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Universidad Nacional Autónoma de México

Facultad de Estudios Superiores Zaragoza


Ingeniería Química

Laboratorio de Ciencia Básica III

Practica 2: Cromatografía

Ferreyra Velázquez Oscar

Fecha: 23/10/2017
Resumen

En esta práctica el objetivo principal es extraer y posteriormente separar el


extracto de chile guajillo por medio de la cromatografía en columna, para llevar a
cabo la cromatografía en columna, primero se debe llevar acabo la extracción del
chile guajillo utilizando cloruro de metileno, posteriormente hay que realizar
pruebas de elución para determinar que disolvente es el que mejor separa el
extracto, una vez realizadas las pruebas, se determinó que el solvente más
adecuado es una mezcla de cloroformo (80%) y éter de petróleo (20%), una vez
determinado el eluyente, se realizó la cromatografía en columna utilizando la
mezcla de disolventes, se tomaron 20 muestras del producto obtenido en la
cromatografía en columna, en la cual solo se pudo obtener un componente del
extracto de chile guajillo, finalmente se realizó la cromatografía en capa fina de
cada una de las 20 muestras, punteando el extracto original en la misma placa
para comprobar que hubo separación, en este caso se comprobó que hubo
separación y por lo tanto la cromatografía en columna se llevó a cabo de manera
correcta. En la siguiente fotografía se puede observar el extracto original y sus
diferentes componentes y el componente obtenido después de la cromatografía en
columna y se comprueba la separación.

Introducción

La cromatografía es una técnica que permite separar sustancias con una


coloración diferente mediante la distribución desigual de estas entre 2 fases, un
adsorbente y un medio de arrastre, estas dos fases son el sólido adsorbente
(Silica gel) y el eluyente que se encuentra en fase liquida. El sólido adsorbe y
retiene fuertemente a los compuestos más polares que se encuentran en el
líquido, debido a ello, los menos polares son arrastrados por el eluyente y
separados.

La adsorción es un proceso por el cual átomos o moléculas de gases, líquidos o


solidos disueltos en agua son atrapados por una superficie, en contraposición a la
absorción que es un fenómeno de volumen.

La adsorción es un fenómeno de superficie, el proceso inverso a la adsorción se


conoce como deserción.
Cromatografía en columna:

En este tipo de cromatografía, la fase estacionaria utilizada, es decir,


el absorbente, se coloca en el interior de una columna de vidrio, la cual finaliza con
una llave para controlar el paso de sustancias al exterior de la columna. La fase
estacionaria se impregna con el eluyente o fase móvil. Seguidamente la mezcla
orgánica que nos interesa separar la depositamos por la parte superior de la fase
estacionaria, y así la fase móvil podrá ir atravesando el sistema.

La elución es la retirada por medio de un disolvente adecuado, de un material de


otro que sea insoluble en ese disolvente que se puede observar en la
cromatografía en columna.

Un eluyente es un solvente generalmente orgánico que se utiliza en la


cromatografía para extraer un compuesto que se requiere separar de otra fase

Algunos parámetros que afectan la separación son:

1. Adsorbente elegido
2. Polaridad de los solventes en la columna
3. Tamaño de la columna
4. Rango de elución

El tamaño de la columna y la cantidad de adsorbente también debe ser elegido


correctamente para separar correctamente una cantidad dada de muestra. Como
una regla de oro, la cantidad de adsorbente debe ser 25 o 30 veces por peso, la
cantidad de material a ser separado por cromatografía. Además, la columna debe
tener radio de altura a diámetro de 8:1, algunas relaciones diámetro-altura están
dadas en la siguiente tabla.

Cantidad de Cantidad de Diámetro de Altura de la


muestra adsorbente columna (mm) columna (mm)
0.01 0.3 3.5 30
0.10 3.0 7.5 60
1.00 30.0 16.0 130
10.00 300.0 35.0 280

Algunos adsorbentes solidos son:

 Papel
 Celulosa
 Silica gel
 Alumina
 Carbón activado
Objetivos

1. Identificar el pigmento que le da color al chile guajillo


2. Identificar el solvente o los solventes ideales para realizar la cromatografía
del extracto del chile guajillo
3. Realizar la cromatografía en columna utilizando el solvente o la mezcla de
solventes ideales
4. Comprobar que se pudieron separar los carotenos del chile guajillo por
medio de la cromatografía.

Hipótesis

Si se extrae el pigmento del chile guajillo con cloruro de metileno, se hacen


pruebas de elución por medio de la cromatografía en capa fina, se podrá
determinar el eluyente ideal para separar los carotenos del chile guajillo utilizando
la cromatografía en columna.

Metodología

Materiales:

 Frascos de vidrio con tapa (250 ml)


 Portaobjetos
 Tubos capilares
 Bureta de 50 ml
 Soporte universal
 Pinzas dobles
 Algodón
 Alambre (40 cm)
 Pipeta graduada (1ml)
 Pipeta graduada (5 ml)
 Tubos de ensayo
 Gradilla
 Matraz bola (125 ml)

Reactivos:

 Hexano
 Tolueno
 Acetato de etilo
 Cloroformo
 Cloruro de metileno
 Metanol
 Etanol
 Éter de petróleo
 Acetona
 Benceno
 Silica gel para capa fina
 Silica gel para columna

Equipos de laboratorio:

 Estufa
 Campana de extracción

Procedimiento:

1. Limpiar el chile guajillo, quitar semillas y venas, dejar solo la piel, macerar en
trozos pequeños y pesar 20 gramos. Colocar en un frasco y agregar la
cantidad suficiente de cloruro de metileno para cubrir todo el chile, dejar
reposar para que la extracción se lleve a cabo.
2. Preparar una suspensión de silica gel para capa fina con acetato de etilo,
sumergir dos portaobjetos en la suspensión, agitar cada que se introduzcan
dos placas, después activar las placas en la estufa, 15 minutos a 100 grados
centígrados.
3. Colocar un papel filtro en la pared de cada frasco y agregar 10 ml de un
disolvente diferente en cada frasco.
4. Puntear con el capilar el extracto en las placas previamente activadas, dos
puntos en cada placa y colocar dentro de las cámaras de elución en orden de
polaridad.
5. Revisar cada una de las placas y determinar en cual se llevó a cabo una
mejor separación, buscar un solvente polar y otro poco polar, miscibles entre
si, en donde se haya llevado a cabo una mejor separación. Realizar mezclas
entre ese par en diferentes proporciones, realizar pruebas de elución
nuevamente y determinar en qué proporción se llevó a cabo la mejor
separación.
6. Preparar 100 ml de solución con el par elegido en la proporción elegida, llenar
la bureta a la mitad con el solvente menos polar de la mezcla y colocar un
algodón en el fondo de la bureta. En un matraz bola preparar una solución de
silica gel para columna con el solvente menos polar de la mezcla, agregar
hasta que toda la silica gel quede en la columna y sacar el solvente restante.
Agregar 2 cm de sal sobre la silica gel, agregar 1 ml de mezcla y puntear el
extracto, abrir la bureta para que salga la mezcla y se lleve a cabo la
separación del extracto en la silica gel, rellenar de mezcla cuantas veces sea
necesario.
7. En cuanto empiece a salir el primer componente del chile guajillo (color
amarillo) recolectar muestras de 1 ml en 20 tubos de ensayo, preparar 20
placas para capa fina y 20 cámaras de elución, puntear una gota de extracto
original y una de cada tubo, agregar 10 ml de mezcla a cada cámara y
comprobar si hubo separación.

Diagrama de flujo

Preparación de la
Limpieza y extración del
chile guajillo con cloruro suspensión de silica gel Preparación de placas y
para capa fina con acetato cámaras de elución.
de metileno.
de etilo.

Preparación de la mezcla
Pruebas de elución con
de disolventes y Cromatografia en
los diferentes disolventes.
preparación de la columna y recolección de
Elección del disolvente
columna para muestras.
ideal.
cromatografia.

Cromatografia en capa
fina para comparar
extracto original y el
obtenido en la columna.
Resultados

Pruebas de elución:

Disolvente Distancia Distancia RF Fotografía


compuesto disolvente
(cm) (cm)
Éter de 1.3 5.9 0.2203
petróleo

Hexano 1.1 5.6 0.1964

Tolueno 4.6 4.8 0.9583

Benceno 4.7 5.1 0.9215

Cloruro de 2.8 5.3 0.5283


metileno

Cloroformo 4.2 4.8 0.8750

Acetato de 5.3 5.4 0.9814


etilo

Acetona 5.5 5.7 0.9649

Etanol 4.1 4.5 0.9111

Metanol 5.2 5.5 0.9454

 Se eligió al cloroformo y el éter de petróleo para realizar mezclas en


diferentes proporciones y determinar en qué proporción se da una mejor
separación. Las mezclas se realizaron en 10 ml totales.
Mezclas en proporciones:

Cloroformo (ml) Éter de petróleo (ml) Fotografía


5 5

9 1

1 9

8 2

2 8

7 3

3 7

6 4

4 6

 Como se puede observar, hubo mejor separación en la proporción 8 a 2,


por lo tanto se hizo una mezcla en esa proporción en 100 ml.

Posteriormente se realizó la cromatografía en columna utilizando esa mezcla,


se tomaron 20 muestras del producto obtenido de la columna y se realizó la
cromatografía en columna de las 20 muestras punteando el extracto original
en la misma placa para comparar.
Análisis de resultados

Al realizar las pruebas de elución se seleccionó un disolvente polar que


tuviera buena separación y uno poco polar que no tuviera mucha separación,
en este caso fue el cloroformo y el éter de petróleo, posteriormente se
realizaron mezclas en diferentes proporciones hasta encontrar una que haga
la mejor separación, se encontró que la mejor separación se realizó en la
proporción 8 partes de cloroformo y 2 partes de éter de petróleo.

Una vez realizada la cromatografía en columna con esta mezcla, se encontró


que la separación en la columna fue buena, se podían ver 3 coloraciones
distintas, amarillo, rojo y naranja. Se tomaron 20 muestras solo del
componente amarillo que fue el primero en salir de la columna por cuestiones
de tiempo y posteriormente se hizo la cromatografía en capa fina de cada
muestra, colocando un punto de la muestra y otro del extracto original para
comprobar la separación.

Conclusiones

 Se pudieron identificar los carotenos que le dan color al chile guajillo y se


pudieron separar en diferentes tonalidades por medio de la cromatografía en
capa fina y en columna.
 Se identificó a la mezcla entre cloroformo y éter de petróleo 8 a 2 partes como
disolvente ideal para el extracto de chile guajillo.
 Se comprobó que la cromatografía en columna puede ser utilizada como
método de separación.

Bibliografía

1. Brewester, R.Q, et al; “Research Techniques in Organic Chemestry”,


Prentice Hall. London, 1971.
2. Pavia, D.L, et al; “Introduction to Organic Laboratory technique, A
contemporany approach”, W.B Saunders Co, Philadelphia, 1976.
Cuestionario
1-¿A qué grupo de compuestos pertenecen los pigmentos?

Carotenoides
Xantofilas
Clorofila a y b

2-¿A qué se deben que estos compuestos sean coloridos?


-Carotenoides: son los responsables de la gran mayoría de los colores amarillos,
anaranjados o rojos presentes en los alimentos vegetales
Entre mayor sea la intensidad del color mayor será el contenido de carotenoides
-Las Clorofilas. El color verde tan uniformemente presente en los vegetales es
debido a la presencia de dos pigmentos estrechamente emparentados llamados
clorofila a y clorofila b. Se encuentran prácticamente en todas las plantas con
semilla, helechos, musgos y algas. Pueden formarse en las raíces, tallos, hojas y
frutos a condición de que estos órganos estén situados por encima del suelo y
queden expuestos a la luz.
-En los cloroplastos dos clases de pigmentos amarillos y  amarillo-anaranjados
que son los xantofilas y carotenoides.

3.-Explique la diferencia entre cromatografía de adsorción y partición.


Cromatografía de partición
La mayoría de las sustancias tendrán distinta solubilidad en diferentes solventes.
Si una sustancia se pone en contacto con dos solventes que no se mezclan entre
sí, se distribuirá entre los dos solventes en relación a su solubilidad en cada uno.
Se llama efecto de partición a la distribución de un soluto entre dos o más
solventes que no se mezclan. El solvente o el líquido que es atrapado por el medio
del sostén sea este papel, gel, sílice o alúmina, se llama fase estacionaria. Al
solvente revelador se le llama fase móvil. Se puede obtener una fragmentación
completa sise permite al soluto equilibrarse entre las fases estacionaria y móvil.
Adsorción
La cromatografía de adsorción o liquido-sólido, es la forma clásica de
cromatografía de líquidos. La adsorción se lleva a cabo cuando hay una
concentración más alta en la superficie de un sólido que en la solución
circundante. La adsorción se refiere al enlace de una sustancia a la superficie de
otra. Generalmente los adsorbentes usados en cromatografía son el carbón
mineral, el gel de sílice, y la alúmina.

4.-¿Cuáles son las ventajas y desventajas de la cromatografía en capa fina en


comparación con la cromatografía en columna?

Cromatografía en columna:
Las separaciones en la cromatografía en columna pueden realizarse por reparto,
adsorción o intercambio iónico. El estado físico del adsorbente hade ser de tal
manera que permita el empaquetamiento uniforme de la columna y el flujo libre de
disolvente a través de ella.
Cromatografía en capa fina
Cromatografía en papel y electro cromatografía. En todos los casos se emplea una
capa plana y relativamente delgada de una materia que a la vez es el soporte o
bien que recubre una superficie de vidrio, plástico o metálica. La fase móvil se
mueve a través de la fase estacionaria por capilaridad, a veces ayudada por
gravedad o por aplicación de un potencial eléctrico. En la actualidad la
cromatografía en plano se centra en la técnica de la capa fina, que es más rápida,
tiene mejor resolución y es más sensible que su alternativa en papel.

5.-Explique la diferencia que existe entre el adsorbente utilizado en cromatografía


en capa delgada y el de columna. Hacer una lista en orden creciente de actividad
En columna:
Puede usarse cualquier medio adsorbente siendo los más generales la celulosa,
gel de sílice, alúmina oxido de magnesio, oxido de cálcico y carbón activo (para
separaciones por adsorción y de intercambio iónico). Se emplea para la
separación de mezclas o purificación de sustancias a escala preparativa. Como
fase estacionaria se usa, generalmente, gel de sílice o alúmina dentro de una
columna. La elección del disolvente es crucial para una buena separación. Dicho
disolvente pasa a través de la columna por efecto de la gravedad o bien por
aplicación de presión (cromatografía flash). La columna se prepara mezclando el
soporte con disolvente.

En la cromatografía en columna, se pueden obtener las separaciones de


los compuestos coloridos, las cuales pueden concentrarse y así obtenerse cada
uno de los componentes por separados, es decir es un proceso de purificación y
aislamiento total de la sustancia. La desventaja de este método es que solo es
para sustancias coloridas, para que puedan observarse las separaciones.

6.-Hacer una lista de capacidad de adsorción de los grupos funcionales de los


compuestos orgánicos
De mayor a menor capacidad de adsorción:
¿Cómo se prepara el capilar para aplicar la muestra cromatografía?
Se toma un capilar y se calienta por el centro con la flama de un encendedor,
posteriormente se jala de los extremos hasta que se separe en 2 partes el capilar.
Después de esto tendrá un extremo más delgado que el otro. Para la aplicación de
la muestra se coloca cerca del extremo de menor diámetro del capilar hasta q
suba el disolvente con la muestra para después colocarla en la placa.

7.-Hacer una lista de eluyentes usados en cromatografía en columna y capa


delgada en orden creciente de polaridad
 Éter de petróleo
 Hexano
 Tolueno
 Benceno
 Cloruro de metileno
 Cloroformo
 Acetato de etilo
 Acetona
 Etanol
 Metanol

8.-¿Cómo se prepara el capilar para aplicar la muestra en la cromatografía?

Se calienta con un encendedor y se estira lentamente para hacer más delgado el


capilar, finalmente se limpia .

9.-¿Por qué es necesario que la cámara de elución este saturada de los vapores
del eluyente?

Para que haya una mejor superficie de contacto, ya que la adsorción es un


fenómeno de superficie.

10.-Explicar cada uno de los siguientes términos


A) Eluyente: Solvente generalmente orgánico que se utiliza en la cromatografía
para extraer un compuesto que se requiere separar de otra fase.
B) Elución: Es la retirada por medio de un disolvente adecuado, de un material de
otro que sea insoluble en ese disolvente.
C) Adsorción: Es un proceso por el cual átomos o moléculas de gases, líquidos o
solidos disueltos en agua son atrapados por una superficie, en contraposición a la
absorción que es un fenómeno de volumen.

11.- ¿Cómo se clasifica la cromatografía en función de su fase estacionaria?

Columna, Capa fina.

12.- ¿Cuál es la función de la fase móvil y como se lleva a cabo la separación?

Arrastrar la sustancia a separar sobre la fase estacionaria.

13.- ¿Cómo se prepara la papilla para la c.c.f?

Se hace una suspensión de la silica gel para capa fina utilizando un solvente, en
este caso utilizamos acetato de etilo.

14.- ¿Cuándo es conveniente activar una placa, como se activa?

Es conveniente activarla antes de utilizarla, se activa calentándola en la estufa o


en una parrilla de calentamiento.

15.- ¿Qué espesor debe tener la fase estacionaria en la c.c.f?


16.- Al comparar el Rf de dos compuestos se encontró que eran igual, podría
pensarse que se trata del mismo compuesto?

Sí, porque todos los compuestos tienen un Rf diferente.

17.- ¿Existirá alguna relación entre la cantidad de adsorbente y las dimensiones


de la columna?

Si, la cantidad de adsorbente debe ser en función de las dimensiones de la


columna como se muestra en la tabla que se encuentra en la introducción.

18.- ¿Cómo debe ser la polaridad de un eluyente al empacar una columna?

Debe ser una polaridad muy baja.

19.- ¿Cuál es el orden de polaridad en que salen los compuestos de una


cromatografía en columna?

Del menos polar al más polar.

20.- ¿A qué se le llama frente del eluyente?

21.- ¿Cómo se controla la salida de los componentes en una cromatografía en


columna?

Por medio de la válvula de la bureta.

22.- ¿Por qué no debe dejarse secar la columna cromatografica?

Porque el material adsorbente se puede fracturar y permitir el paso del disolvente


directamente sin ninguna separación.

23.- ¿Por qué es importante que las muestras a separar por cromatografía vayan
lo más secas posible?

Porque muchos solventes forman azeotropos con el agua.

24.- Al cargar una columna se recomienda que la muestra lleve la mínima cantidad
de disolvente ¿Por qué?

Para que la muestra sea lo más pura posible y se puedan realizar las pruebas
correctamente.

25.- ¿Qué pH presenta la alumina?

Acido, neutro y básico.


26.- ¿Por qué cuando se utiliza la alumina como adsorbente no se recomienda
usar acetona como eluyente?

Reaccionan entre si

27.- ¿Cuáles son los pasos a seguir para la preparación de las placas
preparativas?

Introducir en la papilla y activar.

28.- ¿Cuál es la aplicación de la cromatografía en capa preparativa?

Aislamiento de microgramos de muestra para análisis

29.- ¿Qué diferencia existe entre c.c.f y cromatografía en capa preparativa?

El tamaño de las placas, en capa fina se usan placas de 4x8 cm y en capa


preparativa de 20x20 cm.

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