cultivo celular primario

Ventajas de cultivos celulares:

• los cultivos se pueden observar, manipular y analizar bioquímicamente de manera continua. Al
mezclar dos tipos celulares diferentes se pueden estudiar las interacciones entre estas.
• Los experimentos realizados en células de cultivo se les llama in vitro a diferencia de los realizados en
organismos(in vivo)

fraccionamiento celular

la ultracentrífuga separa los componentes sub celulares

(homogenado) según su tamaño y densidad. El vacío reduce la
fricción, previniendo que el rotor se caliente y permitiendo que el
sist. de refrigeración mantenga la muestra en 4°c.



centrifugación diferencial La centrifugación repetida a velocidades progresivamente mayores

acaba fraccionando los homogenados celulares en sus componentes
La centrifugación separa los componentes de la célula x su tamaño y densidad. Los componentes
mayores y más densos experimentan las mayores fuerzas centrifugas y se desplazan más
rápidamente. Sedimentan formando un precipitado en el fondo del tubo, mientras que los componentes
menores y menos densos permanecen en la suspensión superior, llamada sobrenadante.

Las partículas se separan x su forma, tamaño y densidad y la separación

Centrifugación zonal es estabilizada x una gradiente de concentración

Si los componentes subcelulares se colocan sobre una solución

salina diluida, sedimentan a velocidades diferentes según su
tamaño. Para estabilizarlos frente a la posible mezcla x
convección en el interior del tubo, la solución contiene un suave
gradiente continuo de sacarosa que aumenta de concentración
hacia el fondo del tubo. Cuando se sedimentan a través de este
gradiente de sacarosa diluido, los diferentes componentes
celulares se separan en bandas discretas que se recogen x
separado, después de un tiempo apropiado. Después de un tiempo
adecuado de centrifugación, las bandas pueden ser recogidas
pinchando el tubo de centrifugación de plástico y recogiendo las
gotas de la parte inferior del tubo.






equilibrio de sedimentación

Separación según densidad de flotación (independiente de su tamaño o forma). La muestra se dispone x

encima o se mezcla con una gradiente más pronunciada y de mayor concentración de sacarosa o cloruro de
cesio. Al centrifugar, cada componente se desplazará hacia arriba o abajo hasta alcanzar una posición de su
misma densidad.










Gradiente discontinuo sacarosa o

cloruro de cesio moculas o complejos Las bandas se separan por una
proteicos marcados con isotopos perforación en la base del tubo

Separación de proteínas




Proteínas difieren
en:
Tamaño
Forma
Carga

Solubilidad o
afinidad x otras
moléculas

Las proteínas son muy diversas. Difieren en tamaño, forma, carga, hidrofobicidad y afinidad por
otras moléculas. Todas estas propiedades se pueden aprovechar para separar unas proteínas de
otras y poder estudiarlas individualmente







cromatografía

• Método de separación de moléculas basado en las diferencias

existentes entre su estructura y/o composición.
• Los compuestos a separar lo hacen sobre un soporte estacionario
(denominada fase estacionaria)
• Los distintos niveles de interacción entre fase estacionaria y las
moléculas (denominada fase móvil) permitirán a estas ultimas
migrar lenta o rápidamente a través del soporte.
• Separaciones cromatográficas: soportes: silica inmovilizada en
placas de vidrio (cromatografía de capa fina), gases volátiles
(cromatografía de gases), papel (cromatografía de papel), líquidos
(cromatografía liquida).


Cromatografía en columna

la muestra es una solución que contiene una mezcla de diferentes moléculas

Debido a que los diferentes

compuestos de la muestra
viajan a diferentes
velocidades a través de la
columna se pueden
fraccionar en varios tubos


















electroforesis en gel de poliacrilamida

Las proteínas generalmente poseen carga

eléctrica neta dependiendo de los aminoácidos
que la forman. Un campo eléctrico aplicado a
una solución con la proteína produce que esta
migre a una velocidad que depende de carga,
forma y tamaño.

cuando se aplica un campo eléctrico a una solución que contiene moléculas proteicas, éstas migrarán en una
dirección y a una velocidad en función de su tamaño y su carga neta. Esta es la base de la electroforesis
Las cadenas polipeptídicas forman un complejo
con las moléculas negativas de SDS y migran a
través del gel de poliacrilamida . Debido a la
velocidad de migración es mayor mientras más
pequeño sea el polipéptido , esta técnica se puede
usar para determinar el tamaño molecular
aproximado del polipéptido y también los
tamaños y cantidad de subunidades .

isoelectroenfoque Separa proteínas de acuerdo a su punto isoeléctrico (PI), el Ph al

cual la proteína tiene carga neta 0
electroforesis bidimensional
Separa proteínas de acuerdo a su punto
isoeléctrico (isoelectroenfoque) y su peso
molecular (SDS-PAGE)


técnicas con anticuerpos


La molécula de anticuerpo: Los anticuerpos son proteínas
que se unen muy firmemente a sus dianas(antígenos).

Las producen los vertebrados como una defensa contra la
infección. Cada molécula de anticuerpo consta de dos
cadenas ligeras idénticas y de dos cadenas pesadas

idénticas, de modo que los centros de unión al antígeno
son idénticos


Especificidad de los anticuerpos: Cada animal puede
fabricar miles de miles de millones de moléculas de

anticuerpos diferentes, cada una de las cuales tiene un
lugar diferente de unión a un antígeno con gran
especificidad.

la técnica elisa

Es una técnica de inmunoensayo en la cual un antígeno inmovilizado se detecta mediante

un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable con color.