Está en la página 1de 5

TÉCNICA

Un método rápido, simple y humano para el sangrado


submandibular de ratones usando una lanceta

William T. Golde, PhD 1, Peter Gollobin 2 y Luis L.Rodriguez, DVM, PhD 1

Los métodos para obtener muestras de sangre de ratones tienden a ser difíciles, inhumanos o ambos. Los autores describen
una lanceta económica, desechable, de un solo uso para el sangrado submandibular de ratones que permite a los
investigadores extraer rápidamente 0.2–0.5 ml de sangre sin el uso de anestesia.

Cuando se usan animales pequeños, como ratones, los investigadores deben Un método simple para sangrar ratones es el clip de la cola, en el que se
poder adquirir muestras para analizarlas. Extraer muestras de sangre de corta un pedazo de la cola y se extrae sangre de la vena de la cola cortada.
ratones es un desafío debido al pequeño tamaño del animal. Aunque los Uno puede hacer esto repetidamente por algunas hemorragias secuenciales.
Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales aprobarán protocolos Una desventaja importante es que para dejar suficiente cola para varias
que incluyen varios métodos de recolección de sangre, ninguno es hemorragias futuras, la porción de la cola extirpada debe ser pequeña,
particularmente simple o humano. produciendo así una pequeña muestra de sangre de unas pocas gotas (<0.1
ml). Otro problema con este método es que podría conducir al canibalismo
En los Estados Unidos, el método de sangrado de roedores más entre los compañeros de jaula y no es del todo humano, especialmente para
común es el retroorbitario, que perfora el seno orbitario detrás del ojo. varias extracciones de sangre. Además, existe la técnica de laceración de la
Este método produce un volumen sanguíneo razonable (0.2–0.5 ml) cola en la que se restringe el ratón y se hace una incisión en la vena de la cola
cuando el investigador tiene experiencia en la ejecución del con un bisturí o una cuchilla de afeitar. Esta técnica produce hasta 0,5 ml de
procedimiento. 1) sangre. 3; sin embargo, generalmente requiere anestesia, y una incisión hecha
Sin embargo, una técnica deficiente puede cegar al animal, y varios demasiado profundamente puede complicar la reparación.
países han prohibido este método porque los funcionarios lo consideran
inhumano.
Otro método común es la punción cardíaca. Este procedimiento requiere
anestesia, lo que puede alterar los parámetros del experimento. Brevemente, Finalmente, un método más humano que se realiza sin anestesia es la
uno inserta una aguja de calibre pequeño en el ventrículo y extrae lentamente punción de la vena safena. 4) Este es un método complicado y lento que
la sangre. Este procedimiento requiere un investigador experto y se usa más implica inmovilizar a los animales con las patas traseras accesibles. El
comúnmente como un procedimiento de recolección de sangre terminal; sin investigador afeita el cabello de la superficie caudal del muslo con un
embargo, algunos investigadores pueden mantener vivos a los animales bisturí o una navaja de afeitar. La vena safena del muslo es visible, y se
durante varias recolecciones de sangre 2) Este no es un método simple y solo puede perforar con una aguja de calibre 23 a 25, luego se recoge la
es humano cuando el procedimiento va muy bien, dejando un daño mínimo a sangre con un tubo de recolección capilar de microvetas. Estos tubos
los tejidos cardíacos y pericárdicos a lo largo de la trayectoria de la aguja. tienen un volumen máximo de 0.3 ml. Una compresa sostenida en el sitio
Perder el corazón o pasar la aguja completamente a través del corazón detendrá el sangrado. Este es un método más humano de recolección de
podría provocar una hemorragia interna no detectada u otras complicaciones. sangre, y sin anestesia requerida no hay efectos secundarios a
Debido a que la posibilidad de perder animales es tan grande, los considerar. Sin embargo, este procedimiento es lento, requiere mucho
investigadores que eligen este método a menudo complementan la cantidad tiempo para trabajar con cada animal y no es compatible con grandes
de animales solicitados para la investigación a fin de acomodar la pérdida ensayos de productos farmacéuticos o biológicos. El tiempo requerido
durante un experimento. para hacer una prueba grande ( p.ej, 50–100 animales) causaría que los
investigadores

1 Plum Island Animal Disease Center, ARS, USDA, Greenport, NY 11944. 2 MediPoint Inc., Mineola, NY 11501. La correspondencia debe dirigirse a WTG (

wgolde@piadc.ars.usda.gov ).

ANIMAL DE LABORATORIO Volumen 34, N ° 9 | OCTUBRE 2005 39


TÉCNICA

Con un bisturí número 11, el investigador empuja la mejilla frente a él con


suficiente fuerza para crear un pequeño agujero de palo, de modo que las
gotas de sangre exudan desde el punto de penetración. Los tubos de
recolección de sangre utilizados pueden incluir o no gel de separación para
la recolección de suero y sangre completa, y heparina o EDTA como
anticoagulante. La posición del punzón es crucial para obtener un volumen
suficiente de sangre en muy poco tiempo, y con la práctica, el investigador
puede llegar a dominar el posicionamiento del bisturí. Se puede recolectar
hasta 0,7 ml de sangre de un ratón adulto, dependiendo de la frecuencia
del sangrado. Simplemente aplicando una gasa o tejido estéril con una
pequeña compresión durante menos de un minuto se detendrá el
sangrado. Después de soltar el mouse, se arreglará y en poco tiempo no
mostrará evidencia de extracción de sangre.

El problema con este método es que el control del bisturí durante el


proceso de apuñalamiento requiere un toque fino que proviene de
muchas repeticiones del procedimiento. Incluso después de mucha
FIGURA 1 El | El sangrado de la mejilla del ratón apunta a las venas retroorbitales y submandibulares que drenan la cara
práctica, el investigador a menudo no penetrará lo suficiente con el
del ratón en el punto en que se unen en el origen de la vena yugular.
bisturí, o peor aún, penetrará demasiado profundo y causará daño
tisular. Los investigadores que aún no son competentes o que solo
diseñe experimentos más pequeños con menos animales. Los investigadores sangran ocasionalmente ratones a menudo han tenido frustración con la
que describen este método limitan la cantidad de sangre recolectada a 0.3 ml, inconsistencia del procedimiento. Muy a menudo, la aplicación de
y en la práctica, los volúmenes de sangre recolectados son aún menores. Esto presión insuficiente produce poca o ninguna sangre. Una puñalada
comúnmente produciría ~ 0.1 ml de suero y limitaría el análisis a unos pocos demasiado fuerte corta la piel de la mejilla del ratón, lo que puede
ensayos de muy pequeño volumen. Hoff ha revisado ampliamente todas estas requerir intervención para detener el sangrado y posiblemente suturas;
técnicas 5) Esta complicación ahora eleva el procedimiento a cirugía menor. En
algunos casos, el bisturí atraviesa el interior de la mejilla, haciendo que
la sangre llene la cavidad bucal y poniendo al animal en peligro de
MÉTODOS DE PURGA SUBMANDIBULARES PARA RATONES muerte por aspiración de sangre y asfixia si el sangrado es profuso.
Hemos estado utilizando un método alternativo para extraer muestras de Además, al apuñalar por encima de la mandíbula, el investigador puede
sangre de ratones que es más rápido y humano. Este es un método que perforar el canal auditivo causando sangrado del oído.
han utilizado colegas durante varios años, pero requiere mucha práctica.
Un pequeño haz vascular en la parte posterior de la mandíbula
caracteriza la mejilla de los ratones de laboratorio ( Figura 1). Este es el
punto donde las venas orbitales, la vena submandibular y otras venas
que drenan la región facial se unen para formar el comienzo de la vena Una alternativa al bisturí es realizar el mismo procedimiento con
yugular. El investigador sostiene al animal por el cuello del cuello en el una aguja de calibre 19, 21 o 23, según el tamaño del mouse. Sin
aire para establecer la situación más relajada para el ratón. Utilizando embargo, las desventajas de las agujas son similares a las de los
escalpelos; por lo tanto, pueden causar laceraciones en la mejilla y
complicaciones similares a las citadas para el bisturí. Además, una
cantidad significativa de sangre se coagula dentro de la aguja, lo que
resulta en bajos rendimientos de sangre. Algunos investigadores han
utilizado este método con éxito, pero es difícil de aprender debido a la
necesidad de coherencia.

LANCET DE SANGRADO DE RATÓN

Ahora hemos desarrollado una lanceta de sangrado de ratón desechable,


estéril y de bajo costo para el método de sangrado submandibular.
Basamos este dispositivo en la lanceta estándar utilizada para tomar
muestras de sangre de los talones de los bebés o de la punta de los
FIGURA 2 El | (una) La lanceta sangrante animal Goldenrod se retiró del envoltorio estéril. ( si) La lanceta de sangrado
animal Goldenrod (tamaño de punto de 5 mm) en una envoltura estéril y el vaso de recolección de sangre (tubo Microtainer dedos de niños y adultos. Estas lancetas solo causan dolor momentáneo
de B / D vendido por Fisher Scientific).

40 Volumen 34, N ° 9 | OCTUBRE 2005 www.labanimal.com


TÉCNICA

FIGURA 3 El | (una) Colocando y empujando la mejilla con la lanceta. ( si) Recolectando sangre de la mejilla.

en el momento de la punción y no dejar daño tisular significativo, como lo muy ligeramente detrás de la bisagra de las mandíbulas, hacia la oreja. Uno puede

demuestra la disección del sitio 3 o 7 días después. Para usar en el sentir la mandíbula con la lanceta y debe evitar el hueso, en lugar de perforar la

procedimiento con el ratón, determinamos que la longitud de la lanceta mejilla justo detrás del punto en el que se unen las mandíbulas superior e inferior.

estándar de la punta del dedo, 3.0 mm, era demasiado corta. Produjimos Hemos descubierto que sujetar al animal por la piel entre los omóplatos en lugar de

y probamos lancetas de 4.0 mm y 5.0 mm ( Fig. 2a). En Figura 2b mostramosentre las orejas tiende a producir una menor distorsión de la piel y presumiblemente
la lanceta estéril envuelta en papel con el tubo de extracción de sangre, vasos sanguíneos en la cara. Debe haber suficiente fuerza en el empuje para insertar

un tubo microtainer B / D (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Como se rápidamente la punta en la empuñadura. Una vez que se ha hecho el palo, uno debe

muestra en Figura 3, el método es idéntico al método del bisturí, con la agarrar rápidamente el tubo de recolección, porque la sangre puede salir de la

ventaja de que las lancetas controlan la profundidad de la punción de la punción muy rápidamente y, a menudo, el flujo se ralentiza en muy poco tiempo. Para

piel de manera que hay un alto grado de consistencia en una extracción obtener descripciones más detalladas y un video de ejemplo, visite el sitio web del

de sangre con muy poco entrenamiento. Como se muestra en Figura 3a el proveedor (http://www.medipoint.com). El 5. Las lancetas de 0 mm proporcionaron los

punto de punción óptimo está en la parte posterior de la mandíbula del mejores resultados con muy pocos problemas además de encontrar la ubicación

mouse, adecuada para la punción de la lanceta. Los volúmenes de sangre que recolectamos

siempre fueron> 0.3 ml, y el sangrado podría detenerse una vez que recolectamos un

volumen suficiente. Las lancetas de 4.0 mm funcionaron muy bien en ratones jóvenes,

BALB / cy C57Bl / 6 de 2 a 6 semanas de edad, y las lancetas de 5.0 mm funcionaron

mejor para ratones adultos de 2 meses de edad y mayores. Para los investigadores

que realizan estudios a largo plazo o trabajan en el envejecimiento, desarrollamos una

lanceta de 5,5 mm para los ratones más grandes de 9 meses a años. Después del

procedimiento, el animal muestra poca evidencia de la extracción de sangre ( Las

lancetas de 0 mm funcionaron muy bien en ratones jóvenes, BALB / c y C57Bl / 6 de 2

a 6 semanas de edad, y las lancetas de 5.0 mm funcionaron mejor para ratones

adultos de 2 meses en adelante. Para los investigadores que realizan estudios a largo

plazo o trabajan en el envejecimiento, desarrollamos una lanceta de 5,5 mm para los

ratones más grandes de 9 meses a años. Después del procedimiento, el animal

muestra poca evidencia de la extracción de sangre ( Las lancetas de 0 mm

funcionaron muy bien en ratones jóvenes, BALB / c y C57Bl / 6 de 2 a 6 semanas de

edad, y las lancetas de 5.0 mm funcionaron mejor para ratones adultos de 2 meses en

adelante. Para los investigadores que realizan estudios a largo plazo o trabajan en el

envejecimiento, desarrollamos una lanceta de 5,5 mm para los ratones más grandes

de 9 meses a años. Después del procedimiento, el animal muestra poca evidencia de

la extracción de sangre ( Fig. 4), y después de un corto período de aseo no hay

evidencia del procedimiento. La lanceta del ratón elimina los problemas asociados con

el uso de un bisturí o una aguja al extraer sangre de la mejilla. Facilita el

procedimiento, lo que da como resultado cantidades consistentes de sangre de

aproximadamente entre 0.2 y 0.5 ml con pocas posibilidades de dañar al ratón. Con

FIGURA 4 El | El ratón después de sostener una compresa de gasa estéril en el sitio de sangrado durante 10-30 s. una presión firme durante el palo, nunca hicimos una incisión hasta el interior de la

boca. Esto proporciona al investigador la confianza para presionar lo suficiente como para que

ANIMAL DE LABORATORIO Volumen 34, N ° 9 | OCTUBRE 2005 41


TÉCNICA

y recuperar el volumen de sangre dentro de las 24 h. Sin embargo, el


sangrado diario puede tener un efecto sobre los eritrocitos y las
plaquetas. 4, cuál debe ser monitoreado. La lanceta de ratón también
permite un procesamiento relativamente rápido de muchos animales en
comparación con el método de sangrado de la vena safena, en el que el
investigador debe afeitarse a cada animal. Dispensar la necesidad de
anestesia elimina tanto los efectos sobre la fisiología animal como la
necesidad de atender a los animales a medida que disminuyen los
efectos de la anestesia. Además, los resultados de las pruebas en el
mismo animal de laboratorio son más precisos que los obtenidos con
diferentes animales que son genéticamente idénticos. Debido a que
este dispositivo de lanceta permite el uso del mismo animal para varias
pruebas, mejorará la reproducibilidad en ensayos con animales y
reducirá en gran medida la cantidad de animales necesarios.
Finalmente, este método de recolección de sangre no afecta a los
animales;

FIGURA 5 El | El clip de 50 lancetas cargado en el dispensador con el clip extraído para su uso. DISPENSADOR DE LANCET PARA USUARIOS DE ALTO VOLUMEN

El uso de la lanceta de sangrado estéril envuelto individualmente no es


práctico en algunas circunstancias. En particular, hay situaciones en las
Un toque excesivamente ligero ya no es un problema. Empujar demasiado alto que los investigadores están desangrando a cientos de ratones y el
en la cara puede conducir a la sangre en el canal auditivo, pero con una desenvolvimiento de cada lanceta no es práctico. Además, los científicos
experiencia mínima, los investigadores pueden ser expertos en evitar este error. que trabajan en ciertas condiciones de contención, como las cajas de
Al igual que con el sistema de aguja o bisturí, las lancetas se envuelven guantes, requieren una fuente de lanceta más accesible. Para los
individualmente y son estériles para eliminar la contaminación cruzada entre investigadores de uso especial, hemos desarrollado un sistema que
animales. A diferencia de los bisturís y las agujas, estas lancetas son dispensa un clip de 50 lancetas. Se puede esterilizar con vapor tanto el
relativamente económicas (aproximadamente $ 0.04 / unidad), y su uso único clip como el dispensador antes de usar. Una vez que el clip se ha abierto
es económico. y montado en el dispensador, el investigador puede extraer fácilmente
lancetas individuales con una sola mano ( Fig. 5).
Es importante tener en cuenta que con este sistema, se puede extraer
sangre del mismo ratón varias veces al día, así como a diario; Esto no es fácil
de hacer con ninguno de los métodos revisados ​anteriormente. Al realizar Este dispensador no solo se puede usar con una mano enguantada, sino que también

múltiples extracciones de sangre, los investigadores pueden ajustar el proporciona una entrega rápida de lancetas para el usuario de gran volumen.

volumen de sangre recolectada para el tamaño del animal, de modo que los
volúmenes diarios totales recolectados estén dentro del margen de seguridad La lanceta de sangrado animal para sangrado submandibular de la
recomendado para el animal. El volumen de sangre de un ratón varía con el mejilla de un ratón es de bajo costo y más conveniente que los
tamaño, pero generalmente es del 6 al 8% del peso corporal o de 6 a 8 ml por dispositivos utilizados en otros métodos ( Tabla 1). Suponemos que
cada 100 g de peso total. 4) Tomar 1 ml de sangre requiere reposición de todos los métodos requieren un tubo de extracción de sangre que
líquidos, pero los ratones toleran extracciones de 0.5 a 0.7 ml contenga gel de separación o anticoagulante, según lo requiera el
procedimiento. Además, la ausencia de anestesia proporciona más

TABLA 1. Una comparación de las técnicas de sangrado para ratones.

Método Dispositivo de anestesia Costo / dispositivo una Número de sorteos Otros dispositivos Tiempo /
posibles requeridos ratón

Retro-orbital No Capilar $ .04 4–5 No <1 min


Punción cardiaca si Jeringa y aguja $ .148 y $ .084 1–3 No 5–10
min
Vena safena si Aguja $ .068 > 10 si 5–10
min
Vena submandibular No Lanceta $ .045 > 10 No <1 min
una Precios de productos de Fisher Scientific, Pittsburgh, PA.

42 Volumen 34, N ° 9 | OCTUBRE 2005 www.labanimal.com


TÉCNICA

procesamiento rápido de ratones y sin efectos adversos en la fisiología EXPRESIONES DE GRATITUD

Las fotos fueron proporcionadas por E. Clark.


animal.
Por el costo, el tiempo requerido, las variables complicadas como la
DECLARACIÓN DE INTERESES COMPETENTES
necesidad de controlar a los animales que se recuperan de la anestesia y la Los autores declaran intereses financieros en competencia. Los tres autores son inventores de

cantidad de veces que un investigador puede sangrar al mismo animal, solo el la tecnología pendiente de patente descrita aquí, y desarrollada bajo un Acuerdo de
Investigación y Desarrollo Cooperativo entre el Departamento de Agricultura de los Estados
sangrado retroorbitario es tan oportuno y económico como el sangrado
Unidos, el Servicio de Investigación Agrícola y MEDIpoint, Inc.
submandibular. Incluso en este caso, solo son posibles unas pocas extracciones
de sangre mediante el sangrado retroorbital para todos excepto el investigador
más experto. Recibido el 23 de junio de 2005; aceptado el 12 de agosto de 2005.
Publicado en línea en http://www.labanimal.com.

RESUMEN
1) Fox, JG, Anderson, LC, Lowe, FM y Quimby, FQ (eds.).
La nueva lanceta de ratón para sangrado submandibular es un método Medicina de laboratorio animal 2nd Edn. (Elsevier Science, Nueva York,

humano, eficiente y económico para sangrar ratones de laboratorio. Se 2002).


2. Bertani, S., Gantier, JC, Chabaud, A. y Landau, I. Acción de la adrenalina en
han utilizado estilos similares de lancetas de sangre durante décadas
la circulación de los murinos. Plasmodium
para extraer sangre de muchas especies de mamíferos, especialmente etapas de desarrollo, en diferentes compartimentos sanguíneos. Parásito

humanos, lo que resulta en muy poco dolor, molestias y daños en los 11 (4) 343-350 (2004).
3) Fields, BT y Cunnigham, DR Una técnica de la arteria de la cola para recolectar
tejidos. Creemos que este método no solo mejorará el diseño científico
medio mililitro de sangre de un ratón. Lab Anim. Sci. 26 (3) 505-506 (1976).
y los resultados en estudios con ratones de laboratorio, sino que
también puede tener aplicación en otros animales de laboratorio, como 4. Hem, A., Smith, AJ y Solberg, P. Punción de la vena safena para tomar muestras de
sangre del ratón, rata, jerbo, cobaya, hurón y visón. Laboratorio. Anim. 32 (4) 364-368
ratas, hámsters y jerbos.
(1998).
5. Hoff, J. Métodos de recolección de sangre en el ratón. Lab Anim.
(NUEVA YORK) 29 (10) 47-53 (2000).

ANIMAL DE LABORATORIO Volumen 34, N ° 9 | OCTUBRE 2005 43