Aplicaciones biomoléculares diagnóstico

[AFO009750] Especialista en Biología Molecular y Citogenética
[MOD009024] Biología Molecular y Citogenética

[UDI048959] Aplicaciones de la biología molecular y citogenética
INTRODUCCIÓN
Las técnicas de Biología Molecular tienen numerosas aplicaciones en el campo de las ciencias
biomédicas. Permiten realizar diagnósticos detallados de enfermedades hereditarias, buscar alelos
más o menos frecuentes asociados a una característica de interés, diagnosticar contaminaciones
bacterianas en alimentos, diagnosticar infecciones virales, o seleccionar marcadores moleculares
para asistir al mejoramiento genético de una especie, establecer test de paternidad y/o realizar
diagnósticos de identidad forense, entre otras aplicaciones.
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A lo largo de la presente Unidad Didáctica se realizará un recorrido por el estudio de las principales
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aplicaciones de la Biología Molecular, como son las aplicaciones relacionadas con el diagnóstico y
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prevención de enfermedades, aplicaciones en el diagnóstico prenatal y estudios de esterilidad e
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infertilidad y, por último, las aplicaciones en pruebas de paternidad y medicina legal, muy
vinculadas al peritaje judicial. es

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campusvirtual.grupoesneca.com
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OBJETIVOS
Describir las aplicaciones de la Biología Molecular para el diagnóstico y prevención de
enfermedades de diversa índole.
Conocer las aplicaciones de las técnicas moleculares para el diagnóstico prenatal y los estudios
de esterilidad.
Identificar el fundamento de las pruebas de paternidad y de identidad forense en base a las
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técnicas y ensayos moleculares descritos.
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MAPA CONCEPTUAL
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1. Aplicaciones en el diagnóstico y prevención de enfermedades
El diagnóstico basado en el estudio del ADN ha experimentado un avance considerable en el último
decenio fruto de la identificación, caracterización y cartografiado de un elevado número de genes
implicados en patologías humanas. En la actualidad, el análisis de numerosas patologías genéticas
puede ser abordado en los laboratorios de genética molecular humana, tanto con una finalidad
clínica como de investigación básica.
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Las estrategias para el diagnóstico genético las podemos clasificar como directas o indirectas en
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función de si se detecta o no el gen implicado. En el primer caso podremos realizar el diagnóstico

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identificando en los pacientes las diferentes mutaciones del gen en cuestión. Desafortunadamente el
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número de enfermedades producidas por más de un tipo de mutación en un mismo o diferentes

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genes supera a aquellas que son consecuencia de una única mutación. Ello hace que el diagnóstico
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directo presente en muchas ocasiones problemas prácticos.

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La segunda estrategia es independiente del conocimiento del gen implicado, pues se fundamenta en
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el estudio de la herencia conjunta de marcadores anónimos y el locus de la enfermedad estudiada.

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Para este fin, es preciso que el marcador utilizado presente un fuerte ligamento con el locus de
interés, además de otras características que lo harán más o menos adecuado para el diagnóstico.
1.1. Análisis molecular directo e indirecto
El objetivo de todo proceso de diagnóstico médico es la determinación de la causa de una
enfermedad. Normalmente el proceso de diagnóstico afecta a un único individuo, el paciente, y se
realiza mediante unos protocolos preestablecidos y estandarizados. El diagnóstico de las
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enfermedades hereditarias pretende los mismos objetivos que cualquier otro proceso diagnóstico,
sin embargo presenta características diferenciadoras muy significativas.
En primer lugar, el resultado de un diagnóstico genético tiene no solo efectos sobre el paciente (al
que denominamos propositus) sino que todos los individuos emparentados con éste se ven afectados.
Así, la unidad de estudio en el diagnóstico genético es la familia y todo proceso de diagnóstico
implica un estudio familiar.
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En segundo lugar, los protocolos de diagnóstico se desarrollan de forma paralela a la investigación
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básica y son generalmente poco estandarizados. Los laboratorios de diagnóstico genético tienen por
lo general un carácter híbrido, al desarrollar actividades de investigación básica conjuntamente con
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la aplicación directa de la misma en el ámbito clínico. Frecuentemente el desarrollo de una nueva
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estrategia diagnóstica es en sí misma una línea de investigación básica en la cual está implicada la
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caracterización de un gen y el espectro de mutaciones que causan la patología en estudio. Esta
situación confiere a los laboratorios de diagnóstico genético una gran Flexibilidad y adaptación a
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nuevas estrategias metodológicas que revierten de forma muy positiva en la calidad del servicio.
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En tercer lugar, el diagnóstico genético debe dar respuesta en determinadas ocasiones a

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necesidades clínicas urgentes con una dimensión ético-social importante. El diagnóstico durante los
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períodos prenatal y neonatal requiere de una respuesta rápida y precisa. En el primer caso para dar
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a los padres una información completa y fiable que les permita la toma de decisiones durante las
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primeras semanas de gestación y en el segundo caso para poder dar una rápida respuesta
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terapéutica al recién nacido.

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En cuarto lugar, debemos tener en cuenta que una parte importante del diagnóstico genético es
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probabilístico. Salvo en el caso de la detección directa de la mutación responsable de la patología, el

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resto de estrategias diagnósticas tienen una mayor o menor componente probabilística. Por ello, los
resultados obtenidos y la "calidad" de la información facilitada al paciente y a su familia deben ser
matizados en este sentido.
Finalmente, todo proceso de diagnóstico genético conlleva una precisa caracterización clínica del
propositus. El diagnóstico genético tiene, en muchas ocasiones, un claro componente de diagnóstico
diferencial en el que se pretende confirmar o contrastar, frente a distintas opciones, la causa de una
determinada patología previamente caracterizada clínicamente. En este sentido es imprescindible la
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colaboración entre el personal clínico y el genetista en la elaboración del historial médico del
paciente.
Un número importante de patologías genéticas están asociadas a alteraciones en el complemento
cromosómico, sobre todo aquellas que se manifiestan de forma sindrómica. Si nuestra patología
pertenece a este grupo, la estrategia diagnóstica más apropiada será la caracterización
cromosómica del propositus y de su familia.
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Dicha caracterización consistirá básicamente en la elaboración del cariotipo para el estudio de
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posibles alteraciones estructurales o numéricas. Si, por el contrario, nuestro caso no pertenece a
este grupo, la cuestión que nos debemos plantear es si la patología presenta o no una herencia
mendeliana. De tratarse de una patología con herencia multifactorial, como es el caso de numerosas
enfermedades con una alta frecuencia en la población, como la hipertensión, la diabetes, las
enfermedades cardiovasculares, etc. las únicas aproximaciones diagnósticas son los estudios de
asociación y la determinación de factores de riesgo.
El cuadro dicotómico sirve para establecer la estrategia diagnóstica más apropiada en función de las
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características de la patología estudiada.
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Si la patología estudiada presenta una herencia mendeliana definida, deberemos preguntarnos si se
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ha localizado o no al locus implicado. De no ser así, solo podremos ofrecer un diagnóstico basado en
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el patrón de segregación. Se trata en este caso de un diagnóstico eminentemente probabilístico y de
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una baja calidad informativa.
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Por lo tanto las estrategias generales para el diagnóstico de enfermedades genéticas, como en
cualquier otro tipo de patologías, se realiza mediante la identificación clínica de los síntomas y
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signos que caracterizan cada síndrome concreto, apoyado en datos de laboratorio. Se han de sopesar
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todas la circunstancias para decidir si nos inclinamos por realizar lo que se denomina diagnóstico
al
directo (análisis de un individuo para ver si es portador de la mutación concreta que causa la
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enfermedad en esa familia), o si por el contrario aplicaremos el denominado diagnóstico indirecto

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(análisis de marcadores genéticos en la familia para ver si el consultando ha heredado el cromosoma

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que lleva la mutación).

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1.1.1. Diagnóstico directo

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El diagnóstico directo consiste en el estudio de un gen, cuya implicación en el desarrollo de una
enfermedad ya ha sido demostrada, para detectar la presencia de posibles mutaciones en el mismo.
En aquellos casos en que las mutaciones patogénicas pueden estar localizadas a lo largo de toda la
secuencia codificante del gen (heterogeneidad alélica fuerte), se deben utilizar método de barrido,
que examinan cada exón por separado para detectar simplemente si existe una mutación o no. Estos
métodos no identifican el tipo de mutación, pero nos permiten descartar rápidamente todos aquellos
exones normales, para centrarnos en el estudio de los exones mutados. En cambio, cuando queremos
detectar una mutación concreta, porque ya sabemos que es ésta mutación la que origina la
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enfermedad en esta familia, utilizaremos métodos dirigidos a identificar únicamente esa mutación
(métodos de confirmación). Estos últimos son quizás los métodos más utilizados en el contexto de un
laboratorio diagnóstico, especialmente en aquellas enfermedades que tienen una heterogeneidad
alélica limitada, es decir, enfermedades en las que un pequeño número de mutaciones causan la
inmensa mayoría de los casos. Los ejemplos más notorios son la mutación C282Y (que causa la
mayoría de los casos de hemocromatosis hereditaria), la mutación F508del, responsable de hasta el
80% de los casos de Fibrosis Quística, la inversión de los exones 1 y 22 del gen del Factor VIII de la
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coagulación, responsable de un 40% de los casos de hemofilia, etc.
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Los métodos de barrido se utilizan para la detección rápida de mutaciones (sin identificar el tipo
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concreto de mutación). Excepto el SSCP, estos métodos se basan en la detección de heterodúplex,
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que se forman por la reasociación lenta de las cadenas tras la desnaturalización del fragmento de
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ADN. Cuando el fragmento contiene una mutación y se mezcla con un ADN normal, la
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desnaturalización da lugar a moléculas heteroduplex portadoras de un desemparejamiento
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precisamente en el nucleótido donde está la mutación.
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El SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism, Polimorfismo de la Conformación de Cadenas

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Sencillas). Un cambio en la secuencia provoca cambios de conformacionales cuando el ADN se

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desnaturaliza y se deja que cada cadena se repliegue por separado. Estos cambios conformacionales
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se detectan porque alteran la migración electroforética en geles de poliacrilamida no

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desnaturalizantes. En el ejemplo típico, se amplifica un exón mediante PCR, se desnaturaliza el

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producto de PCR por calor, se cargan los productos desnaturalizados en un gel de acrilamida, se
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realiza la electroforesis y se tiñe el gel mediante una tinción específica para el ADN. Si no hay
mutaciones, se detectarán únicamente las bandas correspondientes al homodúplex y las bandas

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correspondientes a cada una de las cadenas sencillas que se han replegado adoptando una
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conformación determinada. En cambio, la presencia de una mutación dará lugar a nuevas bandas
debidas al patrón de plegamiento de las cadenas sencillas mutantes, que será diferente al de las
cadenas nativas. Este análisis no nos dice de qué tipo de mutación se trata, para eso es necesario
secuenciar este producto de PCR y compararlo con la secuencia normal. La ventaja es que nos
permite descartar la presencia de mutaciones rápidamente, lo que ahorra tiempo y recursos.
El DGGE (electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante) y sus variantes, entre las que
destaca TGGE (Temperature Gradiente Gel Electrophoresis). Esta técnica se basa en someter una
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muestra de ADN a una electroforesis en gel de acrilamida con un gradiente desnaturalizante
químico o térmico, de manera que la muestra se encuentra en condiciones cada vez más
desnaturalizantes a medida que avanza por el gel. Las muestras de ADN son productos de PCR en
cuyo extremo hay una región corta muy rica en citosinas y guaninas, de forma que la temperatura de
desnaturalización de esta pequeña región es mayor que la del resto de fragmento.
Por tanto, cuando el fragmento va avanzando por el gel, llegará un momento en que se desnaturaliza
todo excepto la región del clamp-GC. El resultado es que el fragmento se frena y deja de avanzar por
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el gel. Cuando la muestra de ADN es un heterodúplex que contiene un desemparejamiento, su punto
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de desnaturalización será distinto al del fragmento nativo, y por tanto se parará en un punto distinto
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del gel. Esto se reflejará en la aparición de una banda con distinta migración electroforética.
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El DHPLC (Denaturin HPLC) es una técnica en la que los heterodúplex y homodúplex son separados
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en un aparato de HPCL utilizando un gradiente desnaturalizante de acetonitrilo y variando la
temperatura de la columna. La muestra se inyecta en una columna de cromatografía y el ADN se una

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a la matriz.
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El acetonitrilo deshace estas interacciones y el ADN eluido se detecta a la salida de la columna

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midiendo la absorbancia de 260 nm, originando un pico a un tiempo de elución característico. En

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temperaturas bajas, no desnaturalizantes, la concentración de acetonitrilo necesaria para eluir un

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fragmento depende del tamaño y la secuencia del mismo, por lo que cada fragmento da lugar a un
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pico de elución característico. Al aumentar la temperatura de la columna, la elución tiene lugar a

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concentraciones menores de acetonitrilo, a medida que el fragmento comienza a desnaturalizarse.

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Como los heterodúplex se desnaturalizan a temperaturas distintas a los homodúplex, generan pico a
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tiempo de elución diferentes. De este modo es posible detectar mutaciones puntuales. La gran
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ventaja del DHPLC es su rapidez, ya que los tiempos de elución típicos están en torno a los cinco
minutos y una muestra se puede analizar en diez minutos. Por tanto, conserva la gran sensibilidad
de los métodos de detección de heterodúplex que utilizan un gradiente desnaturalizante, pero tiene
una procesividad mucho mayor y es fácilmente automatizable.
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Los métodos de comprobación se utilizan para detectar la existencia de una mutación específica.
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La PCR-Digestión tiene como fundamento en que la mutación crea o destruye una diana de
a.
restricción, de modo que la simple digestión del producto de PCR con la enzima de restricción
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permite determinar, en un gel de agarosa, el patrón de digestión indicativo de la presencia o
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ausencia de la mutación. Es un método que, por su sencillez y rapidez, es uno de los más utilizados
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en laboratorios clínicos. La principal limitación, lógicamente, es que no todas las mutaciones alteran
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una diana de restricción.
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La técnica ASO (Allele Specific oligonucleotide, Oligonucleótido Específico de alelo) fue una técnica
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bastante utilizada en los primeros años del diagnóstico molecular, aunque hoy en día ha caído en
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cierto desuso. Se basa en el diseño de sondas específicas para el alelo mutado y para el alelo nativo,
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utilizando oligonucleótidos. El tamaño de las sondas hace que su Tm sea lo suficientemente distinta
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para que la sonda específica del alelo normal hibride solamente con ADN genómico que contiene la
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mutación. El ADN de los pacientes se deposita en membranas de nylon haciendo un “dot-blot”, y

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esas membranas se hibridan con cada una de las sondas. El análisis de la hibridación de cada sonda
permite identificar si la muestra contiene un solo alelo mutado, dos alelos mutados o ninguno.
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La técnica ARMS (Sistema de Mutación Resistente a la Amplificación) está basada en el mismo
principio que la ASO, es decir, la utilización de oligonucleótidos específicos para la secuencia normal
y para la secuencia mutada. La diferencia estriba en que, en el caso del ARMS, estos
oligonucleótidos son cebadores de PCR. Se diseñan, por tanto, dos reacciones de PCR que
comparten un mismo cebador común pero se diferencia en los cebadores específicos para cada alelo.
Dada la rapidez y sencillez de la PCR, esta técnica está desplazando cada vez más a la técnica ASO.
La técnica OLA (Ensayo de Ligación de Oligonucleótidos) se trata de un método laborioso, pero que
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permite analizar un gran número de muestras con rapidez y fiabilidad. Se basa en la ligación de dos
oligonucleótidos, uno de los cuales está marcado con biotina y el otro con una molécula radioactiva o
fluorescente. El punto crucial es el diseño de ambos lados de la basa mutada. Por ejemplo, un diseño
habitual es que ambos oligos hibriden sobre la secuencia normal, de modo que la mutación impida la
hibridación de uno de ellos. Como consecuencia, la reacción de ligación sólo será efectiva en
presencia de una secuencia normal. Cuando se separan las sondas y se unen por los residuos de
biotina a un soporte que contiene estreptavidinas, sólo las moléculas completas emitirán la señal
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correspondiente al marcador. Por el contrario el ADN de un sujeto homocigoto para la mutación no
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dará ninguna señal. En principio, este método también permite detectar los individuos heterocigotos
para la mutación, ya que la intensidad de la señal emitida será la mitad de la de un individuo
a.
homocigoto normal. El método de OLA permite la automatización y la cuantificación de la señal
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cuando se utilizan marcadores fluorescentes, lo que le convierte en un buen método para el análisis
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de gran cantidad de muestras.
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1.1.2. Diagnóstico indirecto
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Hay ocasiones en las que no es posible, o resulta muy poco práctico, llevar a cabo un diagnóstico
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directo. Esto sucede en aquellos casos en los que no se conoce la secuencia del gen causante de una
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enfermedad, o cuando éste excesivamente grande y complejo. En estos casos todavía podemos
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predecir si un individuo ha heredado la enfermedad, estudiando marcadores específicos que nos

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permitan identificar cual cromosoma de los progenitores es el que lleva la mutación. Una vez
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identificado, simplemente hemos de ver qué cromosomas han heredado los hijos, para predecir la
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probabilidad de que también hayan heredado la mutación. No estudiamos directamente el gen, sino
marcadores genéticos que nos ayudan a identificar los cromosomas.

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A veces nos enfrentamos con una enfermedad genética cuyo gen causal no ha sido todavía
identificado, lo que obviamente impide realizar diagnóstico directo. En otras ocasiones, aun
conociendo el gen que debe estar mutado, resulta impracticable realizar estudios de diagnóstico
directo en la rutina de un laboratorio clínico, por la gran heterogeneidad alélica que muestra esa
enfermedad, o genes con una estructura exónica muy compleja. Un ejemplo bastante claro es la
Distrofia Muscular de Duchenne (DMD), debida a mutaciones en el gen de la distrofina. Este gen es
muy grande (ARNm de 14 kb) y tiene 79 exones distribuidos a lo largo de 2,3 Megabases de ADN
genómico, por lo que el estudio mutacional de cada exón sería excesivamente laborioso.
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En este tipo de situaciones, una alternativa muy utilizada es la de establecer si el probando ha
heredado el cromosoma o los cromosomas parentales que llevan el gen mutado, o si por el contrario
ha heredado los cromosomas parentales normales. Para hacer esto se sigue un proceso denominado
"gene tracking", algo así como "seguir la pista" a los alelos enfermos en una familia concreta. Se
hace utilizando marcadores polimórficos situados muy cerca o incluso dentro del gen en cuestión,
escogiendo aquellos marcadores que sean informativos en cada familia concreta. Utilizando esta
estrategia podemos saber si un individuo ha heredado una mutación de su progenitor enfermo
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simplemente determinando si ha heredado el cromosoma mutado de ese progenitor.
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Lógicamente, esta estrategia es válida siempre que no haya habido ninguna recombinación entre el
a.
locus de la enfermedad y el locus del marcador, de ahí que utilicemos marcadores tan cercano al gen
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que la frecuencia de recombinación sea prácticamente cero.
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El proceso general que se sigue en el diagnóstico indirecto es el siguiente:
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Distinguir los dos cromosomas en cada uno de los progenitores: para esto es
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imprescindible encontrar un marcador para el que ambos progenitores sean heterocigotos, de

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manera que esta familia sea totalmente informativa.

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Resolver la fase de ligamiento en el individuo transmisor: esto supone ser capaces de

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determinar cuál de los alelos del marcador segrega con el alelo de la enfermedad. Para esto
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hay que estudiar a los progenitores del individuo transmisor o a su descendencia y deducir la
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fase de ligamiento entre el marcador y el gen. Nuevamente, una recombinación entre ambos
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loci llevaría a resultados erróneos, de ahí la importancia de usar marcadores cercanos o al gen
de modo que la frecuencia de recombinación entre ambos sea despreciable.

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Determinar el alelo del marcador que ha sido trasmitido al probando: esto nos dirá si se
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ha transmitido el cromosoma con el alelo mutado o el alelo normal. Aquí se hace evidente la
enorme utilidad del diagnóstico indirecto ya que permite establecer si un individuo ha
heredado la mutación sin necesidad de detectar directamente la presencia de la misma.
La gran limitación del método indirecto viene dada porque en ocasiones los marcadores están a
cierta distancia del locus de la enfermedad y las predicciones no son fiables al 100%. En la práctica
se solventa esta limitación mediante el uso de varios marcadores, preferiblemente situados a ambos
extremos del locus de la enfermedad. De esta forma, la única posibilidad de error sería un doble
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sobrecruzamiento entre el locus con cada uno de los marcadores, pero la probabilidad de que esto
sucede es despreciable. Lógicamente, a mayor número de marcadores, mayor fiabilidad de los
resultados, sobre todo si además se incluyen marcadores situados dentro del propio gen de la
enfermedad.
1.2. Ejemplos de patologías estudiadas mediante técnicas de

genética molecular
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Según el catálogo OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man), en la actualidad se conocen
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alrededor de 8000 enfermedades genéticas relacionadas con todas las especialidades médicas. La
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mayoría de ellas son de tipo monogénico. Sin embargo, su base genética se conoce en 4423
entidades patológicas, lo que representa que en 50% de enfermedades no se ha demostrado la
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relación genotipo-fenotipo. Por otro lado, la Organización Mundial de la Salud (OMS), estima que
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estas 8000 enfermedades afectan al 7% de la población mundial. Según el informe de la
Organización Europea de Enfermedades Raras (Eurordis), el 80% de las enfermedades raras son de
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origen genético.
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Las enfermedades monogénicas se heredan de forma mendeliana, siguiendo diversos patrones

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hereditarios conocidos. La mayoría están causadas por variantes patogénicas localizadas
preferentemente en las regiones codificantes e intrónicas adyacentes de los genes, produciendo

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alteraciones de la proteína, modificando su función provocando el fenotipo patológico. Como ya
sabemos, el diagnóstico genético se basa en la localización de dichas variantes en los genes

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asociados a las enfermedades.

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Las enfermedades hereditarias más comunes son:
Fibrosis quística.
Alfa-beta talasemia.
Síndrome de X frágil.
Hemofilia A.
Atrofia Muscular espinal.
Anemia falciforme.
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Neurofibromatosis tipo 1.
Enfermedad de Huntington.
Poliquistosis renal autosómica recesiva.
Distrofia miotónica Tipo 1.
Distrofia muscular de Duchenne/Becker.
Síndrome de Marfan.
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2. Aplicaciones en el diagnóstico prenatal y estudios de

esterilidad e infertilidad
En este apartado se describen las distintas aplicaciones de los estudios de genética molecular a
distintos ámbitos:
Aplicaciones de la genética molecular en el diagnóstico prenatal.
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Aplicaciones de la genética molecular en estudios de esterilidad e infertilidad.
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2.1. Aplicaciones de la genética molecular en el diagnóstico
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prenatal
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Según expone el Instituto de Medicina Genómica de Valencia IMEGEN, El Diagnóstico Prenatal es el
po
conjunto de acciones clínicas, estudios y análisis, que tienen como fin diagnosticar antes del parto
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cualquier anomalía congénita. El primer paso para la prevención consiste en identificar cuáles son
los embarazos con riesgo. Solo cuando exista un riesgo elevado de defectos congénitos o de
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transmisión de una alteración cromosómica o una enfermedad genética, el especialista indicará la

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realización de un Diagnóstico Genético Prenatal. Para estimar de riesgo se utilizan diversos

tu
marcadores, los más comunes son: marcadores clínicos, marcadores bioquímicos y marcadores
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ecográficos.
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El diagnóstico genético prenatal es el estudio que se lleva a cabo a través de la obtención de células
fetales, que provienen normalmente de muestra del líquido amniótico, que es el líquido que envuelve
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al feto.
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Para la obtención de este tipo de muestras es necesario utilizar técnicas invasivas, lo que quiere
decir que suponen un riesgo para el embarazo. Por este motivo, este tipo de pruebas solo se
recomiendan en casos en los que el riesgo estimado sea superior al riesgo de aborto, debido a la
invasión realizada para la obtención de la muestra.
Las técnicas de diagnóstico genético prenatal, más utilizadas son las siguientes:
Las técnicas invasivas más utilizadas son:
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Coriocentesis o biopsia corial
Esta prueba consiste en la obtención de tejido placentario para el estudio de las

enfermedades cromosómicas. Esta muestra puede extraerse por vía abdominal o por vía
transcervical.
Amniocentesis, extracción de líquido amniótico
Se obtiene líquido amniótico que rodea al feto a través de una punción en el vientre
materno, a través de una ecografía guidad para evitar lesionar al feto.
Funiculocentesis o extracción de sangre fetal
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Se obtiene a través de la punción del cordón umbilical concretamente un vaso del cordón,
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a través de una ecografía guiada.
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Por otro lado existen otro grupo de pruebas no invasivas, en las cuales se selecciona la
denominada “población de riesgo” para un tipo de defecto congénito concreto. Para llevar a cabo
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estas pruebas los especialistas utilizan la historia clínica de la paciente, las analíticas anteriores
ca
realizadas, las ecografías y otro tipo de test. De todas estas fuentes de información pueden
determinarse algún o algunos factores de riesgo que pongan en evidencia la posibilidad de la
presencia de alguna anomalía, de tal modo que se recurren a las denominadas técnicas invasivas,
para confirmar el diagnóstico.
2.2. Aplicaciones de la genética molecular en estudios de

esterilidad e infertilidad
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El estilo de vida actual ha hecho que la medicina reproductiva cobre cada vez más importancia. Son
muchas las dudas que se les presentan a las parejas que quieren tener hijos y no lo consiguen.
Se entiende como infertilidad la imposibilidad de concebir un niño naturalmente o de llevar un
embarazo a término después de un año de vida sexual activa. La infertilidad afecta al 15% de las
parejas. Aproximadamente el 45% de los casos se deben a un factor masculino, 40 % se deben a un
factor femenino, y el resto es de causas inexplicables y/o mixtas.
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Se puede dar una infertilidad primaria (ningún miembro de la pareja ha conseguido un embarazo) y
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secundaria (ya se ha producido un embarazo con anterioridad pero ahora no lo consiguen).

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Las causas que se muestran como más comunes y que llevan a la infertilidad en la mujer son las
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siguientes:
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Alteraciones anatómicas: úteros demasiado grandes o demasiado pequeños; inexistencia de
trompas de Falopio; ovarios deficientes que no producen óvulos, etc.
Alteraciones hormonales: existencia de demasiadas hormonas masculinas que lleva a una
falta de ovulación, escasez de la hormona progesterona, que no permite el embarazo.
Otros factores: menopausia, amenorrea, vaginismo, quistes o tumores.
Desequilibrio en el ciclo menstrual.
Endometriosis.
Lesiones de las trompas de Falopio.
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Las causas que se muestran como más comunes y que llevan a la infertilidad en el hombre son las
siguientes:
Impotencia o incapacidad de mantener el miembro erecto, lo que impide la penetración, la falta
de espermatozoides (azoospermia) o poca cantidad de los mismos en el líquido seminal
(oligozoospermia).
Venas varicosas en el escroto (varicocele).
Testículos que no han bajado lo suficiente al escroto (criptorquidia) o que han sufrido algún
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proceso de torsión, conductos seminales bloqueados.
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Existencia de demasiado calor en el escroto.
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Ingestión de fármaco, drogas o productos químicos que conlleva a una reducción de los
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espermatozoides.
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Presencia de tumores testiculares.
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Enfermedades de transmisión sexual como la gonorrea.
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En ambos casos, los problemas emocionales pueden conducir a la infertilidad, pues impiden una
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ovulación adecuada en la mujer o una producción deficiente de espermatozoides en el hombre.

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El exceso de peso o extremada delgadez producida en dietas de adelgazamiento o en ciertas

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patologías, como la anorexia, son responsables de la disminución de la fertilidad en muchos casos.

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La utilización de prendas inadecuadas que impidan la correcta refrigeración de los testículos es otro
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factor de riesgo en el desarrollo de infertilidad.

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La ingestión de tabaco, alcohol o café pueden conllevar una disminución de la fertilidad. El alcohol
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durante el embarazo es responsable de algunos casos en que este no se lleve a cabo. El consumo de
alcohol en varones hace aumentar la temperatura de los testículos por lo que reduce la motilidad de
los espermatozoides. El café reduce las probabilidades de embarazo en la mujer. La ingestión de
alimentos que contienen cafeína pueden acarrear las mismas consecuencias.
2.2.1. Pruebas realizadas
En ambos miembros
Es necesario realizar el estudio en ambos miembros de la pareja, aunque este demostrada una causa
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masculina o femenina, en ocasiones puede ser un problema que afecte a los dos miembros de la
pareja.
Las pruebas que se realizan a ambos miembros son:
Determinación de grupo sanguíneo y Rh.
Serologías VIH, Lues, Hepatitis B y Hepatitis C.
Cariotipo en sangre periférica.
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Pruebas masculinas
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La principal prueba en la determinación de causas de infertilidad es el análisis del semen. La
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muestra será obtenida por masturbación; no pueden ser aceptadas las muestras obtenidas por coitus
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interruptus, puesto que existen numerosos inconvenientes, tales como la posible pérdida de la
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primera fracción, la contaminación bacteriológica y/o celular, y el descenso de la movilidad por la
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acción del pH vaginal. Tampoco pueden ser aceptadas las muestras obtenidas utilizando lubricantes.
No deben ser aceptadas las muestras incompletas, puesto que las diferencias entre las distintas
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fracciones seminales, tanto desde el punto de vista celular como bioquímico, son muy significativas.
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Si es posible la toma de la muestra se hará en la propia consulta, pero si el paciente lo prefiere

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podrá obtenerla en su casa teniendo en cuenta que deberá llevarla al laboratorio antes de 1 hora,
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conservada a temperatura ambiente.

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Se debe mantener una abstinencia sexual previa a la obtención de la muestra. Es necesario un

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período mínimo de 3 días y un máximo de 7 días, preferentemente 5 días.

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La muestra se recoge en un recipiente de plástico estéril.

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Las muestras han de obtenerse con extremadas condiciones de asepsia. Se recomienda la ducha y
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posterior lavado de manos y genitales, a continuación se obtiene la muestra de orina, primer chorro,
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sobre un contenedor estéril, para valorar la participación bacteriana de la uretra. Seguidamente,
sobre otro contenedor estéril, se coloca la muestra de semen obtenida por masturbación.
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La temperatura ideal para el transporte de las muestras debe ser de 20 a 25º C, evitando cambios
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bruscos para que la movilidad de los espermatozoides no se vea afectada.

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Otras pruebas masculinas empleadas en el estudio de la infertilidad son:

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Estudio cromosómico en semen (FISH-e).
Ecografía doppler testicular.
Analíticas de sangre.
Cultivo seminal.
Bioquímica del plasma seminal.
Biopsia testicular.
Estudio de las vías seminales.
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Pruebas femeninas
Las pruebas que se realizan son:
Ecografías vaginales, concretamente la ecografía transvaginal que permite observar la
morfología del útero con gran detalle.
Analíticas completas que incluyen hemograma y estudio de la coagulación.
Exploraciones con contraste para observar la cavidad uterina (Histerosalpingografía), que se
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lleva a cabo introduciendo un contraste radiológico líquido a través del cuello uterino.
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Análisis hormonales: valorar los niveles de las hormonas hipofisarias FSH, estradiol, prolactina
y TSH.
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3. Aplicaciones en pruebas de paternidad, medicina legal y

forense
Medicina legal y forense:
Huella genética:
Constituye la especialidad médica que tiene por objeto la utilización de los conocimientos médicos,
m
jurídicos, administrativos, éticos y ciencias afines, a la aplicación, desarrollo y perfeccionamiento del
co
derecho, de la asistencia sanitaria y de la actividad profesional médica.
a.
Los hechos a través de la historia reciente nos han demostrado la utilidad de las técnicas científicas
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en la práctica forense. Todos ellos han pasado por las pruebas de confiabilidad para asegurar, por
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un parte, un conocimiento racional de su uso y, por otro lado, para conocer sus limitaciones.
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El sentido común nos enseña que una prueba forense puede ser aceptada como tal, si cumple por lo
menos tres condiciones:

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Su teoría científica debe ser completamente válida.

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Sus métodos y técnicas deben ser confiables y reproducibles.

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Debe demostrarse su utilidad práctica en varios casos concretos.

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Por definición, una prueba de laboratorio que se utilice como peritazgo científico, en un proceso
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judicial, debe proponerse descubrir la verdad. Para lograr su objetivo, la justicia nombra tanto a
personal científico cualificado (peritos), como a evaluadores críticos. Sin embargo, existe una amplia
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disparidad entre los criterios científicos y aquellos judiciales. La comunidad científica, por una parte,
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vigila la investigación sometiendo las nuevas teorías y descubrimientos a exhaustivas revisiones y
continuas verificaciones independientes. Por el contrario, en los tribunales de justicia, tales
controles científicos están totalmente ausentes y son, en última instancia, los jurados evaluadores,
quienes deben emitir un concepto crítico, sobre la competencia de una técnica de uso científico,
para resolver un caso forense.
El descubrimiento del polimorfismo del ADN minisatélite ha sido, sin duda, el hallazgo que más
impacto ha tenido nunca en la Biología Forense, especialidad médico-legal que se ocupa de la
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resolución de problemas jurídicos por medio de la aplicación de conocimientos de antropología y de
genética molecular, y en la que se realizan dos tipos básicos de pericias relativas a la investigación
biológica de la paternidad y de criminalística biológica. La capacidad de identificación de estos
polimorfismos es de tal magnitud que han sido calificados de "huella genética".
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Medicina legal y forense:

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Huella genética:
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La huella genética (prueba de ADN o análisis de ADN) es una técnica que se utiliza para distinguir
entre los individuos de una misma especie utilizando muestras de su ADN. Su inventor fue el Alec
ir
Jeffreys. Consiste en que aunque gran parte de una secuencia de ADN de dos individuos de la misma
sv
especie es común, existen regiones específicas altamente variables, denominadas minisatélites, que
son características de cada individuo, sin repetirse en ningún otro individuo. En dos individuos no
pu
relacionados será menos probable que tengan el mismo número de minisatélites en un locus
determinado.
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El ADN expresivo o codificante es, en general, poco polimórfico, con la excepción de la región HLA.
Desde el punto de vista médico-legal es, por ello, mucho más interesante el ADN no expresivo que
cuantitativamente supone la mayor parte del genoma humano.
Aunque en un primer momento de su aplicación forense, los minisatélites se analizaban con sondas
multi-locus, pronto se limitó mucho su uso por la imposibilidad de construir bases de datos comunes,
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dificultad de estandarización y por los problemas bioestadísticos de evaluación de resultados.
Incluso con sondas “single-locus” que, con condiciones rigurosas de hibridación, reconocen locus
VNTR únicos, se presentaron problemas en los primeros momentos de su uso, que motivaron
sentencias de gran resonancia como el caso Castro en la jurisprudencia norteamericana.
Desde que se logró la estandarización en los aspectos más esenciales, el uso de las SLPs para
detectar polimorfismos VNTR con fines médico-legales fue perfectamente válido aunque para cada
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población fue necesario hacer la estima de las frecuencias alélicas, lo que en España fue realizado
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para las sondas más comunes en 1991.
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Desde entonces en España el uso de SLPs se ha utilizado en la investigación biológica de la
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paternidad, aunque su uso en criminalística ha quedado restringido a unos pocos laboratorios.
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Por lo tanto, son dos los tipos de pericias más comunes en los laboratorios de Genética forense: las
investigaciones biológicas de la paternidad y la criminalística biológica, es decir, el análisis de

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vestigios biológicos de interés criminal, como manchas de sangre, de esperma saliva o pelo.
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Aunque el análisis de polimorfismos de ADN repetitivo revolucionó la Biología Forense, su uso posee
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algunos problemas además del referente a la estima de frecuencias y aspectos bioestadísticos de la

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elaboración de resultados. El primero es la imposibilidad de análisis de muestras minúsculas (por

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insuficiencia de la cantidad de ADN que se puede extraer) como pequeñas manchas de sangre, de
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esperma o pelos, que suponen, además, la mayor parte del trabajo forense. Otro problema es el
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análisis de muestras degradadas, tan frecuentes en casos médico-legales, con las que puede ser
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imposible obtener resultados con SLPs ya que las sondas usadas detectan frecuentemente RFLPs de
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más de 5Kb.
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Un último problema es la laboriosidad del método y el tiempo de análisis, que implica que un
problema médico-legal (una mancha o una paternidad) no pueda ser solucionado en menos de tres
días con SLPs. El análisis de polimorfismos de ADN por PCR solucionó muchos de estos problemas y
actualmente la mayoría de los vestigios biológicos de interés criminal se analizan utilizando esta
técnica.
Los locus de interés médico-legal analizables por PCR son:
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ADN expresivo.
ADN repetitivo.
Minisatélites.
Microsatélites.
Bucle D mitocondrial.
Locus específicos de cromosomas X e Y (diagnóstico sexo).
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Diagnóstico de paternidad y maternidad
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La investigación de la paternidad es una pericia ya solucionada antes del descubrimiento del
a.
polimorfismo del ADN. Éste, sin embargo, la ha simplificado enormemente y también la ha hecho
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más segura en situaciones difíciles (paternidades sin madre biológica, dudas de paternidad entre
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hermanos, paternidades sin padre con datos a partir de familiares, etc.).
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Hoy en día se realiza esta prueba con SLPs y algunos polimorfismos por PCR y la seguridad de la
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misma es casi absoluta.
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Como ya sabemos, todos los seres humanos recibimos la mitad de la información genética de nuestro
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padre y la otra mitad de nuestra madre. Es decir, heredamos un “juego” completo de 23 cromosomas
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(22+1) de nuestro padre y otro “juego” completo de nuestra madre. Por lo que tenemos dos
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cromosomas 1, dos cromosomas 2, dos cromosomas 3, etc.

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Por lo tanto, si queremos saber quién es el padre biológico de una persona, y basándonos en este
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principio, deberíamos comprobar que ambas comparten la mitad de su información genética, lo que
se lleva a cabo mediante el estudio del polimorfismo de ADN.

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Criminalística biológica
En la aplicación médico-legal más trascendente del polimorfismo del ADN. Sobre todo mediante PCR
cada individuo puede ser identificado con un grado de seguridad muy alto (posibilidades medias de
coincidencia de 1 en 10 billones) a través de vestigios como un pelo o un simple esperma.
La prueba de ADN aplicada a criminalística tiene cuatro etapas básicas:
Análisis laboratorial de la muestra: lo que incluye analizar el mayor número de
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polimorfismos de ADN posible, obteniendo así un perfil genético de la muestra objeto de
análisis.
Comparación de los resultados con los obtenidos en el inculpado o la víctima.
Emisión del correspondiente informe médico-legal y, en su caso, la comunicación de os
resultados en el juicio oral.
Valoración de la prueba biológica: es uno de los aspectos cruciales. La correcta valoración
de la prueba por parte del perito y la comunicación al juez.
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Es especialmente importante la aplicación del polimorfismo del ADN en los delitos contra la libertad
sexual, delitos que poseen una gran tasa de reincidencia y en los que ante la negativa del
a.
sospechoso no suelen existir más pruebas indiciarias que las proporcionadas por posibles restos de
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esperma en prendas y en cavidad vaginal o anal.
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La utilización de bancos de datos de potenciales delincuentes con polimorfismos ADN, ha permitido
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reducciones espectaculares de las cifras de criminalidad y del número de delitos resueltos en países
como Reino Unido, mientras que en nuestro país el número de delitos contra la libertad sexual no
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resueltos se cifra en el 70% y el número de delitos en los que se investiga el ADN es con seguridad
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inferior al 1%.
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4. Caso práctico: prueba de paternidad
Para realizar la determinación de la posible paternidad de un individuo se toman muestras de saliva
tanto del padre como del posible hijo del mismo.
La técnica a realizar va a ser un análisis de marcadores STRs obtenidos mediante QF-PCR. En este
caso concreto, se procederá a la discusión de la paternidad a partir de 10 marcadores STRs
extraídos de las muestras de saliva de ambos individuos implicados. Una vez amplificado el material
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genético, se separa en electroforesis y se obtienen los resultados reflejados en la siguiente tabla:
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Para que exista compatibilidad entre dos individuos para un marcador molecular dado, el hijo debe
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tener al menos uno de sus alelos que coincida con uno de los del padre. Es decir, si el posible padre
tiene alelos 14/14 para un determinado marcador y el hijo tiene 14/12, si existe compatibilidad,
porque el hijo podría haber heredado el alelo 14 del padre y el 12 de la madre.
Sin embargo, si el posible padre tiene alelos 14/14 para un marcador concreto y el genotipo del hijo
fuese 13/21, no existiría compatibilidad, puesto que al menos debería haber heredado un alelo 14.
Una vez conocido el procedimiento para determinar la compatibilidad padre/hijo para cada
marcador, estableceremos la compatibilidad para cada uno de los 10 marcadores STR empleados en
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el estudio de paternidad del ejemplo propuesto.
Los resultados del análisis se muestran en la siguiente tabla:
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Como vemos, existe Compatibilidad entre los individuos para los 10 marcadores moleculares STR
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empleados. Por ello, no existen evidencias de que ambos individuos no sean padre e hijo. Sin
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embargo, aún no se podría afirmar con total probabilidad que exista tal parentesco, pues se requiere
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el análisis de más marcadores, además de otras pruebas complementarias.

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Glosario
Flexibilidad: 1. Cualidad de lo que es flexible o puede doblarse fácilmente sin romperse 2.
Capacidad para doblar el cuerpo o una parte de él sin sentir dolor 3. Facilidad para adaptarse a
las circunstancias o a la opinión de otras personas.
Compatibilidad: Cualidad de lo que puede existir o interactuar de forma armónica con otra
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cosa.
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Recuerda
Las estrategias para el diagnóstico genético las podemos clasificar como directas o
indirectas en función de si se detecta o no el gen implicado. En el primer caso podremos
realizar el diagnóstico identificando en los pacientes las diferentes mutaciones del gen en
cuestión. Sin embargo, la segunda estrategia es independiente del conocimiento del gen
implicado, pues se fundamenta en el estudio de la herencia conjunta de marcadores anónimos y
m
el locus de la enfermedad estudiada.
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El diagnóstico directo consiste en el estudio de un gen, cuya implicación en el desarrollo de
a.
una enfermedad ya ha sido demostrada, para detectar la presencia de posibles mutaciones en
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el mismo.
Hay ocasiones en las que no es posible, o resulta muy poco práctico, llevar a cabo un
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diagnóstico directo. Esto sucede en aquellos casos en los que no se conoce la secuencia del gen
causante de una enfermedad, o cuando éste excesivamente grande y complejo. En esos casos
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se realiza el diagnóstico indirecto.
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El diagnóstico genético prenatal es el estudio que se lleva a cabo a través de la obtención de

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células fetales, que provienen normalmente de muestra del líquido amniótico, que es el líquido
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que envuelve al feto. Para la obtención de este tipo de muestras es necesario utilizar técnicas
tu
invasivas, lo que quiere decir que suponen un riesgo para el embarazo

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Se entiende como infertilidad la imposibilidad de concebir un niño naturalmente o de llevar

sv
un embarazo a término después de un año de vida sexual activa. La infertilidad afecta al 15%
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de las parejas. Aproximadamente el 45% de los casos se deben a un factor masculino, 40 % se
deben a un factor femenino, y el resto es de causas inexplicables y/o mixtas.

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La medicina legal y forense constituye la especialidad médica que tiene por objeto la
ca
utilización de los conocimientos médicos, jurídicos, administrativos, éticos y ciencias afines, a
la aplicación, desarrollo y perfeccionamiento del derecho, de la asistencia sanitaria y de la
actividad profesional médica.
La huella genética (prueba de ADN o análisis de ADN) es una técnica que se utiliza para
distinguir entre los individuos de una misma especie utilizando muestras de su ADN.
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Autoevaluación
Completa el espacio en blanco del siguiente enunciado: “El diagnóstico

___________ consiste en el estudio de un gen, cuya implicación en el desarrollo de
una enfermedad ya ha sido demostrada”.
Directo.
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Indirecto.
a.
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Específico.
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¿Qué técnica consiste en que los heterodúplex y homodúplex son separados en
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un aparato de HPCL utilizando un gradiente desnaturalizante de acetonitrilo y
cariando la temperatura de la columna?
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El SSCP.
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El DGGE.
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El DHPCL.
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Indica si es verdadero o falso el siguiente enunciado: “La técnica OLA se basa en

la ligación de dos oligonucleótidos, uno de los cuales está marcado con biotina y
el otro con una molécula radioactiva o fluorescente. El punto crucial es el diseño
de ambos lados de la basa mutada”.
Verdadero.
Falso.
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¿Qué técnica consiste en la obtención de tejido placentario para el estudio de las

enfermedades cromosómicas?
La coriocentesis.
La amniocentesis.
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La funiculocentesis.
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a.
¿Cuál es la principal prueba en el análisis de infertilidad masculina?
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El análisis del semen.
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La biopsia testicular.
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La ecografía.
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Aplicaciones biomoléculares diagnóstico

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Aplicaciones biomoléculares diagnóstico

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[AFO009750] Especialista en Biología Molecular y Citogenética

[MOD009024] Biología Molecular y Citogenética

biomédicas. Permiten realizar diagnósticos detallados de enfermedades hereditarias, buscar alelos

más o menos frecuentes asociados a una característica de interés, diagnosticar contaminaciones

bacterianas en alimentos, diagnosticar infecciones virales, o seleccionar marcadores moleculares

diagnósticos de identidad forense, entre otras aplicaciones.

vinculadas al peritaje judicial. es

Describir las aplicaciones de la Biología Molecular para el diagnóstico y prevención de

enfermedades de diversa índole.

Identificar el fundamento de las pruebas de paternidad y de identidad forense en base a las

1. Aplicaciones en el diagnóstico y prevención de enfermedades

El diagnóstico basado en el estudio del ADN ha experimentado un avance considerable en el último

decenio fruto de la identificación, caracterización y cartografiado de un elevado número de genes

implicados en patologías humanas. En la actualidad, el análisis de numerosas patologías genéticas

clínica como de investigación básica.

función de si se detecta o no el gen implicado. En el primer caso podremos realizar el diagnóstico

número de enfermedades producidas por más de un tipo de mutación en un mismo o diferentes

directo presente en muchas ocasiones problemas prácticos.

el estudio de la herencia conjunta de marcadores anónimos y el locus de la enfermedad estudiada.

1.1. Análisis molecular directo e indirecto

El objetivo de todo proceso de diagnóstico médico es la determinación de la causa de una

enfermedad. Normalmente el proceso de diagnóstico afecta a un único individuo, el paciente, y se

realiza mediante unos protocolos preestablecidos y estandarizados. El diagnóstico de las

sin embargo presenta características diferenciadoras muy significativas.

Así, la unidad de estudio en el diagnóstico genético es la familia y todo proceso de diagnóstico

implica un estudio familiar.

lo general un carácter híbrido, al desarrollar actividades de investigación básica conjuntamente con

En tercer lugar, el diagnóstico genético debe dar respuesta en determinadas ocasiones a

terapéutica al recién nacido.

probabilístico. Salvo en el caso de la detección directa de la mutación responsable de la patología, el

resultados obtenidos y la "calidad" de la información facilitada al paciente y a su familia deben ser

matizados en este sentido.

propositus. El diagnóstico genético tiene, en muchas ocasiones, un claro componente de diagnóstico

determinada patología previamente caracterizada clínicamente. En este sentido es imprescindible la

Un número importante de patologías genéticas están asociadas a alteraciones en el complemento

pertenece a este grupo, la estrategia diagnóstica más apropiada será la caracterización

cromosómica del propositus y de su familia.

Dicha caracterización consistirá básicamente en la elaboración del cariotipo para el estudio de

asociación y la determinación de factores de riesgo.

enfermedad en esa familia), o si por el contrario aplicaremos el denominado diagnóstico indirecto

(análisis de marcadores genéticos en la familia para ver si el consultando ha heredado el cromosoma

que lleva la mutación).

1.1.1. Diagnóstico directo

El diagnóstico directo consiste en el estudio de un gen, cuya implicación en el desarrollo de una

enfermedad ya ha sido demostrada, para detectar la presencia de posibles mutaciones en el mismo.

laboratorio diagnóstico, especialmente en aquellas enfermedades que tienen una heterogeneidad

mayoría de los casos de hemocromatosis hereditaria), la mutación F508del, responsable de hasta el

El SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism, Polimorfismo de la Conformación de Cadenas

Sencillas). Un cambio en la secuencia provoca cambios de conformacionales cuando el ADN se

se detectan porque alteran la migración electroforética en geles de poliacrilamida no

desnaturalizantes. En el ejemplo típico, se amplifica un exón mediante PCR, se desnaturaliza el

mutaciones, se detectarán únicamente las bandas correspondientes al homodúplex y las bandas

permite descartar la presencia de mutaciones rápidamente, lo que ahorra tiempo y recursos.

muestra de ADN a una electroforesis en gel de acrilamida con un gradiente desnaturalizante

desnaturalización de esta pequeña región es mayor que la del resto de fragmento.

temperatura de la columna. La muestra se inyecta en una columna de cromatografía y el ADN se una

El acetonitrilo deshace estas interacciones y el ADN eluido se detecta a la salida de la columna

midiendo la absorbancia de 260 nm, originando un pico a un tiempo de elución característico. En

temperaturas bajas, no desnaturalizantes, la concentración de acetonitrilo necesaria para eluir un

pico de elución característico. Al aumentar la temperatura de la columna, la elución tiene lugar a

concentraciones menores de acetonitrilo, a medida que el fragmento comienza a desnaturalizarse.

una procesividad mucho mayor y es fácilmente automatizable.

mutación. El ADN de los pacientes se deposita en membranas de nylon haciendo un “dot-blot”, y