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k OFICINA ESPAÑOLA DE k

11 Número de publicación: 2 170 340


kInt. Cl. : C08B 30/12
19
PATENTES Y MARCAS
51 7

ESPAÑA A23L 1/0522


A61K 31/715

k
12 TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA T3
kNúmero de solicitud europea: 97309720.7
86
kFecha de presentación: 02.12.1997
86
kNúmero de publicación de la solicitud: 0 846 704
87
87kFecha de publicación de la solicitud: 10.06.1998

k
54 Tı́tulo: Almidón resistente fácilmente fermentable.

k
30 Prioridad: 03.12.1996 GB 9625129 k
73 Titular/es: CERESTAR HOLDING B.V.
Nijverheidstraat 1
NL-4551 LA Sas van Gent, NL

k
45 Fecha de la publicación de la mención BOPI: k
72 Inventor/es: Keitlitz, Bernd Wolfgang;
01.08.2002 Coppin, Jozef Victor Jean-Marie;
Roper, Harald Wilhelm Walter y
Bornet, Francis

k
45 Fecha de la publicación del folleto de patente: k
74 Agente: Elzaburu Márquez, Alberto
01.08.2002
ES 2 170 340 T3

Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletı́n europeo de patentes,
de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina
Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar
motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de
oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascı́culos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
ES 2 170 340 T3

DESCRIPCION
Almidón resistente fácilmente fermentable.

5
Campo técnico

La presente invención se refiere a una composición de almidón que contiene una alta proporción del ası́
llamado “almidón resistente” (RS). La composición de almidón resistente se caracteriza además por una
distribución especı́fica de las longitudes de las cadenas de la fracción RS y por una temperatura especı́fica
10
del pico de fusión de la Cromatografı́a Diferencial de Barrido (DSC) relativamente baja. La composición
muestra además un patrón de fermentación especı́fico que da como resultado un nivel incrementado de
n-butirato.

Antecedentes de la invención
15
Se sabe desde hace algunos años que una parte del almidón contenido en la dieta humana puede
pasar el intestino delgado sin ser digerido. Esta fracción del almidón de los alimentos se llama almidón
resistente. Se han encontrado diferentes formas de almidón que son resistentes a la digestión. Ha sido
creada una clasificación de almidones resistentes por Englyst y Cummings (Am. J. Clin. Nutr. (1987)
20
45 423-431). Estos autores distinguen entre tres tipos de almidones resistentes:
Tipo 1. Almidón fı́sicamente no digerible, por ejemplo granos y semillas parcialmente molidos,
Tipo 2. Gránulos de almidón resistente, por ejemplo patata cruda, plátano verde,

25 Tipo 3. Almidón retrogradado, por ejemplo patata cocida y enfriada, pan y copos de maı́z.
El enriquecimento efectivo de los alimentos con RS es posible mediante la adición de almidón proce-
sado que contiene un gran porcentaje de estructuras retrogradadas. El almidón se compone de amilosa y
amilopectina. Se sabe que la extensión de la retrogradación es función del contenido de amilosa. Calentar
y enfriar la amilosa provoca la aparición de almidón resistente. Debido a la estructura ramificada de la
30
amilopectina la cantidad de almidón resistente que se forma es decreciente con respecto al incremento
de la cantidad de amilopectina en el almidón. Sin embargo, la cantidad de RS se puede incrementar
desramificando la amilopectina antes de calentar. En vista de esto, los almidones con alto contenido
en amilosa (de maı́z) han sido elegidos como la fuente primaria de almidón resistente para los primeros
productos comerciales con elevado contenido de RS.
35
Los hidratos de carbono que no son digeridos enzimáticamente en el intestino delgado alcanzan el co-
lon donde son fermentados por la microflora anaerobia. Tales hidratos de carbono incluyen polisacáridos
distintos del almidón, almidón resistente (RS), oligosacáridos no digeribles y polisacáridos endógenos de
la mucosa. La fracción de almidón no digerida alcanza el colon donde se convierte en un sustrato para la
40 fermentación microbiana. Además de la producción de gases (H2 , CH4 , CO) se forman diferentes ácidos
grasos de cadena corta (SCFA) dependiendo del tipo de hidrato de carbono.

Los productos finales mayoritarios de la degradación bacteriana de hidratos de carbono son ácidos
grasos de cadena corta (SCFA: acetato, propionato y n-butirato). Los SCFA son absorbidos rápidamente
45 por las células epiteliales del colon. El propionato y el acetato son liberados por la membrana basolateral
a la circulación portal y pueden tener efecto lejos de su lugar de producción. El n-butirato sirve como
sustrato para la producción de energı́a en los colonocitos y afecta además a varias funciones celulares,
por ejemplo proliferación, sı́ntesis de membrana y absorción de sodio.
50 Acetato, propionato y n-butirato son los principales SCFA producidos a partir de oligo- y polisacáridos
no digeribles; las cantidades relativas de estos ácidos grasos dependen del tipo de hidrato de carbono.
Los SCFA se producen en el colon proximal en una proporción media de acetato:propionato:n-butirato
equivalente a 60:25:10 y en cantidades de mmol/l. Esta proporción, sin embargo, no es constante sino
que está determinada por el tipo de sustrato fermentado.
55
Se ha demostrado tanto in vitro como in vivo que la fermentación del almidón da lugar a altos niveles
de n-butirato. Las observaciones de que los niveles fecales de SCFA disminuyen para el almidón de patata
cruda (Mallet et al. (1988) Brit. J. Nutr. 60, 597-604; Levrat et al. (1991), J. Nutr. Biochem. 2, 31-36;
Mathers et al., (1991) Brit. J. Nutr. 66, 313-329) pero se incrementan para el almidón de maı́z de
60 alto contenido en amilosa subraya el hecho de que diferentes formas de RS tienen diferentes efectos en
términos de la producción de n-butirato en el colon.

2
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De acuerdo con Wyatt y Horn (1988) J. Sci. Food Agric. 44, 281-288, las fracciones de RS de los
almidones retrogradados de guisante y maı́z respectivamente muestran diferencias cuantitativas en la
fermentación in vitro pero sin cambios cualitativos en la composición de SCFA. Seis almidones crudos
diferentes mostraron también ser diferentes en la cinética de la fermentación in vitro. Al mismo tiempo la
5 proporción molar de n-butirato no se alteró. Varios estudios independientes in vivo de animales confirman
esto. Ası́, el origen del RS es importante para la fermentabilidad y en consecuencia para la cantidad de
n-butirato obtenida pero aparentemente no para la cantidad relativa.

Comparado con polisacáridos no digeribles tales como arabinogalactano, xilano y pectina, el RS pro-
10 duce una cantidad molar de n-butirato significativamente más grande (Englyst et al. (1987) en I.D.
Morton: “Cereals in a European Context”, Chichester, UK, Ellis Horwood Ltd., pp. 221-223). Esto se
considera importante debido a la aceptación general de que el n-butirato juega un papel importante en la
prevención de cánceres intestinales (por ejemplo cáncer colorrectal) como ha sido recientemente resumido
por Smith y German (Food Technology, (Noviembre de 1995) 87-90).El n-butirato parece ser un sustrato
15 preferido para los colonocitos normales y ayuda al mantenimiento de la integridad del colon.

El n-butirato inhibe el crecimiento de las lı́neas celulares de cáncer de colon. A nivel molecular,
el n-butirato provoca acetilación de histonas, favorece la diferenciación, induce la apoptosis y regula la
expresión de diversos oncogenes. In vivo el n-butirato incrementa la inmunogenicidad de las células de
20 cáncer de colon.

Se ha encontrado que sólo los polisacáridos no digeribles que están asociados con la producción de
altas concentraciones de n-butirato en el intestino grueso distal (salvado de trigo, almidón retrogradado
con alto contenido de amilosa (RS tipo 3) son protectores frente al cáncer colorrectal en un sistema
25 modelo de rata en el que las ratas se trataron con 1,2-dimetilhidrazina (McIntyre et al. (1993), Gut 34,
386-391; Young et al. (1996), Gastroenterology 110(2): 508-514). El salvado de avena, la goma guar, el
almidón de patata cruda (RS tipo 2), la celulosa y el salvado de trigo libre de almidón no tienen efecto
protector en este modelo de cáncer colorrectal (McIntyre et al. (1993), Gut 34, 386-391, Young et al.
(1996), Gastroenterology 110(2): 508-514).
30
A partir de los estudios anteriores parece que la cantidad de n-butirato producida en el colon es
importante. Lo que se necesita para un beneficio fisiológico máximo no es sólo un producto de almidón
con una alta cantidad de RS, sino una fracción de RS perfectamente fermentable que produzca altas
cantidades de SCFA con un elevado nivel de n-butirato. Se han descrito métodos para la preparación de
35 almidón resistente por ejemplo en las publicaciones siguientes.

El documento de la solicitud de patente europea EP 688.972 describe un método para obtener nive-
les incrementados de almidón resistente. Se demuestra que las cantidades más altas de RS se obtienen
cuando, tras una digestión enzimática, se lleva a cabo una retrogradación durante un perı́odo de tiempo
40 prolongado y a una temperatura relativamente baja. La cantidad máxima de RS que se pudo obtener
fue 51,8 % (en el ejemplo 3 de dicha solicitud).

La solicitud de patente internacional WO 91/07106 describe un método para obtener almidón resis-
tente en el que una etapa de retrogradación va seguida de hidrólisis enzimática. La etapa de retrogradación
45 se lleva a cabo a baja temperatura, para la amilosa a 4◦C y para el almidón a 8◦ C como se menciona en
la página 13. Además el proceso parte de almidón no degradado que puede ser tratado previamente con
una enzima desramificante.

La solicitud de patente europea EP 564.893 describe un método para obtener almidón resistente que
50 parte de almidón no degradado con alto contenido en amilosa. Se menciona que la temperatura del pico
de fusión de la DSC de este producto está en el intervalo de 115-135◦C y la cantidad de almidón resistente
está por debajo de 51 % y se correlaciona con el porcentaje de amilosa utilizado en el producto de partida.

Existe la necesidad de un producto basado en almidón que sea altamente fermentable y que dé lugar
55 a una cantidad incrementada de n-butirato en el colon. La presente invención proporciona tal producto
basado en almidón.

Sumario de la invención

60 La presente invención describe una composición basada en almidón que se caracteriza porque contiene
una alta cantidad de almidón resistente. La composición consiste en almidón parcialmente degradado
que ha sido sometido a un proceso de retrogradación y que contiene al menos 55 % (p/p) de almidón

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resistente a pancreatina, en la que el almidón resistente consiste en más de 50 % de alfa-glucanos con un


DP entre 10 y 35 y tiene una temperatura del pico de fusión por DSC inferior a 115◦ C. Preferiblemente,
la cantidad de almidón resistente es menor que 60 %.

5 El almidón parcialmente degradado se puede obtener mediante hidrólisis parcial amilolı́tica o ácida
del almidón seguida por desramificación enzimática. Un almidón parcialmente degradado preferido que
se utiliza como producto de partida es una maltodextrina con un equivalente de dextrosa (DE) inferior a
10 obtenida mediante degradación por alfa-amilasa y tratada adicionalmente con isoamilasa.

10 La presente invención describe también un método para obtener las composiciones basadas en almidón.
El método comprende las siguientes etapas:

a) hidrólisis parcial del almidón,

15 b) desramificación enzimática del almidón parcialmente hidrolizado,


c) inactivación de la enzima,
d) secado de la composición, en el que la retrogradación ocurre al mismo tiempo que la desramificación.
20
Preferiblemente la elevada cantidad de almidón resistente se obtiene sin una etapa de retrogradación
separada a baja temperatura.

La presente invención describe además la utilización de los almidones retrogradados parcialmente de-
gradados en la preparación de alimentos o composiciones de alimentos y alimentos o composiciones de
25
alimentos que contienen la composición basada en almidón.

Finalmente, la invención describe la utilización de una composición de almidón retrogradado parcial-


mente degradado para prevenir o tratar enfermedades del tracto digestivo colorrectal.
30
Descripción de las figuras

La Figura 1 es un ejemplo de cromatograma DIONEX de la fracción de almidón resistente de la


presente invención obtenida mediante digestión exhaustiva con pancreatina de maltodextrina de patata
desramificada (IRP) (medida de acuerdo con Carbohydr. Res. 215 (1991) 179-192).
35
La Figura 2 muestra el cambio de pH con el tiempo durante la fermentación in vitro de las fracciones
de RS de NoveloseTM, Euresta e IRP.

La Figura 3 muestra la formación de ácidos grasos de cadena corta durante la fermentación in vitro
40 de Novelose, Euresta e IRP.

La Figura 4 muestra la formación de n-butirato durante la fermentación in vitro de Novelose, Euresta


e IRP.
45 La Figura 5 muestra las curvas de DSC de los residuos de una bebida láctea obtenidos tras la digestión
con pancreatina de leche normal y leche con IRP añadida.

Descripción detallada de la invención


50 La presente invención describe una composición basada en almidón que se caracteriza porque contiene
una elevada cantidad de almidón resistente. La composición consiste en almidón parcialmente degradado
que ha sido sometido a un proceso de retrogradación y que contiene al menos 55 % (p/p) de almidón
resistente a pancreatina. Preferiblemente, la cantidad de almidón resistente es al menos 60 %. La fracción
de almidón resistente se caracteriza por contener alfa-glucanos con un grado de polimerización predo-
55 minantemente entre 10 y 35 y una temperatura del pico de DSC inferior a 115◦, preferiblemente entre
90-114◦C.

El almidón parcialmente degradado se puede obtener mediante degradación amilolı́tica o ácida de


almidón seguida por desramificación enzimática. Un almidón parcialmente degradado preferido es una
60 maltodextrina obtenida mediante degradación parcial con alfa-amilasa y tratada con una enzima desra-
mificante.

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Los almidones parcialmente degradados para ser utilizados como material de partida de la presente
invención se pueden obtener de cualquier fuente de almidón adecuada. Los almidones útiles se obtienen
de patata, trigo, tapioca y también se han utilizado almidones de maı́z de alto contenido en amilosa que
se convierten en maltodextrinas.
5
La presente invención describe también un método para obtener las composiciones basadas en almidón
de esta invención. El método comprende las siguientes etapas:
a) hidrólisis parcial del almidón,
10
b) desramificación enzimática del almidón parcialmente hidrolizado,
c) inactivación de la enzima,
d) secado de la composición.
15
La desramificación se realiza utilizando una enzima adecuada tal como isoamilasa o pululanasa, pre-
feriblemente mediante isoamilasa.

La etapa b) está acompañada preferiblemente por retrogradación. Alternativamente, el almidón se


20 puede retrogradar tras la inactivación de la enzima.

Un proceso preferido para obtener los productos de la presente invención comprende las etapas si-
guientes:

25 a) se disuelven las maltodextrinas (DE < 10, preferiblemente DE < 5) en agua,


b) se ajusta el pH y se enfrı́a la solución hasta una temperatura óptima para la actividad de la enzima
desramificante,
c) se añade la enzima desramificante y se incuba la mezcla,
30
d) se inactiva la enzima,
e) se seca la mezcla mediante pulverización,
f) se recoge el almidón resistente y opcionalmente se tritura.
35
Preferiblemente, la maltodextrina es una maltodextrina de patata o tapioca.

El proceso de la presente invención parte de un producto de almidón parcialmente degradado. Contra-


riamente a los procesos conocidos se encontró que no se requiere ninguna etapa separada de retrogradación.
40 La retrogradación ocurre al mismo tiempo que la desramificación. Esto tiene como resultado un proceso
más económico pues la retrogradación solı́a llevarse a cabo durante un perı́odo de tiempo prolongado
(hasta 48 horas) a baja temperatura. El proceso es por ello más rápido y barato.

Además el producto obtenido mediante el proceso inventado contiene una cantidad relativamente
45 alta de almidón resistente. Se encontró que este producto da lugar a una producción más elevada de
n-butirato, tanto relativamente con respecto a los otros ácidos grasos de cadena corta como en términos
absolutos que otros productos conocidos.

La presente invención describe además la utilización de los almidones retrogradados parcialmente de-
50 gradados en la preparación de alimentos o composiciones de alimentos y alimentos o composiciones de
alimentos que contienen la composición basada en almidón. El producto de almidón resistente se añade
a los alimentos o la composición de alimentos en una cantidad de hasta 20 % (p/p), preferiblemente de
hasta 10 %.
55 Las preparaciones alimenticias a las que se añade la composición basada en almidón de la presente
invención incluyen galletas, pan tostado, postres lácteos hasta 10 % de la composición basada en almidón
de la reivindicación 1.

Se demuestra que calentar durante la preparación del producto alimenticio no destruye significati-
60 vamente el producto. Esto quiere decir que sobrevive suficiente RS al tratamiento de la preparación
alimenticia que incluye el tratamiento UHT y el calentamiento en horno a 195◦C.

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La invención describe también la utilización de maltodextrinas desramificadas/retrogradadas en la


prevención de enfermedades del tracto digestivo colorrectal. En base al hallazgo de que el n-butirato
juega un papel importante en la prevención de cánceres intestinales (por ejemplo cáncer colorrectal),
como han resumido recientemente Smith y German (Food Technology, 1995 (noviembre) 87-90), se es-
5 pera que las maltodextrinas de la presente invención, debido a la producción a partir de ellas de elevadas
cantidades de n-butirato, ayuden al mantenimiento de la integridad del colon.

El presente producto de RS que tiene un intervalo especı́fico de distribución de las longitudes de las
cadenas de las estructuras retrogradas no sólo se fermenta más fácilmente sino que produce, en términos
10 absolutos y relativos, cantidades significativamente más elevadas de n-butirato que los productos de RS
derivados de los almidones convencionales con alto contenido en amilosa.

Para obtener las estructuras de RS (tras el tratamiento con pancreatina) que tienen más de 50 %
de la longitud de cadena especificada de 10-35 AGU, se necesita un material de partida adecuado. Los
15 autores de la presente invención han encontrado que una maltodextrina de patata de bajo DE forma
tras la desramificación enzimática y la retrogradación más de 30 % de RS, con mayor preferencia más de
40 % de RS. Las estructuras de RS posteriores a la digestión con pancreatina consisten en más de 50 %
de cadenas lineales de 10-35 alfa-glucanos. Se pueden utilizar también para este propósito otras mal-
todextrinas desramificadas/retrogradadas de bajo DE (por ejemplo de almidón de tapioca, maı́z, trigo)
20 como pueden serlo también las maltodextrinas obtenidas de almidones con alto contenido de amilosa.
Los almidones degradados por otros métodos (por ejemplo parcialmente hidrolizados con ácido) seguidos
por desramificación/retrogradación son también adecuados para este propósito.

Finalmente, la invención describe la utilización de una composición de almidón retrogradado parcial-


25 mente degradado para prevenir o tratar enfermedades del trato digestivo colorrectal.

La invención se ilustra mediante los siguientes ejemplos.

El ejemplo 1 muestra un método para obtener el almidón resistente de la presente invención. Se


30 disolvió en agua una maltodextrina comercial de patata a temperatura elevada, tras enfriar y el ajuste
del pH se desramificó la maltodextrina con isoamilasa. A continuación de la incubación se secó el mate-
rial mediante pulverización. Como se muestra en la Figura 1 el producto tenı́a una distribución de las
longitudes de las cadenas en la que la mayorı́a de las cadenas resistentes a pancreatina estaban entre DP
10 y DP 35. Se determinó que el contenido de almidón resistente era 56 %. Este producto se indica a
35 partir de aquı́ como IRP.

El experimento se repitió utilizando maltodextrina de tapioca y a mayor escala. Partiendo de 4200


kg de maltodextrina de tapioca se obtuvieron aproximadamente 3500 kg de producto secado por pulve-
rización que contenı́a 66 % de almidón resistente, tenı́a una temperatura de fusión en DSC de 112◦ C y
40 contenı́a 65 % de material que tenı́a un DP entre 10 y 35.

El ejemplo 2 muestra datos quı́micos y fı́sicos del almidón resistente de la presente invención del IRP
en comparación con los de Euresta-RS y NoveloseTM (National Starch & Chemical Comp.). Este ejemplo
demuestra que el IRP tiene un contenido de sacáridos con DP 10-35 significativamente más elevado y
45 una temperatura de fusión de los residuos de RS mucho más baja que los otros dos productos.

El ejemplo 3 describe ensayos de fermentación in vitro con tres composiciones diferentes basadas en
almidón;

50 IRP (obtenido de acuerdo con el ejemplo 1), Euresta y NoveloseTM (National Starch & Chemical Comp.).
Se encontró que el pH del medio de fermentación entre los tres productos de RS era diferente tras 4 ho-
ras de fermentación. La reducción del pH era más pronunciada para el producto del IRP que para los
de Euresta y Novelose. Tras 8 horas de fermentación persistı́a una ligera diferencia. Tras 24 horas de
fermentación los valores de pH eran idénticos (véase la Figura 2). Esto indica que el IRP se fermenta
55 mejor que los otros productos.

También se siguió la producción de SCFA y n-butirato. Las Figuras 3 y 4 muestras las cantidades de
SCFA y de n-butirato formadas durante la fermentación de las tres muestras. Parece que las heces que
contenı́an IRP dieron lugar a las cantidades más elevadas tanto de SCFA como de n-butirato.
60
El ejemplo 4 describe la adición de almidón resistente (IRP) a una bebida láctea. Se demuestra que
tras el tratamiento a Temperatura Ultra-Elevada el RS se puede determinar todavı́a en la leche. Puede

6
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concluirse que el RS se puede aplicar en los procesos normales de producción de alimentos sin necesidad
de adaptación de este proceso.

La invención se ilustra además mediante los siguientes ejemplos no limitantes.


5
Ejemplo 1

Preparación de maltodextrinas desramificadas y retrogradadas de bajo DE

10 A) A partir de maltodextrina de patata

La secuencia de reacciones para la producción del almidón resistente a partir de maltodextrina de


patata de acuerdo con la presente invención se da a continuación.

15 Se utilizó como material de partida maltodextrina de patata (MDx 01970 (DE 3) de Cerestar).

MDx 01970 45,9 kg (sólidos secos)


90 l agua del grifo =>
20 ?
disolver a 80◦ C durante 45 min.

44 l agua del grifo => solución de


25 ? maltodextrina 45 %

enfriar a 50◦ C
+ 300 ppm SO2 sobre =>
30
base seca de almidón
(como bisulfito sódico)
?
ajustar pH a 4,0
isoamilasa
(Hayashibara) =>
35
0,1 % base seca de almidón ?
incubación 48 h., con
agitación adecuada

?
inactivación
40
de la enzima 70◦ C, pH=3, 0,5 h

45
?
calentar a 60-65◦C durante el
secado por pulverización

?
secar por entrada aire: 200◦C
50 pulverización salida aire: 81◦ C
atomización con aire
caliente (80◦C)
? 16,4 l/h
55 Producto enriquecido en
almidón resistente (IRP)
35 kg (94,5 % sustancia seca)

Es evidente que no se tiene que partir de un producto seco, puede utilizarse directamente un pro-
60 ducto húmedo en el mismo proceso. Las condiciones de desramificación enzimática correspondı́an a las
condiciones proporcionadas por el proveedor para la desramificación casi total, se utilizaron alrededor de
59 unidades de actividad de la enzima/g de almidón.

7
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El producto del proceso indicado se caracterizaba por lo siguiente:


- un contenido de almidón resistente de 56 %,
- un peso molecular medio de 11340,
5
- una temperatura del pico de fusión por DSC del residuo de RS de 105◦ C
- la distribución de las longitudes de las cadenas tras la digestión del IRP con pancreatina se muestra
en la Figura 1.
10
La mayor parte del producto de almidón resistente consistı́a en alfa-glucanos con un DP entre 10 y
35.

B) A partir de maltodextrina de tapioca


15
Este ejemplo muestra la producción a gran escala de almidón resistente a partir de una maltodextrina
de tapioca (mandioca) de bajo DE (DE 2,5) que se describe. El proceso de desramificación se llevó a cabo
en un reactor de doble pared de 20 m3 . Se utilizó una maltodextrina recién preparada tras la dilución
hasta 25 % de sustancia seca. A continuación se muestra el esquema de reacción con más detalles:
20
Solución caliente de 4200 kg de sustancia
maltodextrina a 25 % seca

25
?
Enfriar a
52,7◦C

?
30 Ajuste del pH con HCl 10N
a 4,0

?
Adición de conservante como NaHSO3
35
(320 ppm SO2 )

?
Incubación con agitación Temp.: 51,7-54,0◦C
40 60 horas pH: 3,7-4,0

?
Inactivación de la enzima con HCl 10N
45 60◦C, 2 h, pH 2,07

?
Ajuste del pH con NaOH 4 %
50
pH 6,2; 62◦ C

?
Secado por pulverización 3500 kg (humedad 5 %)
Temp. entrada: 220◦ C
55
El análisis de las 3,5 toneladas de maltodextrina desramificada secada por pulverización dio los si-
guientes resultados:

· un contenido de almidón resistente de 66 %


·
60
un peso molecular medio de 7230
· una temperatura de fusión de DSC del residuo de RS de 112◦C

8
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· una distribución de las longitudes de las cadenas con 65 % en el intervalo entre DP 10 y 35

Ejemplo 2

5 Comparación de la composición y propiedades del IRP con otros productos de RS basados en almidones
retrogradados con alto contenido de amilosa

La siguiente tabla describe el contenido de RS, la distribución de las longitudes de las cadenas y la
temperatura del pico de fusión por DSC de IRP, Novelose y Euresta RS.
10

Muestra Contenido Tpico -DSC∗ DP<10∗∗∗ DP 10-35∗∗∗ DP>35∗∗∗


de RS∗∗(%) (◦ C) (%) (%) (%)

15 IRP 56 105 7,0 58,7 34,3


Novelose 57 128 4,4 35,0 60,6
Euresta 36 141 5,1 26,1 68,8

20 ∗
Medida de DSC: Se introdujeron 20-30 mg de almidón en un recipiente de DSC de acero inoxidable y se
añadió agua para dar lugar a un sistema de 20 % (p/p). El recipiente cerrado se calentó en un SETARAM
DSC 111 desde 20-160◦C a una velocidad de 3◦C/min. Se anotó continuamente el cambio de entalpı́a y
se registraron las temperaturas de transición caracterı́sticas.
25 ∗∗
Para las determinaciones de RS se utilizó el siguiente procedimiento:

Una suspensión a 5 % (p/p) del producto de almidón retrogradado se homogeneiza perfectamente en


una solución tampón de acetato. El tampón de acetato se prepara disolviendo 8,2 g de acetato sódico
anhidro en 250 ml de una solución acuosa saturada de ácido benzoico, añadiendo 4 ml de cloruro cálcico
30 1M y completándolo hasta 800 ml con agua destilada antes de ajustar el pH a 5,2 con ácido acético, y
completando finalmente hasta 1000 ml con agua destilada. Se incubaron 25 ml de la suspensión con 1
ml de solución pancreática durante 16 horas a 37◦ C en un baño de agua con agitación. La suspensión
incubada se mezcla por agitación a continuación con 119 ml de etanol a 95 %, se filtra, se lava dos veces
la pasta sobre el filtro con etanol a 80 % y se seca en un horno a 105◦ C. El contenido de RS se calculó
35 como sigue:

Contenido de almidón del residuo


RS (%) = x 100 %
Contenido de almidón de la suspensión antes de la incubación (sobre base seca)
40
La solución pancreática se prepara mezclando por agitación 2 g de pancreatina con 12 ml de agua
destilada durante 10 minutos, centrifugando y utilizando el sobrenadante como la solución pancreáti-
ca.
45 ∗∗∗
La distribución de sacáridos se analizó como se describe en Carbohydr. Res. 215 (1991) 179-192; este
método sólo mide sacáridos por debajo de DP 85. El contenido de sacáridos de DP > 85 se caracterizó
mediante cromatografı́a de exclusión por tamaño y las cantidades relativas de las diferentes fracciones se
calcularon tras la normalización.
50 Ejemplo 3

Fermentación in vitro de almidón retrogradado parcialmente degradado (IRP) en comparación con Nove-
lose y Euresta
55 Parte experimental

A. Material de partida

IRP (Cerestar): se preparó de acuerdo con el Ejemplo 1. Se recuperó el producto mediante secado
60 por pulverización. El producto contenı́a 56 % de RS y tenı́a una temperatura del pico de fusión por DSC
de 105◦C.

9
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Euresta-RS: se obtuvo almidón retrogradado mediante enfriamiento y almacenamiento de almidón


de amilomaı́z (Amylomaize VII, American Maize Products Comp.) cocinado simultáneamente a la ex-
trusión. Se sometió a cocción a 100◦C simultánea a extrusión amilomaı́z que contenı́a 50 % de agua,
seguida por un almacenamiento de 4 dı́as a 4◦ C, luego se secó y molió. El producto contenı́a 36 % de RS
5 y tenı́a una temperatura del pico de fusión por DSC de 141◦C.

Novelose: Este almidón es un almidón de amilomaı́z modificado (National Starch and Chemical Corp.),
enriquecido en RS. Contiene un 57 % de RS y tenı́a una temperatura del pico de fusión de DSC de
128◦C.
10
B. Método utilizado para la predigestión de productos de RS

Se ha llevado a cabo la purificación del RS para fermentación in vitro mediante digestión extensiva
del almidón con α-amilasa pancreática (Sigma, A-3176).
15
Se suspendieron 42,5 g de IRP, 72,7 g de Euresta ó 30,7 g de Novelose en un tampón de fosfato
estéril de pH 6,9 (300 ml, 400 ml y 700 ml respectivamente) y se introdujeron en un tubo de diálisis y
se añadió α-amilasa (10 mg/g de muestra). Los tubos se sumergieron entonces en 1 l de agua a 37◦C
y se mantuvieron durante toda la noche. Al dı́a siguiente, se añadió de nuevo la misma cantidad de
20 actividad de α-amilasa y tuvo lugar una segunda digestión durante toda la noche. Se centrifugaron las
muestras (10 min, 3000 rpm) y se lavaron varias veces. El sedimento (RS) se secó con congelación simultá-
nea.

C. Método utilizado para las fermentaciones in vitro


25
El método ha sido descrito extensivamente en otro sitio (Barry et al., Estimation of fermentability of
dietary fibre in vitro: a European interlaboratory study. Br. J. Nutr. (1995), 74, 303-322).

C1. Esquema general


30
Todos los experimentos se llevaron a cabo en un sistema in vitro por lotes. Las fermentaciones se
llevaron a cabo en viales utilizando un inóculo preparado a partir de heces frescas recogidas de volun-
tarios jóvenes sanos. Los voluntarios ingerı́an habitualmente una dieta normal, no presentaban ninguna
enfermedad digestiva y no habı́an recibido antibióticos durante al menos tres meses. Las variables de
35 fermentación se midieron en viales en los que se paró la fermentación a diversos tiempos.

C2. Inóculo

Se recogieron las heces de dos voluntarios no productores de metano en una botella protegida del am-
40 biente templada previamente durante 5 minutos con agua del grifo caliente (aproximadamente a 65◦ C).
Para eliminar el O2 , se insufló en la botella CO2 durante 5 minutos con un caudal de 100 ml/s y se reco-
gieron entonces las heces. Cuando se recibió en el laboratorio la botella protegida de contaminaciones, se
insufló CO2 en su interior. Se determinó entonces el peso de las heces. Se produjo el inóculo en la botella
protegida del ambiente añadiendo cinco partes de tampón nutritivo templado (37◦ C) a una parte de heces
45 (v/p). El medio nutritivo se preparó a partir de una solución de tampón carbonato-fosfato que contenı́a
(g/l): NaHCO3 9,240, Na2 HPO4 .12H2 O 7,125, NaCl 0,470, KCl 0,450, Na2 SO4 0,100, CaCl2 (anhidro)
0,055, MgCl2 (anhidro) 0,047, urea 0,400, con elementos traza añadidos (10 ml de la siguiente solución
(mg/l) por litro de solución final: FeSO4 .7H2 O 3680, MnSO4 .7H2 O 1900, ZnSO4 .7H2 O 440, CoCl2 .6H2 O
120, CuSO4 .5H2 O 98, Mo7 (NH4 )6 O24 .4H2 O 17,4). Antes de utilizarse, y durante la preparación del
50 inóculo, un burbujeo continuo de CO2 mantenı́a la anaerobiosis y aseguraba un pH constante. Se mezcló
la suspensión utilizando un aparato Stomacher (Laboratory Blended, Seward Medical, Londres) durante
2 minutos y luego se filtró a través de 6 capas de gasa quirúrgica. El inóculo se mantuvo en un baño de
agua a 37◦ C y se le burbujeó continuamente CO2 .

55 C3. Experimentos de fermentación

La fermentación se llevó a cabo por duplicado utilizando viales de 50 ml de polipropileno (Falcon,


Biolock). Excepto en los blancos (B), se pesaron en cada vial 100 mg (base de materia seca) de sustrato
experimental bien homogeneizado y se añadieron 10 ml de inóculo. El aire se desplazó mediante flujo de N2
60 libre de O2 . Después de enroscársele la tapa, se colocó el vial horizontalmente (tiempo 0) en un baño con
agitación. Se llevó a cabo entonces la fermentación a 37◦C y los resultados se estudiaron a 0, 4, 8 y

10
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24 h. Se utilizaron dos blancos para cada tiempo experimental. En cada tiempo experimental, se paró la
fermentación en los viales correspondientes mediante congelación instantánea (en hielo seco).

C4. Preparación de la muestra


5
Se midió inmediatamente el pH y se añadieron 10 ml de agua destilada. Entonces se centrifugó la
muestra durante 10 minutos a 3000 g. Se tomaron dos muestra de 1 ml de sobrenadante para deter-
minaciones de SCFA. Las muestras se mezclaron con 100 µl de solución de HgCl2 -H3 PO4 (1 %/5 %).
Las muestras para la determinación de SCFA y los precipitados para las determinaciones de almidón se
10 mantuvieron a -20◦ C hasta el momento del análisis.

Los SCFA se cuantificaron mediante el método de cromatografı́a de gases tal como ha sido descrito
por Jouany J.P. (Dosage des acides gras volatils (AGV) et des alcools dans les contenus digestifs, les jus
d’ensilage, les cultures bactériennes et les contenus des fermenteurs anaérobies. Sci. Alim., (1982), 2,
15 131-144).

Se cuantificó el almidón remanente mediante el método de Faisant et al. (Resistant starch determi-
nation adapted to products containing high resistant starch. Sci. Alim., (1995), 15, 83-89).

20 C5. Cálculo de ácidos grasos de cadena corta en las suspensiones

Se calculó la producción de Pi de cada SCFA para cada tiempo experimental como sigue:

Pi = (Si -So )-(Bi -Bo ),


25
donde Si y So son los valores de las concentraciones de SCFA en los viales que contenı́an los sustratos a
tiempo i y 0 respectivamente, y Bi y Bo son los valores de las concentraciones de los blancos a tiempos i
y 0 respectivamente.

30 Para cada tiempo experimental, se calculó la producción total de SCFA como la suma de la producción
individual de ácido acético, propiónico y n-butı́rico.

Resultados y conclusión de las fermentaciones in vitro

35 Se determinaron las cinéticas de fermentación midiendo el pH y la producción de los SCFA, por du-
plicado. Se observó el mismo patrón de fermentación para todos los parámetros y para cada producto
comparando con las medidas del duplicado.

A) Evolución del pH
40
El pH del medio de fermentación entre los tres productos de RS diferı́a tras 4 h de fermentación.
La reducción del pH era más pronunciada para el IRP que para los productos de Euresta y Novelose.
Tras 8 h de fermentación persistı́a un ligera diferencia. Tras 24 h de fermentación los valores de pH eran
idénticos (véase la Figura 2).
45
B) Producción de SCFA y n-butirato

Las Figuras 3 y 4 muestran la cantidad de SCFA y n-butirato formados durante la fermentación de


las tres muestras. Parece que las heces que contenı́an IRP dieron la cantidad más elevada tanto de SCFA
50 como de n-butirato. El IRP dio lugar a una producción de n-butirato más rápida de acuerdo con la
Figura 4: se produjeron más de 10 mmol/l en 4 horas. La Figura 3 muestra que también se incrementa
la cantidad de los otros SCFA.

Ejemplo 4
55
Preparación de bebidas lácteas sometidas a UHT con almidón resistente

Este ejemplo describe la utilización de la maltodextrina retrogradada y desramificada del ejemplo 1


en una bebida láctea de vainilla sometida a UHT. A continuación se da la receta estándar utilizada para
60 la preparación de la bebida láctea.

11
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Receta estándar:

Leche entera 1000 ml


5
Cóctel Satro∗ 12 g

Sacarosa 20 g

10
Dextrosa 20 g


Carragenano, vainilla, colorante

15 A esta fórmula estándar se le añadieron en un caso 30 g/l y en el segundo caso 60 g/l de IRP (véase
el ejemplo 1).

Los ingredientes se mezclaron y homogeneizaron a 50 bar. El tratamiento UHT se llevó a cabo con
calentamiento en placas a 137◦C durante 5 segundos. Con los productos se rellenaron asépticamente
20 botellas de 250 ml.

Tras enfriar hasta temperatura ambiente se caracterizaron los productos:

Producto Contenido de RS (%) Gusto y sensación en la boca


25

Estándar 0,0 muy lı́quido, sin regusto, sin


arenosidad

30 + 30 g IRP/l 1,0 sensación en la boca algo ma-


yor, más cremoso, sin regusto,
sin arenosidad

35 + 60 g IRP/l 1,95 el de mayor sensación en la bo-


ca, sin arenosidad

Los resultados muestran que la mayor parte del RS sobrevive incluso al procesamiento por UHT y
40
es detectable en el producto final utilizando el método mencionado en el ejemplo 3. Esto se confirma
además con las medidas de DSC (para el método véase el ejemplo 2) de los residuos obtenidos tras
digestión con pancreatina (véase la figura 5). La muestra preparada con 60 g/l de IRP muestra una
transición endotérmica fuerte con una temperatura del pico alrededor de 96◦ C mientras que el producto
estándar no muestra ninguna transición significativa en este intervalo de temperaturas. La utilización
45
de IRP no sólo incrementa el contenido de RS sino que mejora las propiedades organolépticas en grado
significativo. Debido al pequeño tamaño de las partı́culas no hay arenosidad y la utilización de IRP causa
la impresión de un contenido de grasas más elevado. El IRP puede por ello utilizarse con ventajas en
productos de bajo (o ningún) contenido en grasas para mejorar las propiedades sensoriales.

50

55

60

12
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REIVINDICACIONES

1. Una composición basada en almidón caracterizada porque contiene más de 55 % (p/p) de almidón
resistente (RS) a pancreatina, y en la que el almidón resistente consiste en más de 50 % de alfa-glucanos
5 con un DP entre 10 y 35 y tiene una temperatura del pico de fusión por DSC inferior a 115◦C.

2. Una composición basada en almidón de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el almidón resis-
tente tiene una temperatura del pico de fusión por DSC entre 90 y 114◦C.

10 3. Una composición basada en almidón de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada además


porque produce una elevada cantidad de ácidos grasos de cada corta, en particular n-butirato, cuando es
fermentada por los microorganismos que se encuentran normalmente en el intestino posterior humano.

4. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque se obtiene a partir de


15 almidón parcialmente degradado, que ha sido desramificado y retrogradado.

5. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque es maltodextrina des-


ramificada y retrogradada con un equivalente de dextrosa inferior a 10.

20 6. Una composición de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizada porque la maltodextrina se


deriva de almidón de patata o tapioca.

7. Una composición de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizada porque la maltodextrina se


deriva de un almidón seleccionado del grupo que consiste en almidón de alto contenido en amilosa, al-
25 midón de maı́z, trigo, tapioca y guisante.

8. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1, 2 ó 3, que consiste en un almidón parcialmente


hidrolizado con ácido, retrogradado y desramificado.

30 9. Una composición de acuerdo con la reivindicación 8 obtenida a partir de un almidón seleccionado


del grupo que consiste en almidón de patata, tapioca, maı́z o trigo.

10. Un método para obtener una composición de almidón de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, caracterizado por las siguientes etapas:
35
a) hidrólisis parcial del almidón,
b) desramificación enzimática del almidón parcialmente hidrolizado,

40 c) inactivación de la enzima,
d) secado de la composición,

en el que la retrogradación ocurre al mismo tiempo que la desramificación.


45
11. Un método de acuerdo con la reivindicación 10, que contiene las siguientes etapas:

a) se disuelve en agua una maltodextrina con un DE inferior a 10,

50 b) se ajusta el pH y se enfrı́a la solución hasta una temperatura óptima para la actividad de las enzimas
desramificantes,
c) se añade la enzima y se incuba la mezcla,
d) se inactiva la enzima,
55
e) se seca la mezcla por pulverización, y
f) se recoge el almidón resistente y, opcionalmente, se tritura.
60 12. Una preparación alimenticia caracterizada porque contiene hasta 10 % de una composición ba-
sada en almidón de acuerdo con la reivindicación 1.

13
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13. La utilización de un producto de acuerdo con la reivindicación 1, en preparaciones alimenticias


para mantener el colon/recto en un estado sano y para prevenir enfermedades del tracto digestivo colo-
rrectal.

5 14. La utilización de un producto de acuerdo con la reivindicación 1, en preparaciones farmacéuticas


para la profilaxis o el tratamiento de enfermedades colorrectales.

10

15

20

25

30

35

40

45

50

NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE)
y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la
55 aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a
España y solicitadas antes del 7-10-1992, no producirán ningún efecto en España en
la medida en que confieran protección a productos quı́micos y farmacéuticos como
tales.

60 Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluı́da en la mencionada


reserva.

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