de Telurito y se distribuye en Cajas Petri.
sodio
Triptosa, NaCL,
sorbitol, triptófano,
K2HPO4·3H2O,
Lauril, Na2SO4, CL,
Preparar 10 ml de concentración de caldo
indolyl Beta D-
en tubos de ensayo tapa rosca y esterilizar
Coliformes y galactopiranosida
Caldo LMX – con autoclave. Fluorescente
Escherichia coli. (X-GAL), 4 Metil
Fluorocult Incubar a 37°C
umbeliferil –B-D-
glucoronide (MUG) ,
1 isopropil B-D-1-tio-
galactoriranoside
(IPTG)

Peptonas, NaCL,
dihidrógeno de
sodio
phosphate 2.2;
disodium hydrogen
phosphate
2.7;Fosfato, E. coli: Azul oscuro,
hidrógeno fosfato 26.5g/L de agua destilada, revolver por Coliformes: Salmon y
Coliformes y
Agar Chromocult disódico sodium aproximadamente 35 minutos las colonias de color
Escherichia coli
pyruvate 1.0; rojo.
tryptophan 1.0;
Agar-agar 10.0;
piruvato de sodio
triptófano; agar-
agar, tergitol mezcla
cromogénica.

Infusión de Cerebro
de Ternera, Cloruro La presencia y
Caldo BHI Estreptococos, de Sodio 37 g/L de agua destilada, llevar a punto de desarrollo de
(Brain Heart neumococos y Infusión de Corazón ebullición por un minuto. Esterilizar en microorganismos es
Infusion) meningococos. de Res, Fosfato autoclave. Inocular los tubos con una o dos observado por
Disódico gotas de la muestra con una pipeta estéril. turbidez en el medio.
Peptona de Gelatina
Dextrosa.

Extracto de carne,
Pluripeptona,
62.5g/L, hervir por uno o dos minutos hasta
Agar TSI Cloruro de sodio,
disolver bien, Llenar hasta la tercera parte
(Triple Sugar Enterobacterias Lactosa, Sacarosa, Rojo-anaranjado
de los tubos de ensayo. Esterilizar en
Iron) Glucosa, Sulfato de
autoclave.
hierro y amonio,
Tiosulfato de sodio,
Rojo de fenol, Agar.

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 Peptona de gelatina,
Extracto de
Agar LIA levadura, Glucosa, 35g/L de agua deshidratada, calentar a
(Lysine Iron Salmonella spp. Lisina, Citrato de 100°C por un minuto y esterilizar en Violeta
Agar) hierro y amonio, autoclave.
Tiosulfato de sodio,
Púrpura de
bromocresol, Agar.

Proteosa peptona,
Extracto de
levadura, Sales
biliares, Lactosa, 76 g/L de agua destilada. Dejar reposar 15
Agar Entérico Salmonella y Sacarosa, Salicina, minutos. hervir hasta lograr una disolución
Verde
HEKTOEN Shigella spp. Cloruro de sodio completa. no esterilizar en autoclave. Enfriar
Tiosulfato de sodio, a 45°C y distribuir en cajas de Petri.
Citrato de hierro y
amonio, Agar, Azul
de bromotimol,
Fucsina ácida
Agar EMB
Peptona, Lactosa, 36 g/L de agua destilada. Reposar 5
(Eosin
Bacilos Gram Sacarosa, Fosfato minutos; mezclar, calentando a ebullición
Methylene-blue
negativos dipotásico, Agar, durante 1 o 2 minutos Esterilizar en Purpura
Lactose)
Eosina, Azul de autoclave enfriar a 45°c para distribuir.
metileno.

BIBLIOGRAFIA
 Agar Sulfito Bismuto. [Consultado Abril, 26], disponible en internet:
<http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/sulfitobismuto.pdf>

 Medios De Cultivo. Tipos, Clasificación, Enumeración, Elaboración General Y Utilización De Los Mismos. Técnicas De
Inoculación, Incubación Y Recuento De La Muestra Biológicas. [Consultado Abril, 27], disponible en internet:
<http://www.educa2.madrid.org/web/educamadrid/principal/files/0e8a6919-7eeb-423f-9fa8-
b9c866aab3ff/Medios%20de%20cultivo.pdf>

 Tetrationato Caldo. [Consultado Abril, 27], disponible en internet:

<http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/tetrationatocaldo.htm>

 Triple Sugar Iron Agar (T.S.I.). [Consultado Abril, 25], disponible en internet:
<http://www.mastgrp.com/IFUS/IFU354_SPA.pdf>

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