Biochemical Engineering Journal 32 (2006) 185–190

Efecto del pretratamiento de hidrólisis enzimática de lípidos ricos

aguas residuales en la biodigestion anaerobia

Adriano A. Mendes, Ernandes B. Pereira, Heizir F. de Castro ∗

Departamento de Ingeniería Química, Faculdade de Engenharia Química de Lorena, PO Box 116, 12606-970 Lorena, SP, Brasil

Recibido el 16 de diciembre de 2005; recibido en forma revisada el 10 de junio de 2006; aceptado el 27 de septiembre de 2006

Resumen

Se utilizó una preparación de lipasa de bajo costo disponible en el mercado de origen animal para realizar el pretratamiento por hidrólisis enzimática de aguas residuales ricas en lípidos de las industrias lácteas.
La hidrólisis se realizó durante diferentes tiempos de incubación (4–24 h) y la eficacia del pretratamiento se verificó mediante pruebas comparativas de biodegradabilidad (efluentes tratados y crudos). Todos los
ensayos pretratados mostraron una velocidad de reacción más alta en relación con el ensayo de aguas residuales brutas, que se confirmó por el aumento de los niveles de producción de biogás y la mayor materia
orgánica (DQO) y eliminación de color. El pretratamiento se optimizó para un tiempo de hidrólisis de 12 h, lo que permite una alta formación de biogás (445 ± 29 ml) y eliminación de materia orgánica (78,2%).
Resultados prometedores en relación con la formación de biogás (354 ± 34 ml) también se encontraron cuando los pasos de hidrólisis y biodegradación se llevaron a cabo simultáneamente. El uso del tratamiento
enzimático parecía ser una alternativa muy prometedora para el tratamiento de aguas residuales con alto contenido de grasa, como las de la industria láctea.

© 2006 Elsevier BV Todos los derechos reservados.

Palabras claves: Lipasas; Lípidos; Hidrólisis; Aguas residuales lácteas; Biodegradabilidad; Biogás

1. Introducción El uso de la ruta bioquímica (enzimas específicas, lipasas), recientemente, ha

La digestión anaeróbica es un proceso atractivo para el tratamiento de aguas residuales
de alta concentración orgánica, especialmente las generadas por las industrias alimentarias;
por ejemplo, de la fabricación de azúcar
[1] almidón [2] y cervecería [3] . Hay varias ventajas de la digestión anaeróbica sobre el
tratamiento aeróbico tradicional, incluida la no necesidad de consejos de aireación y
una menor producción de lodo. [4,5] . Sin embargo, para algunas aguas residuales que
contienen grandes cantidades de grasa, como las aguas residuales de los lácteos, se
descubrió que la digestión anaeróbica era problemática, debido al potencial de
flotación de lodo, la formación de capas de espuma en la superficie del reactor, que no
se digirió y los efectos de inhibición / toxicidad de los compuestos intermedios (ácido
graso de cadena larga) generados durante la digestión anaeróbica de las aguas
residuales [5,6] . Para superar tales limitaciones, se han propuesto varias estrategias,
incluida la eliminación de lípidos antes de la biodigestión mediante métodos físicos o
pasos de pretratamiento (químicos o bioquímicos) para aumentar la licuefacción de
lípidos y la biodisponibilidad de microorganismos anaerobios. [6,7] . Entre estos, la
alternativa
∗ Autor correspondiente. Tel .: +55 12 31595063; Fax: +55 12 31533133.
Dirección de correo electrónico: heizir@dequi.faenquil.br (HF de Castro).
ganado más atención debido a las estrictas regulaciones ambientales y la
aplicación limpia y amigable de las enzimas. [6,8] .
Las lipasas (triacilglicerol éster hidrolasas, EC 3.1.1.3) son enzimas que catalizan
la hidrólisis del triacilglicerol a glicerol y ácidos grasos libres (FFA) [8,9] . La activación
interfacial de las lipasas ocurre en la interfaz lípido-agua, un fenómeno que se puede
rastrear hasta las características estructurales únicas de estas enzimas hidrolíticas.
Estas enzimas demostraron ser una alternativa muy prometedora para degradar las
aguas residuales de los lípidos ricos generados por las industrias lácteas y de
mataderos. [6,10–12] . Además, la aplicación de lipasas para el pretratamiento de
aguas residuales disminuye la concentración de materia orgánica, el color y los
sólidos en suspensión.
[6,12] .
En este trabajo, se investigó el efecto del uso de un efluente pretratado con niveles
crecientes de ácidos grasos libres sobre las características del lodo desarrollado en un
digestor anaeróbico en comparación con las aguas residuales brutas. Para este propósito,
la hidrólisis de los lípidos se realizó con una preparación de lipasa de bajo costo a partir de
páncreas porcino para diferentes tiempos de incubación (4–24 h). Se afirma que las lipasas
pancreáticas son más eficientes para hidrolizar lípidos que contienen ácidos grasos de
cadena larga (LCFA) con más de 12 carbonos, como los que se encuentran en la grasa de
la leche. [6] . La selección de este

1369-703X / $ - ver portada © 2006 Elsevier BV Todos los derechos reservados. doi: 10.1016 /
j.bej.2006.09.021
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preparación de la lipasa se basó en el trabajo previo realizado en nuestro laboratorio, que Tabla 2
Características de las aguas residuales lácteas utilizadas en este estudio Parámetro
icaba su idoneidad para la conversión de grasas de baja graduación. [11] . Además,
ntiene otras enzimas hidrolíticas como proteasas y -amilasas que también pueden ser Valor de concentración bajo

portantes para el proceso, ya que las aguas residuales de las industrias lácteas contienen
Alto
emás de lípidos, proteínas y compuestos de almidón [10] .
Sólidos totales (mg / L) 6510 9164
Acidez 0,26 1,24
Valor de saponificación (mgKOH / g) 155,1 191,7
Material y métodos. Ácidos grasos libres (mg / L) 5.0 69,0
Lípidos (mg / L) 1530 4680
DQO (mgO 2 / L) 21350 52500
1. Materiales
Proteínas (mg / L) 3503 5711
Azúcares reductores (mg / L) 464 558
La lipasa de páncreas porcino se adquirió de Nuclear (S˜ ao Glicerol (mg / L) 336,0 467,0
ulo, Brasil). La lipasa era una preparación cruda con una actividad de 1770 unidades Densidad (g / cm 3) 0,99 1.01

g sólido (hidrólisis del aceite de oliva, pH 8.0 a 37 ◦ C). Las propiedades bioquímicas Color (CU) una 13520 14034
Temperatura ( ◦ C) 25 32
inéticas de esta preparación específica de lipasa se determinaron de acuerdo con la
Flujo de descarga (m 3 / día) 100 120
todología descrita por Soares et al. [13] como se muestra en tabla 1 . Aguas
Ácido Caprico (%) 2,40
iduales crudas de las industrias lácteas (Maringa Corporation, ubicada en S˜
Acido laurico (%) 3.21
Ácido mirístico (%) 13,9
ao Paulo-Brasil) recogidos antes de que el tanque de flotación fuera utilizado para todos Ácido palmítico (%) 39,2
experimentos. Las alícuotas se almacenaron en un congelador ( - 4 4 ◦ C) y analizados en Ácido esteárico (%) 16,8

ación con los parámetros de interés para el estudio de acuerdo con las metodologías estándar Ácido oleico (%) 21,2

e se describen completamente en la Sección 2,4 ( Tabla 2 ) El lodo anaerobio aclimatado de una CU, unidades de color.

a capa de lodo anaerobio de flujo ascendente (UASB) que trata las aguas residuales de la

ustria láctea (3.27 gVSS / Land 4.27 g TSS / L) se utilizó como inóculo para los ensayos de
solución ide. Al final de la reacción, el agua residual hidrolizada se calentó a 60ºC. ◦ Se
degradación. Todos los demás reactivos químicos fueron de grado analítico.
determinó C durante 10 minutos para desnaturalizar la enzima y los ácidos grasos
libres, las concentraciones de proteína y glicerol y el pH. El grado de hidrólisis se
calculó teniendo en cuenta la concentración de glicerol formado en un momento
dado.
2. Hidrólisis encimática

Las reacciones de hidrólisis se llevaron a cabo en matraces de acero de 350 ml

2.3. Pruebas de ensayo de biodegradabilidad.
e contenían 250 g de aguas residuales brutas de acuerdo con la metodología
scrita por Pereira et al. [14] . El pH efluente se ajustó a 8,0 con solución de NaOH 1
Los ensayos por lotes de biodegradabilidad anaeróbica se realizaron en frascos
seguido de la adición de la cantidad requerida de enzima (0,5%, p / v) e iones
de vidrio cerrados con un volumen total de 500 ml, siguiendo la metodología descrita
cio (10 mM). Los contenidos se agitaron con un agitador mecánico a una velocidad
previamente [14] . Un tubo de plástico conectó el vial a un matraz invertido de 500 ml
nstante de 200 rpm. Las reacciones se llevaron a cabo a los 37 ◦ C, bajo presión
(matraces Duran) que contenía una solución alcalina (0,5%, p / v de NaOH), lo que
mosférica durante un máximo de 24 h. Se extrajeron muestras (2 g) del reactor
permitió medir la producción de biogás por el desplazamiento del líquido. El lodo
diante una jeringa, se pesaron y se transfirieron a un matraz cónico de 100 ml a
anaeróbico aclimatado (50 ml) de un reactor UASB que trata la producción de
ervalos de 1 h. Se añadieron cincuenta mililitros de una mezcla 50:50 (v / v) de
lácteos se transfirió a los matraces que contienen aguas residuales brutas e
etona en etanol a la muestra para desnaturalizar la enzima, congelando así la
hidrolizadas con niveles crecientes de ácidos grasos libres (FFA), que se obtuvieron
acción de manera efectiva. Se añadió el indicador de fenolftaleína y la mezcla se
cambiando el tiempo de incubación de la hidrólisis enzimática de la siguiente
ló frente a hidroxilo de potasio 0,02 M estándar.
manera: 4 h (ensayo S1), 8 h (ensayo S2), 12 h (ensayo S3) y 24 h (ensayo S4). Las
pruebas se llevaron a cabo por duplicado en modo discontinuo durante un período
mínimo de 15 días y agitación suave (100 rpm). Antes de cerrar, las botellas se
lavaron con gas nitrógeno (N 2)
a1
piedades catalíticas de la preparación de lipasa Parámetro

Valor para eliminar el aire en el cabezal de fl ash antes de la incubación; la temperatura se

mantuvo a 35 ± 1 ◦ C. También se llevaron a cabo ensayos de control para evaluar la
vidad (U / mg) 1771
eína (mg / g) 127,3
biodegradabilidad de las aguas residuales brutas (C1) y las aguas residuales

óptimo 8.0 suplementadas con lipasa (C2). Para este control (C2), los pasos de hidrólisis y
mperatura óptima ( ◦ C) 37,0 biodegradación se llevaron a cabo simultáneamente, para evaluar el efecto de inhibición
( 45 ◦ C) (h - 1) 1,18
potencial del LCFA formado (ácidos grasos de cadena larga) durante la hidrólisis
a media a los 45 ◦ C (h) 0,58
enzimática (ensayos S1, S2, S3 y S4) en los ensayos anaeróbicos. biodegradación
ax ( U / mg) 5864
( mM) 1150
Ácidos grasos libres, proteínas y azúcares reductores.
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se midieron al principio y al final. Las muestras recogidas se centrifugaron a Tabla 3

Composición de las aguas residuales crudas lácteas y pretratadas con ensayo de lipasa de páncreas porcino
10.000 rpm durante 20 minutos antes de realizar los análisis. La eficacia del
pretratamiento enzimático de las aguas residuales en la digestión anaerobia se
evaluó sobre la base de la producción de biogás. Ácidos grasos Glicerol (mM) Porcentaje de hidrólisis (%) de lípidos
libres (mM)
Proteínas

C1 2,70 ± 0,50 40,15 ± 8.68 00 00

2.4. métodos analíticos
C2 2,70 ± 0,50 40,15 ± 8.68 00 00

S1 24,65 ± 1,32 56,47 ± 5,43 28,6 ± 8,9 28,0

Los lípidos, los ácidos grasos libres, los sólidos totales y la demanda química de S2 31,65 ± 1,24 62,98 ± 7.60 36,1 ± 6.5 29,1

oxígeno (DQO) se determinaron de acuerdo con los procedimientos descritos en el Métodos S3 36,20 ± 1,31 66,23 ± 6.52 39,5 ± 6.8 32,7
S4 38,65 ± 1,35 67,32 ± 6.51 40,0 ± 6,9 31,0
estándar de examen de agua y aguas residuales [ 15] . Los valores de acidez y
saponificación se determinaron de acuerdo con la metodología descrita por Moretto y C1, control 1; C2, control 2; S1, S2, S3 y S4: muestras hidrolizadas durante 4, 8, 12 y 24 h,

Fett [dieciséis] . La proteína fue analizada por Lowry et al. [17] , mientras que los azúcares respectivamente.

reductores totales se determinaron utilizando el método del reactivo de ácido

3,5-dinitrosalicílico (DNS) [18] . El glicerol se determinó de acuerdo con la metodología
propuesta por Coks y Van Rede [19] . La distribución de ácidos grasos en los lípidos se
analizó con un cromatógrafo de gases (VarianModel CG3800) equipado con un
detector de ionización de llama (FID) y un inyector dividido sin división (relación de
división 1: 100). Una columna capilar CP SIL 88 (50m × 0.25mm × 0,39 mm; Varian) e
hidrógeno como gas portador (velocidad lineal promedio 30 ml / mim) se utilizaron. Las
muestras fueron previamente metiladas de acuerdo con la metodología descrita por
Metcalfe et al. [20] . Los picos de los respectivos ésteres metílicos de ácidos grasos
(FAME) se identificaron utilizando FAMEs estándar (Sigma). El color se determinó de
acuerdo con el método estándar de CPPA [21] , usando muestras centrifugadas con pH
previamente ajustado a 7.6 por la adición de 2MNaOH. El sobrenadante claro se usó
para leer la absorbancia a 465 n contra agua destilada. Los valores de absorbancia se
pueden transformar en unidades de color (CU) de acuerdo con la ecuación. (1) [21] :
durante 4 ha temperatura ambiente [6] . Según estos autores, el pretratamiento propuesto
redujo el tamaño promedio de partícula al 60% y aumentó las concentraciones de ácidos
grasos de cadena larga libres, lo que indica una solubilización parcial de las partículas de
grasa de cerdo en las aguas residuales del matadero. En el presente trabajo, no se estimó el
tamaño de partícula de grasa, sin embargo, se verificó un alto nivel de lípidos licuados en las
aguas residuales hidrolizadas.
3.2. Pruebas de ensayo de biodegradabilidad.
Los resultados obtenidos en relación con los azúcares reductores, las concentraciones
de proteínas, la materia orgánica (DQO), el color y el volumen de biogás se muestran en Tabla
4 para aguas residuales brutas (C1), muestras pretratadas enzimáticamente (S1 – S4) y
aguas residuales suplementadas con lipasa (C2).

Se encontró una alta concentración de azúcar residual para el ensayo de aguas

residuales brutas (C1), mientras que en los otros ensayos, el contenido de azúcar reductor
se degradó casi por completo (la eliminación varió de 97.7 a 100%). Estos resultados
sugirieron que la biomasa de lodo anaeróbico puede asimilar fácilmente los azúcares
CU = 500 UNA 2 (1) reductores contenidos en las aguas residuales hidrolizadas. La biodegradabilidad de
UNA 1
azúcares como la lactosa es generalmente rápida y casi completamente en condiciones
dónde UNA 1 es la absorbancia de 500 CU de solución estándar de platino-cobalto ( UNA 465 = 0.132)
anaeróbicas. [22] .
y UNA 2 es la absorbancia de la muestra de aguas residuales.

Con respecto a los niveles de proteína, también se obtuvieron resultados

similares para todos los ensayos y la reducción de proteínas varió de 87.9% (C1) a
3. Resultados y discusión 89.6% (S3). Aunque la etapa de hidrólisis redujo el peso molecular de la proteína,
parece que la biodegradabilidad anaeróbica no se vio afectada por el pretratamiento
3.1. Hidrólisis enzimática de aguas residuales. enzimático.

Tabla 3 muestra la composición de las muestras de aguas residuales hidrolizadas Tabla 4

obtenidas después de diferentes tiempos de incubación (4–24 h). Con respecto a la Composición de las aguas residuales lácteas biodegradadas en reactores discontinuos alimentados con muestras

proteína, el porcentaje de hidrólisis no fue influenciado por el tiempo de incubación, y se crudas y pretratadas enzimáticamente Reducción del ensayo (%)

encontraron valores similares en el orden del 28% para todas las muestras tratadas. La Biogás
hidrólisis de proteínas se atribuye a la presencia de proteasas en la preparación de lipasa (ml)
Reduciendo COD Proteins Color
utilizada en este trabajo.
azúcares

C1 89,9 ± 1,97 40,0 87,9 ± 0.1 13,9 ± 1.3 209 ± 47

Este comportamiento no se observó para la hidrólisis de los lípidos. La
C2 97,7 ± 0,45 76,4 88,8 ± 0.8 68,7 ± 0.4 0.4 354 ± 34
concentración de glicerol aumentó 60%, variando de 40.15 a
S1 99,2 ± 0,16 69,1 89,6 ± 0.2 0.2 75,8 ± 0.2 0.2 403 ± 4 4
67.32mM, y los ácidos grasos libres aumentaron de 2.7 a 38.7mM, a las 24 h, S2 99,9 ± 0,02 70,9 89,1 ± 0.4 0.4 76,5 ± 0.7 383 ± 2
resultando un porcentaje de hidrólisis de lípidos en el rango de 28.6% (4 h) a 40.0% S3 100 ± 0 0 78,2 88,7 ± 0.6 80,3 ± 0.4 0.4 445 ± 29

(24 h). Se informaron resultados similares para muestras de aguas residuales de S4 99,2 ± 0.6 80,9 89,6 ± 0.1 77,5 ± 0.2 0.2 437 ± 0 0

mataderos que contienen entre 2.5 y 3.0 g / L de lípidos pretratados con lipasa C1, control 1; C2; control 2; S1, S2, S3 y S4: muestras hidrolizadas durante 4, 8, 12 y 24 h,
pancreática PL-250 respectivamente.
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mado. Como la tasa de hidrólisis de proteínas (principalmente caseína) depende ocurrió. Esto también se demostró en algunos estudios publicados, en los que se descubrió
uso de biomasa aclimatada y en el presente trabajo, se utilizó un lodo anaeróbico que la formación de biogás a partir de la caseína como la única fuente de carbono (3,7 g
imatado de las aguas residuales tratadas de las industrias lácteas, asimilando DQO / L al día) era menor para los sistemas alimentados con lodo no aclimatado en
ilmente el sustrato comparación con el aclimatado

. 1. Producción de biogás y perfil cinético a partir de efluente no tratado (C1) y efluente tratado con lipasa (C2, S1, S2, S3 y S4) en función del tiempo (35 ◦ C, 15 días, agitación 100 rpm).
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Lodos debido a la fuerte actividad proteolítica presente en el cultivo aclimatado [5] . En
otro estudio, Sayed et al. [4] muestran que los niveles de proteína en las aguas
residuales del matadero también se biodegradaron fácilmente por microorganismos
anaerobios, alcanzando el 85 y 76% del N-Kjeldahl total total convertido en nitrógeno
amoniacal (NH 4 + - N) a los 30 y 20 ◦ C, respectivamente.
Figura 1 muestra la producción acumulada de biogás y los perfiles cinéticos obtenidos
en reactores discontinuos alimentados con aguas residuales crudas y pretratadas
enzimáticamente. La producción de biogás a partir de aguas residuales brutas (209 ± 47 ml)
fue menor que todas las muestras de aguas residuales hidrolizadas, incluido el ensayo de
control C2. La formación de biogás para los ensayos de aguas residuales pretratadas
estuvo en el rango de 354 ± 34 a 445 ± 29 ml. La producción máxima de biogás se obtuvo
cuando las aguas residuales se hidrolizaron durante 12 h (ensayo S3), dicha producción
fue dos veces mayor que la obtenida con aguas residuales no tratadas (C1). Además, el
volumen de biogás sobre 354 ± 34 ml, probablemente derivados de la hidrólisis de los
lípidos, podrían estimular la actividad del cultivo anaeróbico y facilitar así un proceso de
digestión anaeróbica más rápido. Los coeficientes lineales de estos ensayos fueron, casi,
tres veces más altos que los de las aguas residuales brutas, como se muestra en Figura 1 .
Se describieron resultados similares para la hidrólisis de los lípidos presentes en las aguas
residuales del matadero utilizando una lipasa comercial de Candida rugosa lipasa [14] .
Según estos autores, las aguas residuales pretratadas generaron cinco veces más
volumen de biogás (500 ml) que las aguas residuales brutas (107 ml).
Con respecto a la eliminación de materia orgánica en términos de DQO, todas las
muestras hidrolizadas y biodegradadas dieron como resultado una eliminación de DQO
superior al 70%, con un valor máximo alcanzado para el ensayo S4 (80,9%), que fue dos
veces el obtenido con las aguas residuales brutas (40,0% ) Para el ensayo simultáneo
de hidrólisis y biodegradación (C2), la eliminación de DQO también fue alta
76.4%, sin embargo, la producción de biogás (354 ml) fue menor que los otros
ensayos. En estas condiciones, es probable que la eliminación de ácidos grasos
de cadena larga y glicerol por la biomasa anaeróbica aumente la formación de
ácidos grasos volátiles (VFA), compuestos intermedios de la biodegradación
anaeróbica de LCFA, como los ácidos acético, propionato y butírico. , que según
Vidal et al. [23] se consideran inhibidores potenciales de la formación de biogás.
Este comportamiento no se observó para las muestras de ensayo (S1, S2, S3 y
S4) que lograron una alta eliminación de DQO y formación de biogás.
La eliminación de DQO fue efectiva debido a la degradación de los lípidos en sus
productos (glicerol y LCFA). Probablemente, la eliminación de la fracción lipídica por la
lipasa pancreática mejoró la reducción de la materia orgánica y la formación de biogás,
ya que las muestras pretratadas no fueron sometidas a flotación de lodo, mientras que
en las aguas residuales no tratadas se observó este fenómeno. La adhesión de lípidos
no biodegradables en las células superficiales de la biomasa dificultó la liberación del
gas formado, como el CO 2 y CH 4,
que conduce a la flotación de lodos.
El pretratamiento enzimático también se mostró positivo en la producción de
aguas residuales decoloradas. Para las aguas residuales brutas (C1), solo se
detectó el 13,9% de la eliminación del color después de la biodigestión. Por otro
lado, para las muestras pretratadas enzimáticamente, se eliminó al menos el 68,7%
del color con un valor máximo alcanzado para el ensayo S3 S3 (80,3%). Este valor
189
fue aproximadamente seis veces mayor que la obtenida para las aguas residuales
brutas (C1). Nuevamente para el ensayo que asocia los pasos de hidrólisis y
biodigestion en el mismo reactor (ensayo C2), la eliminación del color fue cinco
veces mayor que el valor para C1.
Aunque algunos trabajos publicados sugirieron que la concentración milimolar de LCFA
puede reducir drásticamente la biodegradación anaeróbica [24] , en las condiciones
probadas en el presente trabajo, los intermedios de la degradación de los lípidos (glicerol y
ácidos grasos de cadena larga) parecían no alcanzar concentraciones suficientemente altas
como para afectar el proceso. Sin embargo, para las aguas residuales no tratadas (ensayo
de control 1) en las que los contenidos de lípidos no se hidrolizaron previamente, se
observaron efectos inhibidores sobre los microorganismos anaerobios y problemas de
flotación de lodos.
4. Conclusiones
La hidrólisis de los lípidos puede considerarse como un paso limitante para la
generación de biogás y la eliminación de materia orgánica (DQO) en el proceso de digestión
anaerobia. En este trabajo hemos demostrado que el uso de una preparación de lipasa de
bajo costo puede aumentar la licuefacción de los lípidos y la biodisponibilidad de los
microorganismos anaerobios. A partir de las condiciones probadas, se obtuvieron los
mejores resultados cuando se realizó la hidrólisis durante 12 h, alcanzando una alta DQO y
eliminación de color. Parece también que el acoplamiento de la hidrólisis de los lípidos y la
digestión anaeróbica representa una solución atractiva para resolver problemas de baja
biodegradabilidad y producir aguas residuales tratadas decoloradas.
Expresiones de gratitud
Los autores agradecen la asistencia financiera de CNPq
(ConselhoNacional deDesenvolvimentoCient´ı fi coPrograma CT-Hidro) y
FAPESP (Fundac¸ ˜ ao de Amparo ` una
Pesquisa do Estado de S˜ ao Paulo), Brasil.
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