UNIVERSIDAD DE LOS LLANOS

FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS E INGENIERIA

LABORATORIO DE BIOLOGÍA

GUIA DE LABORATORIO

UNIDAD
PROGRAMA DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL
ACDEMICA:

ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL

UNIDAD
BASES DE MICROBIOLOGIA
TEMATICA:

PRACTICA Nº 4: OBSERVACION MICROSCOPICA DE BACTERIAS

OBJETIVOS O PROPOSITOS

1. Realizar montaje de tinción de Gram para observar las diferencias entre

bacterias Gram positivas y bacterias Gram negativas.
2. Identificar el movimiento polar bacteriano.
3. Identificar la estructura de la capsula bacteriana mediante tinción negativa.
4. Observar la formación de endosporas por parte de bacterias del genero
Bacillus sp.

INTRODUCCIÓN

FUNDAMENTO TEORICO
En la identificación de los microorganismos, la determinación de su morfología, juega un
papel fundamental. Sus estructuras pueden ser lo suficientemente características como para
permitir el reconocimiento mediante un examen microscópico, teniendo como guía, la
descripción del microorganismo, lograda con base en una adecuada consulta bibliográfica.
Diferencias en cuanto a tamaño y coloración de los microorganismos, entre otros, hacen que
se presenten variaciones en las técnicas de montajes de tal manera que se logren buenas
observaciones-
En esta práctica se hace énfasis en algunas técnicas de montajes de uso frecuente y las
tinciones para la observación de bacterias.
TIPOS DE TINCIONES
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Tinción simple: Se usa solo colorante, se emplea cuando simplemente se desea observar
forma de bacterias, su disposición y tamaño relativo, sin mayores detalles de la estructura
interna.

Tinciones diferenciales: Permite distinguir diversas estructuras celulares y un tipo de

bacterias de otro. Supone el uso de colorantes y en la preparación final algunas estructuras o
tipos de células toman un color y el resto otro, se aplica un colorante primario, luego se hace
la diferenciación utilizando una solución que renueve este colorante de algunas estructuras o
tipos de células y a continuación se hace el contraste, aplicando un segundo colorante que es
tomado por las estructuras decoloradas.

Una tinción diferencial muy importante, es la tinción de Gram. La cual constituye un criterio
taxonómico en la diferenciación bacterial. Estas se dividen en dos grupos las Gram positivas
y las Gram negativas, el distinto comportamiento en la tinción se aplica en base a diferencias
en la pared celular. En términos generales estos dos grupos difieren en su reacción frente a
muchos agentes físico-químicos.

Tinción de endosporas: Las especies pertenecientes a los géneros Bacillus y Clostyridium

producen más estructuras muy resistentes reconocidas como endosporas, las cuales pueden
sobrevivir largos periodos en condiciones desfavorables. Pueden ser teñidas por un
procedimiento enérgico, en el que colorantes fuertes se ponen en contacto con las células
durante cierto tiempo, permeabilizando las paredes de las endosporas, mediante la aplicación
de vapor.

MATERIALES Y REACTIVOS

MATERIALES Y CANTIDAS SUSTANCIAS Y CANTIDAD

EQUIPOS REACTIVOS

Cultivo puro con 1 por toda la clase Colorantes de Gram bateria

E.coli

Cultivo puro con 1 por toda la clase Verde malaquita 1 gotero

Klebsiella sp

Cultivo puro con 1 por toda la clase Tinta china Unidad

Bacillus sp
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Cultivo puro de 1 por toda la clase Tubo con solución 1 por grupo
Staphylococcus salina 5 ml
aeurus

Laminas 1 caja

Laminillas 1 caja

Papel de arroz 1 libreta

Pipeta Pasteur 1 por grupo

plástica

Papel absorbente 1 por grupo

Asas redondas 1 por grupo

METODOLOGIA

Montaje en fresco, Observación de movilidad.

 Sobre un portaobjetos limpio y flameado, agregue una gota de solución salina estéril.
 Con un asa previamente flameada, tome una pequeña porción del microorganismo que
se encuentra en la caja de petri y extiéndalo sobre la gota del portaobjetos.
 Coloque un cubreobjetos, agregue aceite de inmersión y observe en 100X.
 Tena precaución que la gota sea pequeña para que no se rebose la muestra una vez se
coloque el cubreobjetos.

Tinción de endosporas.

 En un portaobjetos realice un frotis del microorganismo Bacillus sp. Y fije la muestra con
calor.
 Cubra la lamina con trozos de papel y adicione le colorante verde malaquita. De tal
manera que el papel quede impregnado con el colorante.
 Caliente la lamina durante 5 minutos evitando que se seque.
 Lavar con abundante agua el colorante
 Dejar que seque la lamina y agregar una gota de aceite de inmersión para observar al
microscopio con el objetivo 100X.

Tinción negativa o Tinta china para capsula.

 Coloque una gota de tinta china sobre un portaobjetos.

 Con el asa previamente flameada, tome una muestra del microorganismo y distribúyalo
sobre el portaobjetos con la tinta china.
 Deje secar al ambiente, adicione aceite de inmersión y observe en 100X.
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Tinción de Gram

 Realice un frotis y fíjelo con calor.

 Adicione el cristal violeta durante 1min, descarte el colorante y adicione abundante
agua sobre el portaobjeto.
 Añada el Lugol y deje actuar durante 1 min, descarte lave la lamina con abundante
agua.
 Posteriormente adicione el Alcohol acetona deje actuar durante 20 seg y lave.
 Por último adicione el colorante fucsina déjelo durante 20 seg, lave la lámina y
déjela secar.
 Coloque una gota de aceite de inmersión y observe en 100X.

Preguntas de complementación
 Identifique los tipos de movilidad de las bacterias.
 Que son las Archaeas.
 Porque las endosporas bacterianas resisten temperatura.
 Porque las endosporas pueden ser teñidas con verde malaquita?

BIBLIOGRAFIA
Madigan, M., Martinko, J., Parker, J. 1997 Brock Biologia de los microorganismos.
Decima edición. Prentice Hall, New Jersey.
Carrascal, A., Páez, A., Burbano, M.2003. Manual de laboratorio: Microbiología de
alimentos. Ceja.
Manual de medios de cultivo Merck. Editorial Merck Alemana. 1994.