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Espectrofotometro PDF
Espectrofotometro PDF
Espectrofotómetro
Código (s) ECRI Denominación (es) ECRI
15-082 Espectrofotómetros de ultravioleta
15-083 Espectrofotómetros de luz visible/ultravioleta
15-084 Espectrofotómetros de luz visible
ESPECTROFOTÓMETRO
C
v0 =
Espectrofotómetro clásico n
http://ekoineko.nucleo.pl/en/spektofotometry.html#
107
donde: los que destacan la reflexión, refracción, di-
v= velocidad a través del medio por el fracción, absorción, difusión, polarización y
que pasa la luz otros que son utilizados en diversos instru-
n= índice de refracción del medio, cuyo mentos y dispositivos. La siguiente tabla
valor oscila, por lo general, entre 1,0 muestra los rangos de longitud de onda en
y 2,5 donde se utiliza el espectro luminoso para
realizar pruebas de espectrofotometría.
La energía electromagnética dispone de una
muy amplia gama de longitudes de onda. Al-
gunos ejemplos se muestran en la siguiente Región del Rango de la longitud de onda
espectro luminoso
tabla1:
Ultravioleta 10-200 nm (nanómetros)
1
Lobkowicz, F., Melissinos, A., Physics for Scientists and Engineers, vol. II, Philadelphia, WB SAUNDERS CO., 1975.
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Espectrofotómetro 11
El esquema muestra que la radiación incidente La absorbancia [A] se relaciona con la transmi-
[Io] sufre una serie de transformaciones. Parte tancia [T] mediante la siguiente ecuación:
de la misma se refleja [Ir], parte se transmite [It],
parte se difunde [Id] y parte se absorbe e incide 1 Io
A = Log10 = Log10 = Log1010ε x c x l = ε x c x l
directamente en fenómenos como la fluores- T IT
cencia [If]. Los fenómenos en los que se basa la
espectrofotometría son principalmente la absor-
ción y la transmisión. Para entender cómo se uti- El siguiente esquema explica el fenómeno de la
lizan, es necesario adicionalmente tener en absorbancia A:
cuenta la ley de Beer Lambert.
A=εxlxc
donde:
1
A= absorbancia medida A = Log
ε = coeficiente de absortividad molar T
[litros/moles/cm]
l = distancia de la trayectoria recorrida
por la luz dentro de la muestra
c= concentración de la muestra [moles/litros]
2
Instruction Manual, Spectrophotometer, SmartSpec 3000, Catalog Nº 170-2501.
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Gráfica absorbancia debido a la interacción electrostática entre
moléculas cercanas.
6. Radiación no monocromática.
110
Espectrofotómetro 11
Dependiendo del tipo de espectrofotometría, la Está diseñado para sostener la muestra que se
fuente luminosa puede ser una lámpara con fi- quiere analizar dentro del rayo de luz de longi-
lamento de tungsteno para luz visible, o una tud de onda determinada por el monocromador.
lámpara de arco de deuterio para luz ultraviole- El elemento que contiene la muestra es una cel-
ta. Algunos fabricantes han diseñado espectro- da o cubeta, por lo general, rectangular. Las cel-
fotómetros con lámparas intermitentes de xe- das o cubetas se fabrican de vidrio, si se requie-
nón de alta duración que emiten luz en el ran- ren efectuar estudios en el rango de los 340 a los
go de la luz visible y ultravioleta. La lámpara o 1 000 nm y de sílice, si el análisis está en el rango
lámparas vienen montadas de fábrica en una comprendido entre los 220 y los 340 nm. Tam-
base que permite asegurar una determinada bién hay celdas en materiales plásticos como es-
posición, para que se mantengan las condicio- tireno o poliestireno. El portador de muestras lo
nes de ajuste óptico y enfoque cuando está en diseñan los fabricantes de acuerdo al tipo de es-
operación o se requiere reemplazarla. La ener- pectrofotómetro y de muestra a analizar, por
gía radiante típica que emite una lámpara de ello se encuentran portadores de muestra con
tungsteno está entre los 2 600 y los 3 000 °K microceldas, aunque también tubos de ensayo y
(grados Kelvin). otras variantes como las celdas de flujo continuo.
Está compuesto por un conjunto de elementos. El sistema de detección puede estar diseñado
En general, dispone de una rendija o ranura de con fotoceldas, fototubos, fotodiodos o foto-
entrada que limita la radiación lumínica produ- multiplicadores. Esto depende de los rangos de
cida por la fuente y la confina en un área de- longitud de onda, de la sensibilidad y de la velo-
terminada, un conjunto de espejos para pasar cidad de respuesta requeridas. El sistema de de-
la luz a través del sistema óptico, un elemento tección recibe la energía lumínica proveniente
para separar las longitudes de onda de la ra- de la muestra y la convierte en una señal eléctri-
diación lumínica, que puede ser un prisma o ca proporcional a la energía recibida. La señal
una rejilla de difracción, y una rendija de salida eléctrica puede ser procesada y amplificada, pa-
para seleccionar la longitud de onda con la ra que pueda interpretarse a través del sistema
cual se desea iluminar la muestra. Las rejillas de de lectura. En la tabla que se incluye a continua-
difracción tienen la ventaja de eliminar la dis- ción, se presenta un resumen de las ventajas y
persión no lineal y son insensibles a los cambios desventajas de los dispositivos normalmente
de temperatura. usados en los sistemas de detección.
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ELEMENTO VENTAJAS DESVENTAJAS
Fotodiodos Carecen de partes mecánicas móviles.
Adquieren datos espectrales de forma simultánea.
Disponen de un rango dinámico amplio.
Brindan excelente reproducibilidad de la longi-
tud de onda.
Fotomultiplicadores Son más sensibles que los fototubos y las Pueden quemarse, si la luz diurna penetra
fotoceldas. cuando están trabajando.
Trabajan en rangos más amplios de longitudes Son costosos.
de onda.
Tienen respuestas más rápidas a los cambios Necesitan fuente de alto voltaje.
de intensidad luminosa.
No se agotan como las fotoceldas. Se usan solo en espectrofotómetros especializados.
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Espectrofotómetro 11
3
Castellanos, J., Sistema de capacitación técnica, Mantenimiento de equipo médico, Módulo Laboratorio Clínico,
submódulo 2, espectrofotómetro, Bogotá, Colombia, Fondo Nacional Hospitalario, División de Ingeniería y Mante-
nimiento, 1989.
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1. Revisar que la estructura de la mesa de tra- 1. Apagar el espectrofotómetro y desconec-
bajo, donde se encuentra instalado el es- tar el cable de alimentación eléctrica.
pectrofotómetro, esté en buen estado.
2. Usar una jeringa para limpiar el porta-
2. Comprobar la estructura general del es- muestras. Absorber la mayor cantidad de
pectrofotómetro. Verificar que los boto- líquido que pueda extraerse.
nes o interruptores de control, los cierres
mecánicos, estén montados firmemente y 3. Secar el portamuestras con un hisopo de
su señalación o identificación sea clara. algodón tipo medicinal.
3. Controlar que los accesorios estén limpios, 4. Utilizar papel especial para la limpieza de
no presenten grietas y su estado funcional lentes o un trozo de tela limpia de textura
sea óptimo. suave, libre de hilazas, para limpiar la ven-
tana de la fotocelda.
4. Confirmar que los elementos mecánicos de
ajuste –tuercas, tornillos, abrazaderas, 5. Limpiar el exterior del instrumento con
etc.– se encuentren ajustados y en buen una pieza de tela humedecida con agua
estado. destilada. Incluir la pantalla, los controles
y el teclado.
5. Revisar que los conectores eléctricos no
presenten grietas o rupturas. Comprobar
que están unidos correctamente a la línea. Limpieza de cubetas de cuarzo. Para man-
tener en buenas condiciones las cubetas de
6. Verificar que los cables no presenten em- cuarzo, se recomienda realizar el siguiente
palmes ni aislantes raídos o gastados. procedimiento:
7. Revisar que los cables, abrazaderas y ter- 1. Lavar las cubetas utilizando una solución
minales estén libres de polvo, suciedad o alcalina diluida como NaOH, 0,1 M y un
corrosión. Tampoco deben presentar des- ácido diluido tal como HCl, 0,1 M.
gastes o señales de mal estado.
2. Enjuagar las cubetas varias veces con
8. Examinar que el sistema de puesta a tierra agua destilada. Usar siempre cubetas lim-
–interno y externo– sea estandarizado, de pias cuando se requiere tomar medidas
un tipo aprobado, sea funcional y esté ins- de absorbancia.
talado correctamente.
3. Efectuar procedimientos de limpieza rigu-
9. Controlar que los conmutadores o inte- rosos y cuidadosos a las cubetas, siempre
rruptores de circuito, los portafusibles y los que se utilicen muestras que pudieran de-
indicadores, se encuentren libres de polvo, positar películas. Algunos fabricantes reco-
suciedad o corrosión. miendan utilizar detergentes especiales
para limpiar las cubetas.
10.Comprobar que los componentes eléctricos
externos funcionen sin sobrecalentamientos.
Cambio de baterías. Diversas clases de es-
pectrofotómetros utilizan baterías para man-
Mantenimiento general tener en memoria datos asociados a los aná-
lisis como fecha y horas. El procedimiento es
Limpieza de derrames. En caso de que se similar en las diversas clases de equipo. Se re-
produzca un derrame en el sistema porta- comienda seguir este procedimiento:
muestras, debe limpiarse el derrame median-
te el siguiente procedimiento: 1. Verificar que en la pantalla del instrumen-
to aparezca la indicación de batería baja.
114
Espectrofotómetro 11
9. Ajustar nuevamente los datos de fecha y 10. Ajustar nuevamente los tornillos que ase-
hora. guran la tapa del compartimiento de la
lámpara.
115
que controla el estado y el funcionamien- BUENAS PRÁCTICAS DE USO
to del equipo, por lo que es fácil determi- DEL ESPECTROFOTÓMETRO
nar en qué momento es necesario cambiar
la lámpara. Efectuar el cambio de la lám- 1. Efectuar la calibración del espectrofotó-
para y realizar el ajuste posterior siguien- metro, cada vez que se realiza el análisis
do el procedimiento recomendado por el de un grupo de muestras.
fabricante.
2. Mantener cerrada la tapa del portamues-
4. Revisar el fusible de protección. Antes de tras durante el proceso de medición, para
abrir el alojamiento del fusible, compro- asegurar una lectura adecuada.
bar que el espectrofotómetro esté apaga-
do y que sus contactos se encuentren lim- 3. Evitar reutilizar las cubetas desechables.
pios y en buen estado. Si es necesario
reemplazarlo, colocar uno nuevo con las 4. Utilizar únicamente cubetas de cuarzo,
mismas características del recomendado para efectuar análisis por debajo de los
por el fabricante. 310 nm.
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Espectrofotómetro 11
resultados. Los fenómenos que afectan la c) Absorciones que no obedezcan la ley re-
ley de Beer son los siguientes: quieren dibujar una gráfica de estándares
a) Las altas concentraciones por asociación conocidos, que indicará lectura versus con-
molecular de especies iónicas. centración, de forma que la lectura de las
b) Variaciones en la hidratación a bajas incógnitas pueda ser relacionada a las con-
concentraciones producen cambios en la centraciones desde la gráfica.
naturaleza de los iones complejos.
Espectrofotómetro automatizado4
4
Instruction Manual, Spectrophotometer, SmartSpecTM 3000, Catalog Nº 170-2501, BIO-RAD Laboratories.
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PROBLEMA CAUSA PROBABLE REMEDIO
La lectura presenta fluctuaciones. Hay interferencias en el recorrido de la Verificar que la cubeta no presente rayones.
luz.
Verificar que no hay partículas flotando en la
cubeta.
Frotar las paredes de la cubeta con una pieza
de tela limpia.
Verificar que el rango seleccionado de trabajo
es adecuado para la muestra bajo análisis.
La lectura presenta valores negativos. No hay muestra. Añadir una muestra a la solución.
No hay lectura de absorbancia.
Colocación incorrecta de la cubeta. Verificar la orientación de la ventana de la
cubeta.
Selección errónea de la longitud de onda. Ajustar la longitud de onda al rango compati-
ble con el análisis.
Equipo calibrado erróneamente con Calibrar con una solución estándar o con agua
una muestra en lugar de una solución destilada.
estándar.
Espectrofotómetro no automatizado5
5
Seminario Taller Operación y Mantenimiento de Espectrofotómetros, Proyecto Subregional de Mantenimiento,
Convenio RE-HS-02, OPS/OMS.
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Espectrofotómetro 11
Ancho de banda. Rango de longitud de onda Nanómetro. Unidad de longitud que corres-
que es capaz de transmitir el monocromador. ponde a 10-9 m (una mil millonésima de me-
tro). Se identifica por el símbolo [nm]. Se usa
Coeficiente de absortividad molar [ε]. para medir longitudes de onda de luz visible
Medida para saber qué tan fuerte una sus- o ultravioleta.
tancia absorbe luz de una determinada longi-
tud de onda. Se conoce también como coefi- Refracción. Fenómeno de cambio de direc-
ciente de extinción molar. Cuando hay más ción que se presenta cuando un rayo de luz
de una sustancia absorbente en una solución, llega a la superficie de separación de dos
la absorbancia total es la suma de las absor- medios.
bancias de los distintos elementos presentes
en la solución. (A = ∫[Cx x εx + Cy x εy + ...])
Longitud de onda. Distancia existente entre dos Si se conoce el ángulo de reflexión [δ] y el es-
picos de una onda. La longitud de onda mantie- paciamiento [d] de las hendiduras, se puede
ne una relación inversa con la frecuencia, que determinar la longitud de onda [λ] de la luz,
puede entenderse como el número de picos que según la siguiente ecuación:
pasa por un punto en un tiempo determinado.
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∆ = diferencia en la longitud de onda de dos
ranuras adyacentes
Bibliografía
Castellanos, J., Sistema de capacitación técnica, Mantenimiento de equipo médico, Módu-
lo Laboratorio Clínico, submódulo 2, espectrofotómetro, Bogotá, Colombia, Fondo Nacio-
nal Hospitalario, División de Ingeniería y Mantenimiento, 1989.
Lobkowicz, F., Melissinos A., Physics for Scientist and Engineers, vol. 2, Philadelphia. W. B.
Saunders Company, 1975.
(http://www.biochrom.co.uk/images/spectro/ultro100pro_white.jpg)
(http://elchem.kaist.ac.kr/vt/chem-ed/spec/spectros.htm)
(http://en.wikipedia.org/wiki/Spectrophotometer)
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