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OPTIMIZACIÓN ESTADÍSTICA DE LA INMOVILIZACIÓN DE CÉLULAS DE LEVADURA EN

MAZORCAS DE MAÍZ PARA LA PRODUCCIÓN DE PECTINASA

Palabras clave: Elote, Pectinasa, Levadura inmovilizada, Diseño de Plackett-Burman, Geotrichum


candidum

RESUMEN

Se ha informado que las técnicas para inmovilizar las células microbianas para la producción de
enzimas industrialmente importantes ofrecen ventajas de rentabilidad, mayores rendimientos y
reciclabilidad. Teniendo en cuenta la importancia de las cepas de levaduras y la inmovilización, este
estudio se realizó para optimizar la condición para el proceso de inmovilización de una cepa de
levadura pectinolítica indígena, Geotrichum candidumAA15 en una matriz económica, Corncob (CB).
Varios parámetros que influyen en el proceso de inmovilización en CB fueron seleccionados por su
importancia utilizando una herramienta estadística llamada diseño de Plackett-Burman (PBD). Los
datos revelaron que la inmovilización más eficiente se produjo en CB tratado con álcali en el caldo de
dextrosa Sabouraud de pH 7.0 al inocular el 5% de inóculo de levadura sin agitar a 30 ° C. Las
células inmovilizadas produjeron 0,554 UI / ml de pectinasa que fue mucho más alta que la obtenida
de las células libres (0,215 UI / ml). Los parámetros que afectan la producción de pectinasa también
se estudiaron utilizando PBD y se encontró que las condiciones óptimas para la producción de
pectinasa por las células inmovilizadas incluyen temperatura de 25 ° C, pH 7, 2 piezas de CB con
células inmovilizadas, período de incubación de 48 h y medio de sal mineral que contiene 1% de
pectina y 1% de extracto de levadura en condiciones estáticas. Los títulos obtenidos en condiciones
optimizadas fueron 12 veces mayores que los obtenidos por las células libres. Además, las células
inmovilizadas retuvieron el 70% de la productividad hasta el tercer ciclo de producción. Este estudio,
por lo tanto, explora la posible aplicación biotecnológica de CB para la inmovilización de la cepa de
levadura para la producción posterior de una enzima industrialmente importante.

1. Introducción

1. Introducción

La pectina es un polisacárido complejo presente en las paredes celulares primarias en cantidades


que dependen del tipo de planta. Proporciona rigidez a la estructura de la pared celular ya que está
unida covalentemente a la hemicelulosa. Es una macromolécula heterogénea en términos de
estructura y masa. Su localización dentro de la planta afecta su composición (Ridley et al., 2001). Se
hidroliza por la actividad de despolimerización y desesterificación de un grupo diversificado de
enzimas denominadas colectivamente como pectinasas (Pedrolli et al., 2009). En las plantas, la
pectinasa juega un papel importante en la madurez al catalizar la extensión de la pared celular y el
ablandamiento de algunos tejidos (Sharma et al., 2012). Mientras que las pectinasas microbianas
encuentran numerosas aplicaciones comerciales, particularmente, para aumentar el rendimiento y la
claridad del jugo, la extracción de aceite y el proceso de fermentación. Degrada la pulpa de la fruta
para reducir la viscosidad en los jugos. También se usa para romper tejidos de frutas y verduras para
hacer alimentos para bebés (Gummadi y Panda, 2003).
Muchas bacterias y hongos filamentosos junto con pocas levaduras han sido explotadas para la
producción a gran escala de pectinasa. Las levaduras se usan ampliamente para muchos fines
biotecnológicos durante siglos, como en la producción de etanol. Se utilizan en industrias
alimentarias para diferentes propósitos (Zarzoso et al., 1998). En algunos casos, las levaduras son
preferidas a los hongos, ya que producen una mezcla homogénea de enzimas, lo que facilita los
procesos de purificación y se pueden obtener productos finales únicos.

Inicialmente, se informó actividad pectinololítica en algunos de los géneros de levadura, incluyendo


Candida, Saccharomyces y Pichia. Hasta ahora, él también se ha informado de actividad en algunos
otros géneros, por ejemplo en Saccharomycopsis, Kluyveromyces, Geotrichum, Cryptococcus y
Fabospora (Blanco et al., 1999) .Geotrichum candidum ha sido estudiado para la producción de
pectinasa bajo fermentación en estado sólido de orujo de uva (Illková et al., 2012). Sin embargo, los
informes de la literatura no describen la producción de pectinasa a partir de células inmovilizadas de
esta levadura.

Varios cientos de cepas microbianas se describen anualmente por su capacidad para producir
enzimas industrialmente importantes, sin embargo, muy pocos encuentran su aplicación en el sector
comercial. El costo de la producción de enzimas es uno de los principales factores que limitan tales

aplicaciones industriales. La producción de enzimas microbianas en condiciones sumergidas


generalmente se considera costosa y, por lo tanto, se llevan a cabo estudios.

Tabla 1

Diseño de Placket-Berman para la inmovilización de G. candidumAA15 en mazorca de maíz.


Se seleccionaron ocho factores que incluyen temperatura (° C), pH, número de piezas de
mazorca de maíz (CB), inóculo (como se describe en la sección del método), medio (caldo de
dextrosa de Sabouraud, SDB; extracto de levadura, YE), pretratamiento de CB (con ebullición
solamente o con ebullición y pretratamiento con álcali) agitación (a 150 rpm o sin agitación).

Para reducir el costo y / o mejorar los títulos. La inmovilización de la cepa microbiana es una de las
estrategias que se ha descrito para obtener rendimientos más altos con gastos sustancialmente
reducidos. La inmovilización puede describirse como atrapamiento, adsorción o unión de células o
enzimas a una matriz sólida inerte. El proceso se ha utilizado para aumentar el rendimiento en
procesos industriales y para estabilizar el catalizador. De hecho, un proceso basado en células
inmovilizadas se puede operar en un modo continuo y proporciona una mayor consistencia del
producto, mayores tasas de fermentación y una menor pérdida de producto. Las células
inmovilizadas en un reactor continuo se pueden usar para lograr una mayor densidad celular que
finalmente aumenta la productividad del biorreactor continuo (Almeida et al., 2003; Pieter et al.,
2006). Algunos materiales de desecho, como el bagazo de caña de azúcar (SB) y la mazorca de
maíz (CB) pueden usarse como transportadores para la inmovilización. CB es un residuo aparte de
las hojas, las cáscaras y los tallos de maíz. La estructura de la mazorca de maíz es porosa y en
forma de panal. Los materiales porosos proporcionan una gran superficie y microtubos para el
atrapamiento de las células (Djordjevićet al., 2016). Este material lignocelulósico puede usarse como
un material de soporte potencial de bajo costo para la inmovilización de microorganismos.
Anteriormente, se ha utilizado para la inmovilización de Saccharomyces cerevisiae para la
producción de etanol a partir de jugo de sorgo dulce en fermentación de lotes repetidos (Laopaiboon
et al., 2012).

Aunque se han llevado a cabo muchos estudios para optimizar las condiciones para el proceso de
inmovilización de varias matrices, los factores que afectan la inmovilización interactúan de manera
diferente cuando se varía la matriz y / o la cepa. Por lo tanto, estos generalmente están optimizados
para obtener una inmovilización efectiva y mayores rendimientos. La optimización de los factores
operativos utilizando herramientas estadísticas se considera un proceso rápido y requiere menos
mano de obra, ya que ofrece menos ejecuciones experimentales. Proporciona un conocimiento
significativo sobre la interacción entre los factores (Selvam et al., 2014). PBD es un diseño de
detección eficaz y recomendado para identificar parámetros significativos de una lista de
componentes candidatos

Y condiciones. Es un diseño factorial de dos niveles para detectar componentes y condiciones


medianas que influyen positivamente en la producción de enzimas (Cui y Zhao, 2012; Salihu et al.,
2011; Raman et al., 2015). Este trabajo describe la optimización estadística de las condiciones para
la inmovilización de G. candidumAA15 en CB y para la posterior producción de pectinasa.

2. Materiales y métodos

2.1. Microorganismo y preparación de inóculo

La cepa de levadura, Geotrichum candidumAA15 se aisló previamente de una muestra de mayonesa


en el Departamento de Microbiología, Universidad de Karachi, y se recuperó en placas de agar
dextrosa (SDA) de Sabouraud. Para la producción de pectinasa, el inóculo se preparó transfiriendo
una colonia aislada a matraces Erlenmeyer de 250 ml que contenían 50 ml de SDB (Oxoid). Los
matraces se incubaron a 30 ° C durante 24 h.

La densidad del cultivo se determinó tomando densidad óptica (OD) a 600 nm usando un
espectrofotómetro y se ajustó a 1.0 OD600. Para la producción de pectinasa a partir de células
libres, el inóculo se transfirió a medio de sal mineral que contiene pectina (MSM; Mandels y Weber,
1969) o a otro medio según lo indicado por diseño de Plackett Burman, mientras que para la
inmovilización, el inóculo se usó como se describe en la siguiente sección.

2.2. Inmovilización de la levadura en mazorca de maíz (CB)


El CB se usó como matriz, se adquirió localmente y se cortó en trozos de 0,5 ± 0,1 cm3 con un
cuchillo, se lavó con agua corriente y luego se hirvió durante cinco minutos seguidos de secado a 45
° C durante 24 h (Lakkana y Pattana, 2012).

Para el pretratamiento con álcali, se colocaron piezas de CB en hidróxido de sodio (NaOH) al 1% (p /


v) a una velocidad de 50 ml / g a temperatura ambiente durante 24 h, se lavaron repetidamente con
agua corriente para neutralizar el pH y luego se secaron al horno. A 60 ° C durante 24 h (Zlatina et
al., 2011).

Se agregaron dos (o seis) piezas de CB y 2% o 5% de inóculo (como se describió anteriormente) en


50 ml de SDB o extracto de levadura y se incubaron durante 24 o 48 horas a una temperatura de 25
° o 30 ° C según lo indicado por Placket -Burman

Diseño (PBD; Tabla 1). Después de la incubación, las matrices que contienen células de levadura
inmovilizadas se recogieron asépticamente y se almacenaron en 50 ml de tampón de citrato de sodio
(pH 4,8; 50 mM) bajo refrigeración o fueron utilizados inmediatamente para la producción de
pectinasa.

2.3. Producción de pectinasa por células libres e inmovilizadas

Las matrices que contenían células inmovilizadas de diferentes ciclos experimentales (véase más
arriba) se transfirieron a 50 ml de medio de producción y se incubaron a 25 ° C durante 24 h sin
agitar. Después de la incubación, los contenidos se centrifugaron y se analizó el sobrenadante de
cultivo libre de células (CFCS) para el ensayo de pectinasa. Al considerar los títulos de pectinasa, se
determinaron las mejores condiciones para la inmovilización.

En consecuencia, la inmovilización se llevó a cabo en condiciones óptimas y se utilizaron matrices


para estudiar la producción de pectinasa. Los factores que afectan la producción de pectinasa se
estudiaron usando un PBD separado (Tabla 2). El efecto de siete factores, a saber, temperatura (25
o 30 ° C), pH (5 o 7), período de incubación (24 o 48 h), tamaño del inóculo (2 o 6 piezas de CB con
células de levadura inmovilizadas), concentración de pectina (0,75% o 1%), medio (MSM con pectina
o con pectina y extracto de levadura), agitación (bajo incubadora con agitación a 150 rpm o sin
agitación) en

Tabla 2
Diseño de Placket-Berman para la producción de pectinasa por células inmovilizadas. Se
seleccionaron siete factores que incluyen temperatura (° C), pH, inóculo como número de
piezas de mazorca de maíz (CB) con células de levadura inmovilizadas, concentración de
pectina (%), agitación (a 150 rpm o sin agitación), período de incubación (durante 24 o 48 h) y
medio (medio de sal mineral, MSM con pectina, P o MSM con P y extracto de levadura, YE).

Se estudió la producción de pectinasa por células inmovilizadas. El número deseado de CB como


inóculo se transfirió al medio de producción y los experimentos se llevaron a cabo según lo indicado
por el PBD. Después de la incubación, se eliminó el CB con células inmovilizadas y se analizó la
actividad de pectinasa en CFCS, mientras que CB se transfirió a medio fresco en condiciones
similares para determinar los títulos de pectinasa después del segundo ciclo.

Asimismo, las matrices separadas del segundo ciclo se procedieron para el tercer ciclo de
producción. La comparación de la eficiencia de las células inmovilizadas con la de las células libres
también se realizó adoptando el

Mismo PBD (Tabla 2) para las células libres. En este caso, el inóculo se preparó de acuerdo con las
condiciones mencionadas en el experimento 4 (Tabla 2). Las células se transfirieron al medio de
producción y se incubaron. Después de la incubación, las células se separaron por centrifugación a
4000 × g durante 20 min y se analizó la actividad de pectinasa en CFCS. El pellet se transfirió al
medio fresco para el segundo ciclo de producción.

De manera similar, el pellet obtenido después del segundo ciclo de producción se procedió para el
tercer ciclo de producción. El CFCS obtenido después de cada ciclo se analizó para determinar la
actividad de pectinasa.

2.4. Ensayo enzimático

El ensayo de pectinasa se realizó determinando azúcares reductores según lo descrito por Miller
(1959). Se incubaron CFCS (25 \ mu l) y 25 \ mu l de pectina al 0,5% (en tampón de citrato de sodio
50 mM, pH 4,8) a 37ºC en un baño de agua durante 30 minutos. La reacción se detuvo mediante la
adición de 150 µl de DNS y se hirvió durante 5 minutos. Después de enfriar en baño de hielo, se
añadieron 720 µl de agua destilada. OD550 fue medido contra blanco. El blanco se preparó usando
CFCS inactivado por calor.
Una unidad internacional de pectinasa se definió como la cantidad de enzima que libera 1 µmol de
ácido galacturónico por minuto en las condiciones de ensayo estándar.

2.5. Microscopía electrónica de barrido (SEM)

El SEM de CB no tratado, tratado previamente con álcali y con células inmovilizadas (después del
ciclo de producción del primer, segundo y tercer ciclo) se recogió y se secó en un horno a 60 ° C
durante la noche. Las muestras se revistieron con un revestimiento de oro de 250 A de espesor
utilizando Ion Sputtering Device, JEC-1500, JEOL USA.

Luego, las muestras se analizaron mediante el Microscopio electrónico de barrido analítico, JSM-
6380 A, JEOL USA, disponible en el Laboratorio de Ciencias Centralizadas de la Universidad de
Karachi. Las imágenes fueron tomadas en

Diferentes aumentos, como 200, 300, 400,500, 700 y 1500 × a un voltaje de 10 kV.

3. Resultados

La tecnología celular inmovilizada (ICT) se ha aplicado para la producción industrial de enzimas de


levadura. El confinamiento de las células a una región específica preserva la actividad biocatalítica y
hace que las células sean reciclables (Djordjevićet al., 2016). Considerando la importancia de la
inmovilización, una cepa de G. candidumAA15 se inmovilizó en un barato marix, CB. Los factores
que afectan la inmovilización se estudiaron utilizando una herramienta estadística popular, PBD, que
se considera un enfoque matemático eficaz para determinar el efecto de los parámetros en la
respuesta de un proceso.

Se generó PBD para investigar el efecto de ocho factores en el proceso de inmovilización de G.


candidumAA15 en CB. Se tomó la respuesta en forma de títulos de pectinasa (UI / ml) y se controló
la eficiencia del proceso (para producir títulos de pectinasa) durante tres ciclos de producción. La
mayor producción de pectinasa (0.554 UI / ml) fue

Obtenido en la prueba experimental 4 (Tabla 3), donde la inmovilización de la levadura usando


inóculo al 2% se realizó dentro de las 24 h en seis piezas de CB pretratada con álcali en SDB de pH
7.0 a 30 ° C sin agitación. Este rendimiento de pectinasa fue 2,5 veces mayor que el obtenido de las
células libres, sin embargo, el rendimiento se redujo al 58% en el segundo ciclo de producción.

En la prueba experimental 10, se obtuvo un título de 0,408 UI / ml, donde se realizó la inmovilización
de inóculo de levadura al 2% en seis piezas de CB hervida en SDB de pH 7 a 25 ° C durante 48 h en
condiciones estáticas, es decir.

Sin agitación Las células inmovilizadas preparadas de esta manera retuvieron la actividad hasta 84%
en el segundo ciclo de producción. En condiciones experimentales muy diferentes (ejecución n. ° 7)
donde se realizó la inmovilización durante 48 h en 2 piezas de CB hervida a 25 ° C en medio de
extracto de levadura (pH 7) inoculado con 5% de inóculo, títulos mucho más bajos (0,207 UI / ml), sin
embargo, el rendimiento permaneció casi igual durante hasta el 3er ciclo. Por lo tanto, los títulos
bajos se pueden compensar reciclando la matriz.

El análisis estadístico detallado de los factores individuales (Tabla 4) reveló que con el valor p más
bajo, el medio utilizado para la inmovilización tuvo la mayor influencia en el proceso de
inmovilización, seguido por el período de incubación y el número de piezas de CB según el ranking
de la tabla de Pareto (Material suplementario, Fig. S1a). Algunos de los parámetros, como la
composición del medio o la temperatura, tienen un efecto inverso sobre la inmovilización, ya que al
aumentar el nivel, la eficiencia del proceso en términos de producción de pectinasa disminuyó
drásticamente, como lo muestran los valores T negativos (Tabla 4). Los datos para el primer ciclo de
producción se usaron para ANOVA y el rendimiento de las células inmovilizadas se comparó con las
células libres. Para las filas, el valor F fue mayor que el valor Fcrítico (Tabla 5) que mostró que había
una diferencia entre los 16 experimentos realizados. Para las columnas, había una gran diferencia.

Tabla 4

Análisis estadístico para PBD generado para la inmovilización de G. candidum AA15 en


mazorca de maíz.

* El valor T corresponde a la prueba T de Student y el valor P muestra el nivel de confianza.

Tabla 5

El análisis de varianza para PBD se ejecuta para la inmovilización de G. candidumAA15 en


mazorca de maíz

DF = grado de libertad; SS = Suma de cuadrados; ASS = suma ajustada de cuadrados; MSS =


suma media de cuadrados; F = función de los pescadores; P = Nivel de significación
correspondiente.

Entre el valor F y el valor crítico F que mostró la notable diferencia entre las UI / ml. min producido
por células libres e inmovilizadas. Sin embargo, un valor de p mayor que 0.05 mostró que la
diferencia no fue estadísticamente significativa.

Posteriormente, los siete factores que afectan la producción de pectinasa por G. candidumAA15
inmovilizado en CB fueron estudiados por PBD (Tabla 2). En la prueba experimental No. 7, donde se
agregaron dos piezas de matriz al MSM suplementado con pectina y extracto de levadura con pH 7
incubado a 25 ° C durante 48 h sin agitación, se obtuvieron los títulos más altos (0.333 UI / ml) que
permanecieron hasta 0.255 UI / ml hasta la tercera producción

Ciclo (Tabla 6). El experimento No. 11 difirió ligeramente del No. 7, donde se agregaron seis piezas
de matriz al MSM que contenía 1% de pectina con pH 5, los títulos más altos de 0.359 UI / ml se
obtuvieron primero

Ciclo de producción, sin embargo, el rendimiento cayó a 0.159 UI / ml en el tercer ciclo. Mientras que
los títulos más bajos (0,101 UI / ml) se obtuvieron en el experimento número 14.

El efecto de cada factor en la producción de pectinasa por células de levadura inmovilizadas se


analizó estadísticamente. El valor bajo para la desviación estándar mostró la confiabilidad de los
datos, sin embargo, los valores de p fueron mucho más altos que 0.05 y, por lo tanto, ninguno de los
factores fue significativo (Tabla 7). Pero cada factor ejerce su efecto con un grado variable y para
factores que incluyen medio, temperatura, pH e inóculo, los valores de T fueron negativos,
mostrando un efecto inverso de estos factores en la producción de enzimas. La tabla de Pareto
coloca la composición media en la parte superior indicando el mayor grado de efecto por este factor
(Material complementario, Fig. S1b). Los resultados de ANOVA mostraron que hubo una diferencia
significativa entre la productividad de la enzima obtenida en 16 experimentos, ya que para las filas, el
valor F fue mayor que el valor F crítico y el valor P también fue menor que el 0.05 (Tabla 8). Para las
columnas, el valor F fue menor que el valor crítico F y el valor P fue

Tabla 7

Análisis estadístico para PBD generado para la producción de pectinasa a partir de G.

candidumAA15 inmovilizado en mazorca de maíz

* El valor T corresponde a la prueba T de Student y el valor P muestra el nivel de confianza.

Tabla 8

El análisis de varianza para PBD se ejecuta para la producción de pectinasa a partir de G.

candidumAA15 inmovilizado en mazorca de maíz.

DF = grado de libertad; SS = Suma de cuadrados; ASS = suma ajustada de cuadrados; MSS =


suma media de cuadrados; F = función de los pescadores; P = Nivel de significación
correspondiente.

También mayor que el 0.05; demostró que no había una diferencia significativa entre el primer,
segundo y tercer ciclo de producción.

La importancia de la producción de pectinasa a partir de células inmovilizadas sobre células libres se


evaluó adicionalmente realizando los experimentos con las células libres manteniendo las
condiciones mencionadas en los experimentos No. 07, 11 y 14 (Tabla 2). Los experimentos fueron
elegidos por su mayor o menor productividad de pectinasa como se discutió anteriormente. Los
resultados mostraron que las células libres no podían producir títulos apreciables en condiciones
experimentales 7 y 14 (Material complementario, Tabla S1). Mientras que un título de 0.138 UI / ml
obtenido bajo el experimento 11, sin embargo, la producción disminuyó significativamente en el
tercer ciclo de producción.

Se observó que el valor F era mayor que los valores críticos F, lo que muestra que la media de UI /
ml.min producida por las células inmovilizadas es mayor que las células libres (material
suplementario, tabla S2). Los datos revelaron además que el valor P del modelo era inferior a 0,05;
demostró que había una diferencia significativa definida entre UI / ml de las células libres e
inmovilizadas. Para las columnas, el valor F fue menor que el valor crítico F, lo que demuestra que
no hubo diferencias significativas entre medios de 1 °, 2 ° y 3 ° ciclo de producción. El valor F fue
mayor que el valor F crítico para la interacción; mostró que no había una diferencia significativa al
considerar las células libres e inmovilizadas y su relación con los ciclos de producción.

La ultraestructura de CB se analizó mediante microscopía electrónica de barrido (SEM) para


observar los efectos de la inmovilización en CB. Las imágenes SEM revelaron una superficie rugosa
de CB no tratada y cambios en la superficie después del pretratamiento alcalino. Las estructuras CB
no tratadas y tratadas tienen muchas cavidades (Fig. 1a y 1b), que proporcionaron una jaula natural
para el atrapamiento de las células. Las imágenes del CB tratado, antes y después de la adhesión
celular (Fig. 1b y 1c) revelaron una inmovilización desigual en el material; fue más favorecido en
regiones específicas, tales como estructuras rugosas y porosas. También mostró degradación en la
matriz después del reciclaje durante tres ciclos de producción (Fig. 1d-f).

4. Discusión

Las levaduras inmovilizadas se han empleado para la producción de varias enzimas industriales que
incluyen  pectinasa (Almeida et al., 2003).

La producción de pectinasa a partir de células inmovilizadas proporciona varias ventajas, por lo


tanto, CB se usó como una matriz económica para inmovilizarG. candidumAA15.

El CB es un residuo generado después de prácticas agrícolas y procesos industriales que puede


usarse como combustible de baja calidad o para obtener algunos productos químicos de valor
agregado (Laopaiboon y Laopaiboon, 2012). En Pakistán, sin embargo, se producen millones de
toneladas de CB, el material no se utiliza de manera efectiva (Latif y Rajoka, 2001). En
consecuencia, el material permanece disponible a un precio muy bajo. La baja densidad de este
poroso El material junto con una buena capacidad de retención de agua lo convierten en candidato
adecuado para ser explotado para la inmovilización. Latif y Rajoka (2001) utilizaron CB como
sustrato para la producción de etanol y xilitol a partir de S. cerevisiae y Candida tropicalis. Sin
embargo, la inmovilización de G. candidumonCB no ha sido reportado en ningún proceso.

Las células inmovilizadas ofrecen varias ventajas sobre las células libres, lo más importante es que
el reciclaje de la matriz inmovilizada contribuye a reducir sustancialmente el costo que muchos
trabajadores han descrito. Por ejemplo, Yong et al. (2013) utilizaron fermentaciones de glucosa en
lote repetidas inmovilizadas de acetobutilaluminio de Clostridium para la producción de butanol. En
este estudio, se observó el mismo fenómeno cuando las células de levadura inmovilizadas retuvieron
el 70% de la productividad de pectinasa durante un quinto ciclo de producción (datos no mostrados).

El potencial de G. candidumAA15 por su inmovilización efectiva en CB y para la posterior producción


de pectinasa se evaluó mediante la adopción de una estrategia de dos capas en la que primero se
estudiaron los factores que afectan la inmovilización, seguido de la investigación de los factores que
afectan la producción de pectinasa de las células inmovilizadas. Inicialmente,

Se generó PBD para evaluar el efecto de ocho factores sobre la inmovilización. PBD se utiliza para el
cribado inicial de los ingredientes y para comprender su importancia en la formación del producto y
luego se seleccionan ingredientes significativos para una mayor optimización (Salihu et al., 2011;
Raman et al., 2015).

Como los datos revelaron que la inmovilización más eficiente ocurrió en CB tratado con álcali en
SDB de pH 7.0 al inocular levadura al 5% a 30 ° C sin agitar. Los resultados experimentales
revelaron que había una notable diferencia entre la pectinasa producida por las células libres
inmovilizadas (0.554 UI / ml) y (0.214 UI / ml). En un estudio anterior también se informó una mayor
productividad de pectinasa de células de levadura inmovilizadas en granos gastados (Almeida et al.,
2003).
El factor más importante que influyó en la inmovilización de la levadura en CB fue la composición del
medio. El uso de medio complejo (SDB) favoreció el proceso de inmovilización, que podría ser
atribuido a una mayor tasa de crecimiento y un menor tiempo de generación que generalmente se
observa en un medio complejo en comparación con el MSM (Sohail et al., 2009).

El proceso de inmovilización fue influenciado negativamente por la agitación. La agitación puede


revertir el proceso de inmovilización, particularmente cuando se emplea la técnica de atrapamiento o
adsorción. Anteriormente, las condiciones estáticas se habían demostrado mejores para la
inmovilización, ya que el uso de sistemas agitados no mejoraba la producción de etanol; más bien,
se observó una fuerte influencia negativa de la agitación en la adhesión de las células al CB no
tratado y las pieles de uva (Zlatina et al., 2011).

El tamaño del inóculo de la levadura debe ajustarse cuidadosamente porque si se usa el tamaño
pequeño del inóculo, entonces los organismos pueden demorar más tiempo en colonizar. Sin
embargo, por otro lado, un mayor tamaño de inóculo que contiene más células acelera el
crecimiento, pero puede dar como resultado el agotamiento de nutrientes o la agregación de células
y, por lo tanto, se puede observar una disminución en la producción de la enzima (Yoon et al.,
2014). En este estudio, el uso de inóculo al 5% produjo una mejor inmovilización.

Una mejor inmovilización en CB pretratada con álcali se puede atribuir a la modificación estructural
causada por el álcali como lo revela el análisis SEM. La estructura variable de la propia CB, fue
ventajosa para el proceso de inmovilización a medida que había más superficie disponible para la
unión de las células. Se ha observado un comportamiento similar durante la inmovilización de las
células en los granos gastados de la cervecera tratada (Brányik et al., 2001).

Fig. 1. Imagen de superficie de CB obtenida por SEM. De izquierda a derecha Imagen de


superficie de (a) CB no tratado (b) CB tratado con álcali (c) células inmovilizadas en CB (d) CB
inmovilizado después del primer ciclo de producción (e) inmovilizado CB después del
segundo ciclo de producción (f) CB inmovilizado después del tercer ciclo de producción.

Los mecanismos de inmovilización no solo dependen de las características de la superficie de los


portadores, sino que también dependen de las características de la superficie celular, el portador
utilizado y las condiciones operativas bajo las cuales se lleva a cabo la inmovilización (Kumar et al.,
2012). Las células de levadura se inmovilizan en la superficie de los materiales por adhesión. De
hecho, tales estructuras permiten que los microorganismos se adhieran más firmemente a la
superficie del material que las estructuras lisas. Este fenómeno también se ha informado en otros
estudios (Brányik et al., 2004; Kosaric y Blaszczyk, 1990; Yu et al., 2010).

Después de estudiar los efectos de los factores sobre la inmovilización, se generó otro PBD para
investigar el efecto de siete factores sobre la producción de pectinasa a partir de células
inmovilizadas. El proceso de inmovilización se llevó a cabo manteniendo las condiciones
mencionadas en el experimento 7 (Tabla 1). Se encontró que el factor contribuyente más importante
era el medio de producción. Los datos revelaron que se obtuvo una mejor producción de pectinasa
cuando se añadió 1% de pectina y 1% de extracto de levadura en MSM. El equilibrio entre las
fuentes de nitrógeno y carbono en los medios modifica fuertemente la tasa de crecimiento y la
formación del producto secundario, lo que influye en la densidad y la distribución de las células
inmovilizadas (Joset al., 1994).
La importancia de la temperatura para la producción de enzimas por las células libres es bien
conocida según lo informado por Yoon et al. (2014), donde Pcynoporus sanguineus mostró una
producción máxima de celulasa a 28 ° C, sin embargo, el crecimiento óptimo de los hongos se logró
a 37 ° C. En este trabajo, G. candidum AA15 mostró la producción máxima de enzimas a 25 ° C, sin
embargo, se obtuvo una inmovilización eficiente a 30 ° C.

Aunque, PBD se emplea habitualmente para detectar factores por sus efectos significativos en un
proceso. Sin embargo, en este estudio, PBD no sugirió ningún factor significativo que afectara la
inmovilización o la producción de pectinasa. En otro estudio, donde se utilizó PBD para la
optimización de composiciones de frita de borosilicato de lantánido, no se encontraron tendencias
notables con respecto a los componentes individuales (Mesko et al., 1996).

Esto indica que para sistemas relativamente robustos, PBD puede no proporcionar información de
factores significativos, sin embargo, aún se pueden observar mejoras en el rendimiento y se pueden
usar en futuros experimentos como se discutió por Yahya et al. (2016) Aquí, el uso del diseño de
PBD indicó las condiciones optimizadas para la producción de pectinasa por levadura inmovilizada.
No obstante, se observó un aumento en los títulos que el de los experimentos optimizados
previamente y se puede utilizar para futuros estudios.

5. Conclusiones

La cepa AA15 de Geotrichum candidum se inmovilizó en un desecho agrícola barato y fácilmente


disponible, mazorca de maíz y se observó una mejora en la producción de pectinasa de las células
inmovilizadas en comparación con las células libres. Las condiciones que afectan la inmovilización
de la levadura en la mazorca de maíz se optimizaron utilizando la herramienta estadística, diseño
Plackett Burman y la producción de pectinasa también se estudió utilizando la misma estrategia. Las
células inmovilizadas producidas conservaron su capacidad de producir pectinasa durante un
máximo de tres ciclos de producción.

- El biocatalizador utilizado fue Geotrichum candidum un hongo; usando la célula completa de


este, aplicando un proceso de inmovilización para aumentar la producción de pectinasa en
comparación con una misma celula pero libre
- se realizó para optimizar la condición para el proceso de inmovilización de una cepa de
levadura pectinolítica indígena, Geotrichum candidumAA15 en una matriz económica,
Corncob (CB)
- Los datos revelaron que la inmovilización más eficiente se produjo en CB tratado con álcali en
el caldo de dextrosa Sabouraud de pH 7.0 al inocular el 5% de inóculo de levadura sin agitar
a 30 ° C
- Las células inmovilizadas produjeron 0,554 UI / ml de pectinasa que fue mucho más alta que
la obtenida de las células libres (0,215 UI / ml)
- La inmovilización puede describirse como atrapamiento, adsorción o unión de células o
enzimas a una matriz sólida inerte.
- Geotrichum candidum ha sido estudiado para la producción de pectinasa bajo fermentación
en estado sólido de orujo de uva
- se aisló previamente de una muestra de mayonesa en el Departamento de Microbiología,
Universidad de Karachi, y se recuperó en placas de agar dextrosa (SDA) de Sabouraud. Para
la producción de pectinasa
- La cepa AA15 de Geotrichum candidum se inmovilizó en un desecho agrícola barato y
fácilmente disponible, mazorca de maíz y se observó una mejora en la producción de
pectinasa de las células inmovilizadas en comparación con las células libres
MIDSTREAM:
- que las condiciones óptimas para la producción de pectinasa por las células inmovilizadas
incluyen temperatura de 25 ° C, pH 7, 2 piezas de CB con células inmovilizadas, período de
incubación de 48 h y medio de sal mineral que contiene 1% de pectina y 1% de extracto de
levadura en condiciones estáticas.

- Las células inmovilizadas en un reactor continuo se pueden usar para lograr una mayor
densidad celular que finalmente aumenta la productividad del biorreactor continuo (Almeida et
al., 2003; Pieter et al., 2006). Algunos materiales de desecho, como el bagazo de caña de
azúcar (SB) y la mazorca de maíz (CB) pueden usarse como transportadores para la
inmovilización. CB es un residuo aparte de las hojas, las cáscaras y los tallos de maíz. La
estructura de la mazorca de maíz es porosa y en forma de panal. Los materiales porosos
proporcionan una gran superficie y microtubos para el atrapamiento de las células
(Djordjevićet al., 2016). Este material lignocelulósico puede usarse como un material de
soporte potencial de bajo costo para la inmovilización de microorganismos

UPSTREAM:
erlenmeyer

Después de la incubación, se eliminó el CB con células inmovilizadas y se analizó la actividad de


pectinasa en CFCS, mientras que CB se transfirió a medio fresco en condiciones similares para
determinar los títulos de pectinasa después del segundo ciclo y tercer ciclo

Las células se transfirieron al medio de producción y se incubaron. Después de la incubación, las


células se separaron por centrifugación a 4000 × g durante 20 min y se analizó la actividad de
pectinasa en CFCS. El pellet se transfirió al medio fresco para el segundo ciclo de producción.

De manera similar, el pellet obtenido después del segundo ciclo de producción se procedió para el
tercer ciclo de producción. El CFCS obtenido después de cada ciclo se analizó para determinar la
actividad de pectinasa.

El CB es un residuo generado después de prácticas agrícolas y procesos industriales que puede


usarse como combustible de baja calidad o para obtener algunos productos químicos de valor
agregado (Laopaiboon y Laopaiboon, 2012). En Pakistán, sin embargo, se producen millones de
toneladas de CB, el material no se utiliza de manera efectiva (Latif y Rajoka, 2001). En
consecuencia, el material permanece disponible a un precio muy bajo. La baja densidad de este
poroso El material junto con una buena capacidad de retención de agua lo convierten en candidato
adecuado para ser explotado para la inmovilización. Latif y Rajoka (2001) utilizaron CB como
sustrato para la producción de etanol y xilitol a partir de S. cerevisiae y Candida tropicalis. Sin
embargo, la inmovilización de G. candidumonCB no ha sido reportado en ningún proceso.

Sin agitación ya que le da un efecto adverso a la inmovilizacion

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