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FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y ALIMENTARIAS

QUÍMICA FARMACÉUTICA
BIOTECNOLOGÍA 2019-2
PROFESOR: Daniel E. Areiza
ESTUDIANTE: Lina M. Palacios M.
26-06-2020

ESTUDIO DE CLONACIÓN Y ACTIVIDAD DE METABOLIZACIÓN IN VIVO DE CYP3A4


EN RESIDUOS DEL FÁRMACO AMIODARONA: UNA POSIBLE OPCIÓN PROBIÓTICA
Y TERAPÉUTICA.

JUSTIFICACIÓN

La amiodarona es un fármaco antiarrítmico que figura como medicamento esencial. Se usa


ampliamente para tratar arritmias ventriculares. La parte problemática de dicho fármaco es que se
asocia con toxicidad extra cardíaca, ya que tiene una fuerte afinidad por acumularse en tejido adiposo,
bazo, hígado y pulmones.

Existes un conjunto de enzimas que juegan un papel importante para el metabolismo de fármacos y
sustancias xenobióticas nocivas, como lo son las CYP450, por lo cual, estás pueden llevar a la
eliminación de residuos de medicamentos.

OBJETIVO

En el estudio se buscaba desarrollar una cepa recombinante de Saccharomyses cerevisiae OBS2 con
potencial probiótico y terapéutico, que sobre-expresara CYP3A4 mejorado, in silico, para la
degradación de los residuos de amiodarona in vitro e in vivo.

MATERIALES Y MÉTODO
Mejora in silico de CYP3A4.

Se utilizó una base de datos para obtener la estructura proteica del CYP4503A4. Se eligió la 1WOX
como estándar positivo para contrastar mutaciones que harían, teniendo presente parámetros como
resolución, estructura 3D y resultados del diagrama de Ramanchandran.

Estudio de acople

En esta fase, llevaron las secuencias de proteínas mutantes y silvestres a un software de modelado de
proteínas. Realizaron ciertos ajustes y acoplaron las anteriores con la molécula ligando (amiodarona).

Síntesis de ADN complementario

La secuencia de proteína mutante con mejor acoplamiento se tradujo inversamente a ARNm y


transcribió inversamente a ADNc, usando herramientas informáticas. Insertaron sitios de restricción
NheI y NotI. Posteriormente mandaron a hacer el vector portador, recibiendo al pUC57 con un
promotor lacZ y resistencia a kanamicina.

Estrategia de clonación del CYP4503A4 en Saccharomyces cerevisiae.

1. Inserción de sitios de restricción seleccionados en el vector lanzadera


No describen explícitamente la forma como construyeron el vector, sin embargo, es el proceso
conocido de amplificación por PCR, digestión con enzimas de restricción y posterior unión con ligasa,
según el autor citad. Así pues, el vector utilizado fue el p427TEF, el cual es un promotor con
kanamicina y ampicilina como factores de selección, y EcoRI, XhoI, como enzimas de restricción. A
demás construyeron y mandaron a hacer un gen sintético para insertar la enzima de restricción NotI, el
cual llamaron N1S. Se realizó análisis de restricción para ambos plásmidos, con EcoRI y XhoI,
visualizándose las bandas esperadas en la electroforesis en gel de agarosa. Posteriormente, N1S fue
unido al vector mencionando, formando el constructo p427TEF-N1S.

2. Inserción de la región de expresión extracelular

Adicionalmente, diseñaron otro gen sintético, ECE, con función de expresión extracelular de
levadura, con sitios de restricción EcoRI, NheI y NotI, kanamicina como marcador de selección. Tanto
a ECE como a p427TEF, les realizaron análisis con enzimas de restricción EcoRI y NotI. Luego
hicieron electroforesis en gel de agarosa, obteniéndose las bandas esperadas. Posteriormente, unieron,
utilizando la ligasa ADN T4, a ECE en p427TEF-N1S, formando el constructo p427TEF-N1S-ECE
(C3).

3. Clonación de CYP3A4 en constructo anterior.

El gen que codifica para CYP3A4, recordemos que fue el que mandaron a hacer inicialmente (pUC57
o pUC57-CYP). Para efectos prácticos, lo llamaremos CYP. Ahora bien, tanto CYP como C3 fueron
sometidos a análisis con enzimas de restricción, NheI y NotI. Luego, los fragmentos se unieron usando
la ligasa ADN T4, obteniéndose el constructo p427TEF-N1S-ECE-CYP, por practicidad, CYP
recombinante.

4. Transformación de CYP recombinante.

Prepararon células competentes de la cepa S. cerevisiae OBS2 con potencial probiótico y terapéutico.
Para la transformación utilizaron el método de electroporación. Las células transformadas fueron
recuperadas en un medio de 50 % sorbitol 1 M: 50 % YDP. Se incubaron a 30°C/1 h. Posteriormente,
las cultivaron en un medio selectivo que contenía geneticina como factor de selección, por 30° C/48 h.
Teniendo en cuenta que el vector p427TEF tiene dicho factor, solo la levadura que porta el CYP
recombinante se esperaba que creciera. Después de dicho proceso, las células transformadas
(observadas como colonias traslúcidas) se seleccionaron y volvieron a exponer al mismo medio
selectivo con el fin de confirmar, así mismo, con enzimas de restricción NheI y NotI.

5. Estudios de expresión y actividad de CYP recombinante.

La proteína extracelular se extrajo del medio de cultivo con un tampón de extracción SDS,
centrifugación y posterior precipitación, según estudio citado. Se purificó y observó por SDS-PAGE.
La actividad se midió por la reducción del MTT, evidenciándose como aumento de la absorbancia por
espectrofotometría. Dicha actividad se observó como 108 UI/mL en 6 h de incubación.

6. Degradación in vitro de residuos de amiodarona.


La cepa recombinante, luego de haberse cultivado por alrededor de 6 h, se centrifugó y suspendió en
tampón de fosfato de potasio, a este se le agregó una concentración de amiodarona. La mezcla se
incubó a 37° C, recogiéndose muestras cada 2 h durante 8 h. La amiodarona residual se determinó
mediante RP-HPLC.

7. Experimentación in vivo.

Se realizó en ratas Wistar macho, adultas. Se mantuvieron 3 días enjauladas por separado, con acceso
a agua y alimentos. Luego de 24 h de ayuno las organizaron aleatoriamente en cuatro grupos: A, B, C,
D.
Las del grupo A estuvieron alimentadas normalmente y agua corriente por 48 h.
Las del grupo B fueron alimentadas normalmente y agua suplementada con amiodarona por 48 h.
Las del grupo C las alimentaron normalmente y agua suplementada con amiodarona. Luego de 48 h el
agua se reemplazaba con tampón de fosfato de sodio que contenía la cepa recombinante, durante 8 h.
Las del grupo de D fueron alimentadas normalmente, y tampón de fosfato de potasio que contenía la
cepa recombinante, por 48 h.

También se realizaron estudios ex vivo, para ello sacrificaron ratas de todos los grupos y recolectaron
órganos, para estudios histopatológicos. Se tomaron muestras de sangres para mirar efectos
probióticos y terapéuticos.

Resultados. (Remitirse a artículo)

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Banoth S, Tangutur AD, Anthappagudem A, Ramaiah J, Bhukya B. Cloning and in vivo metabolizing
activity study of CYP3A4 on amiodarone drug residues: A possible probiotic and therapeutic option.
Biomed Pharmacother [Internet]. 2020;127:110128. [cited 2020 Jun 26]. Available from:
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0753332220303206