Parte 4 Reacciones y reactores11 Reacciones homogéneas ‘El corazin de un bioproceso tipico es el reactor de fermentacién. Rodeado de las operaciones bdsicas que realizan los cambios ‘fisicos necesarios para la preparacién det medio de cultivo y para la recuperacién de las productos, el reactor es donde se producen ta ‘mayorta de las transformaciones quimicas'y bioquénicas, Las earactetsticas dela reaccién son las que determinan, en muchos biopracesos, 1a viabilidad econémica del proyecto. Las reacciones ca‘alfticas son unas de las reacciones que presentan mayor interés en los sistemas biol6gicos. Por de- finicin, un catalizador es una sustancia que afecta ala velo~ cidad de reacci6n sin alterarel equilibrio y sin experimentar ella misma cambio alguno. Enzimas, complejos de enzimas, 6rganos de eélulas y oélulas enteras (viables 0 no viables, con crecimiento o Sin crecimiento) actian como cataliza- dores. Los biocatalizadores pueden ser de origen microbiano, vegetal o animal. El crecimiento celular es una reaccidn ‘autocatalitica; es decir, el catalizador es un producto de la reacci6n. El rendimiento de las reacciones cataliticas se c racteriza por variables como la velocidad de reaccién y el rendimiento de producto a partir de un sustrato. Estos parimetros deben tenerse presentes en el disefto y operacién de los reactores de bioprocesado. En el andlisis ingenieril de las reacciones catalfticas se di- ferencia entre reacciones homogéneas y heterogéneas. Una reaccién se dice que es homogénea cuando la temperatura y todas las concentraciones del sistema son uniformes. La ‘mayorfa de las fermentaciones y reacciones enziméticas en recipientes mezclados son reacciones homogéneas. Por el contrario, las reacciones heterogéneas se producen en pre- sencia de gradientes de concentracién 0 de temperatura, El andlisis de las reacciones heterogéneas necesita la aplica~ cién de los principios de transferencia de materia junto con Ja teoria de Ia reacci6n. Las reacciones heterogéneas se tra- tan en el Capitulo 12, Este capitulo cubre los aspectos bésicos de la teorfa de la reaccién que nos permitira cuantificar Ia extensién y velo- cidad de las reacciones homogéneas, asf como identificar Jos factores mas importantes que afectan a la velocidad de reacci6n, 11.1 Teoria basica de las reacciones La teorfa de Ia reacci6n presenta dos partes fundamenta- les: la termodindmica de la reaccién y la cinética de la reaccién. La termodindmica de la reacci6n se refiere a cémo de lejos puede llegar la reaccién; es decir, la reaccién no puede continuar mas allé del equilibrio quimico, indepen- ientemente de lo répida que sea la reaccién, Por otro lado, Iacinética de la reaccién se refiere a la velocidad con que se produce la propia reaccién, 11.1.1 Termodinamica de las reacciones Considérese la reacci6n reversible representada por la si guiente ecuacién: AtbBe y¥+Z any A,B, Y yZson especies quimicas y b, yy zson coeficien- tes estequiométricos. Si se introducen los componentes en tn sistema cerrado durante un periodo infinito de tiempo, la reaccidn procede hasta aleanzar el equilibrio termodindmi- co. En el equilibrio no existe fuerza impulsora alguna para tun cambio posterior. En este punto la reaccién ha alcanzado el limite de su capacidad para la transformacién quimica en un sistema cerrado. La composicién de a mezcla en equili- brio viene determinada exclusivamente por las propiedades termodindmicas de los reactantes y de los productos y es independiente del camino utilizado para Hegar a tal situa- cin, Las concentraciones de equilibrio estén relacionadas ‘mediante la constante de equilibrio, K. Para la reacci6n de Ia ecuaci6n (11.1): coe K orca a donde C,.. Cy.» Cy, ¥ Cp, Son las concentraciones de equili brio de A,B, ¥ y Z, respectivamente. El valor de K depende de la temperatura de la siguiente manera: =A 113) Fa ai3) Ink=270 donde AG, es la variacién de energia libre estdndar por mol de A reaccionado, R la constante de los gases ideales y T la temperatura absoluta. Los valores de R se muestran en la Tabla 2.5 (p- 21). El superindice ° en AG,,, indica condi- ciones estindar. Generalmente, la condici6n estandar para ‘una sustancia es su forma estable a 1 atm de presi6n y 25 °C. ‘Sin embargo, para reacciones bioquimicas que se producen en disolucion deben utilizarse otras condiciones esténdac (1). 'AG?,, es igual ala diferencia de energfa libre estindar de {formacién, G*, entre productos y reactantes: AG?,, = yG + Gz — GR- 6G ata) ‘Las energias libres estéindar de formacién pueden encon- trarse en «handbooks» como los mostrados en el Apartado 26. ——— a S—rt—“‘“ié‘“‘—‘FOwtw;w™www Principios de ingenieria de los bioprocesos La energia libre G est relacionada con Ia entalpia H, la centropfaS y la temperatura absoluta T'de la siguiente mane~ AG ='AH- TAS as) Por lo tanto, de la ecuaci6n (11.3): Ink 1.6) Entonces, para las reacciones exotérmicas, con AMf,, Re gativo, K disminuye conforme aumenta la temperatura, Para Tas reacciones endotérmicas, con AH, positivos, Kaumenta conforme aumenta la temperatura. = TIA Efecto de Ia temperatura en Ja isomerizaci6n de Ia glucosa La glucosa isomerasa se utiliza ampliamente en Estados U reaceidn es: glacosa <> fructosa idos para la produccin de jarabe de fructosa concentrado. La Para esta reacci6n, AHf,, es 5.73 KI mol"'y ASi,, es 0.0176 ki mol" K° (a) Calcular las constantes de equilibrio a 50 °C y 75 °C. (b) Una compaaia desea desarrollar una mezela més dulee de azticares, es decir, con mayor concentracién de fructosa. Considerando tnicamente el equilibrio, gserfa mejor realizar la reacci6n a 50 °C 0a 75 °C? Solucién: {@) Comirtiendo las ternperaturas a grados Kelvin (K) mediante la férmula de la ecuaci6n (2.24): 323.15 K 348.15 K De la Tabla 2.5, R = 8.3144 J mob K-'= 8.3144 x 10° KI mol! Kt eee 5.73 kI mot (3144x107 KI 23.15 K) K(0°C) = 098 De igual manera, para T= 75 °C: -5.73 KJ mol"! at "(348.15 K) Utilizando la ecuacién (11.6) 0.0176 k5 mol"! K* 83144 x10™ ki mol K* 0.0176 ki mot"! K* 3144x107 kJ molt K™ (6) Cuando anmenta K también anmenta la frccién de fructosa en la mezcla de equilibrio, Por lo ants desde el punto de coin odindmico es mejor que el actor opere a 75°C. Sin embargo, también deberfan considerarse otros Factores Como, por ejemplo, Ia dessctivacién enzimitica que se produce a elevadas temperaturas,Reaceiones homogéncas Pocas conversiones enziméticas importantes a nivel co- mercial, aparte de la isomerizacién de Ia glucosa y de la hhidrOlisis del almid6n, se tratan como reacciones reversible. Enestos sistemas, la mezcla de la reacci6n en equilibrio con- tiene importantes cantidades de reactantes y de productos. Sin embargo, para muchas reacciones AG,,, es negativo y de ‘gran magnitud. Como resultado Kes también muy grande y la reacci6n favorece mis. los productos que los teactantes, por lo que la reaccién es considerada como irreversible. La mayoria de las reacciones enziméticas y celulares se inclu- yen dentro de esta categoria. Por ejemplo, la constante de ‘equilibrio para la hidrélisis de Ia sacarosa mediante invertasa es aproximadamente 10, mientras que toma un valor de 10°” para la fermentacién de la glucosa a etanol y didxido de car- bono. La relacién de equilibrio de productos a reactantes es, tan abrumadoramente grande para estas reacciones que se considera que se producen hasta completatse totalmente: es decir, la reaccién se para cuando Ia coneentracién de reactantes es cero, La termodindmica del equilibrio tiene, por tanto, una aplicacién limitada en las reacciones enzima- as y celulares. Ademis, los principios termodindmicos ‘mostfados en este apariado se aplican tinicamente a siste- ‘mas cerrados, mientras que el equilirio termodindmico real no existe en células vivas que intercambien materia con sus alrededores. En las células, los procesos metabélicos se en- cuentran en estado dindmico, de manera que los productos formados son continuamente extraidos 0 destruidos para que Ia reaccién continte. La mayorfa de las reacciones que se pproducen en sistemas biol6gicos continan hasta su final zacién en un perfodo finito de tiempo y con una velocidad finita. Si se sabe que se producira la conversién completa, el pparimetro de reaccién més til consiste en conocer la velo- ceidad a Ia que se produce la transformacién, Ora caracterfs- fica importante, especialmente para aquellos sistemas con ‘muchas reacciones diferentes y simulténeas, es Ia propor- cidn de reactante que se convierte en el producto deseado. Estas propiedades de las reacciones se discuten en lo que esta de capitulo. 11.1.2 Rendimiento de la reaccién La extensiGn en que los reactantes se convierten en pro- ‘ductos se denomina rendimiento de la reaccién. Generalmen- te, rendimiento es la cantidad de producto formado o acu- mmalalo por eannitad de veactante suminisiead o eonsoMNKe ‘do. Desafortunadamente, no existe una definicién concreta “gerendimicato, siendo varios los parimettos utlizados para inirfo en diferentes situaciones. Los términos utlizados, expresar rendimiento no son necesariamente aceptados ‘manera universal y aqui se han definido a nuestra conve~ 27 niencia, aunque en otros libros pueden encontrarse otras de- finiciones Considérese Ia reacciGn enzimética simple: tchistidina ~> écido urocénico + NH, a7) ceatalizada por histidasa. De acuerdo a la estequiometria de Ja reacei6n, se produce 1 mol de dcido urocénico por cada ‘mol de L-histidina consumida, por lo que el rendimiento de ficido urocénico a partir de histidina es 1 mol mot. Sin embargo, supdngase que la histidasa utilizada en esta reac cidn se encuentra contaminada con otra enzima, Ia histidina descarboxilasa, La histidina descarboxilasa cataliza la si- guiente reaccién: (1g) Si amas enzimas son activas, algo de t-histidina reaccio- nar con la histidasa de acuerdo a la ecuacién (11.7), mien tras que parte serd descarboxilada de acuerdo a'la ecuacién (11.8). Después de Ia adicién de las enzimas al sustrato, el anilisis de Ia mezcla de reaccién muestra que se producen 1 mol de fcido urocénico y 1 mol de histamina por cada 2.mol de histidina consumida. El rendimiento observado 0 rendi- ‘miento aparente de Acido urocénico a parti de t-histidina es Imol/2mol = 0.5 mol mol. El rendimiento observado de (0.5 mol mol" es diferente del rendimiento tedrico, verdade- 10 0 estequiométrico de 1 mol mot calculado a partir de 1a reaccién estequiométrica porque el reactante se ha canaliza- do en dos reacciones diferentes. Una situacién similar se produce si es el producto, en vez del reactante, el que se consume en otras reacciones. En este caso, el rendimiento observado del producto seré menor que el rendimiento te6- rico. Cuando reactantes 0 producios se ven involucrados en reacciones diferentes, el rendimiento observado puede ser diferente del rendimiento tedrico. El anilisis anterior nos conduce a fas dos definiciones mas tiles de rendimiento para los sistemas de reacci6n: histidina — histamina + CO, (masa o moles totales (endimiento teérico, eae aN verdadero 0 estequiométrico) _(Thasi o moles de reactante utilizado para formar ese determinado producto) (19) y {masa o mses Genie aarente oa uishecryao) ‘masa 0 moles totales dle reactante consumido) (11.10)22 Existe un tercer tipo de rendimiento aplicable en determi- rnadas situaciones. Para reacciones con una conversién in- completa de reactante puede ser interesante especificar Ia cantidad de producto formado por cantidad de reactante aiadido a la reaccién en vez del realmente consumido. Por ejemplo, considérese la reaccién de isomerizacién catalizada por glucosa isomerasa glucosa = fructosa ain La reacci6n se realiza en un reactor cerrado con enzima pura, En el equilibrio, la mezcla de azsicares contiene 55% Principios de ingenierfa de los bioprocesos ‘en moles de glucosa y el 45% de fructosa. El rendimiento redrico de la fructosa a partir de la glucosa es 1 mol mol porque de Ia estequiometrfa se deduce que la formacién de 1 mol de fructosa necesita 1 mol de glucosa. El rendimiento ‘aparente seré también 1 mol mol sila reaccién se produce cen un sistema aislado. Sin embargo, sila reacci6n comienza cuando tinicamente existe glucosa, el rendimiento de equilibrio de fructosa por mol de glucosa afladida al reac~ ores 0.45 mol mot. Este tipo de rendimiento para reaccio- nes incompletas puede denominarse como rendimiento bruto. Ejemplo 11.2 Reaccién enzimitica incompleta Una enzima cataliza la reaccién: AeB Enel equilibrio, la mezcla de reacci6n contiene un 63% en peso de A. (@)_{Cudl es ta constante de equilibrio? () Solucién: i Ia reacciGn comienza s6lo con A, {cul es el rendimiento de equilibrio de B a partic de A? (a) De la estequiometria, los pesos moleculares de A y B deben ser iguales: por lo tanto, % en peso = % en moles. De la ecuacién (11.2): Coe Kame Cre Utilizando como base 1 mol I" (b) A partir de la estequiometri es 037/1.0 = 0.37 mol mot” C,,€8 0.63 mol I y C,, €s 0.37 mol I". El valor de K es por lo tanto 0,37/0,63 = 0.59, el rendimiento teérico de B a partir de A es 1 mol mot ‘Sin embargo, el rendimiento bruto 11.1.3 Velocidad de reaccién Considérese la reaccién general irreversible: GA+DB 4 yY42Z a.i2) La velocidad de reacci6n puede representarse por la velo- idad de conversin del compuesto A. Para expresar la velo- ccidad de reaccién con respecto a A se utilizar el simbolo R,. R, tiene unidades, por ejemplo, de kg s-'. ‘4Cbmo pueden medirse las velocidades de reaceién? Para un sistema de reaccién cualquiera, la velocidad de reaccién estd relacionada con la velocidad de cambio de masa en el sistema mediante la ecuacin del balance de materia en esta- do no estacionario mostrada en el Capitulo 6: ae Mi Ro Re 635) En la ecuaci6n (6.5), Mes la masa, tel tiempo, M, el cau- dal mésico que entra al sistema, 7, el caudal masico que sale del sistema, R, Ia velocidad mésica de generacién por reacciény R- la velocidad masica de consumo por reaccién, Apliquemos la ecuacidn (6.5) al compuesto A suponiendo que la reaccién de Ia ecuacién (11.12) es la tinica que se produce. La velocidad de consumo R, es igual a R, y R= 0, Laecuacién del balance de materia se transforma en: iM pou as Far as Maw Re aL13)‘Reaceiones homogéneas Por lo tanto, la velocidad de reaccién R, puede calcularse ‘sise mide la velocidad de cambio de matetia de A, dM,/dt, ¥ Joscaudales de A que entran y salen del En un sistema cerrado donde M,,= M, (41.13) se transforma en: R= ills ee dt aia), ¥y la velocidad de reaccién se determina simplemente mi- diendo la variacién de masa de A en el sistema, La mayorfa dde las mediciones de Ia velocidad de teacci6n se realizan en sistemas cerrados por lo que los datos pueden analizarse de acuerdo a la ecuaci6n (11.14). dM,/dt es negativo cuando A. se consume en la reaccién, por lo que es necesario utilizar un signo menos en Ia ecuacién (11.14) para que R, sea una cantidad positiva. La velocidad de reaccién puede determi- narse también en funcidn de los compuestos B, Y 0Z. En un sistema cerrado: OM, a ais) donde M,, M, y M, son las masas de B, Y y Z, respectiva- mente. Cuando se representa una velocidad de reaccién debe especificarse el reactante medido. Como R, y R, sebasan en Ja acumulaci6n de producto, estas velocidades de reaccién se denominan velocidades de produccién o productividad. Las ecuaciones (11.14) y (11.15) definen la velocidad de reaccin en un sistema cerrado. Sin embargo, la velocidad de reacci6n puede expresarse utilizando diferentes bases de medida, En ingenierfa de bioprocesos existen tres maneras diferentes de expresar Ia velocidad de reacci6n, pudiendo arse en diferentes situaciones: %)) Velocidad total. La velocidad total de reaccién es la de- finida en las ecuaciones (11.14) y (11.15) y se expresa en masa o en moles por unidad de tiempo. La velocidad total es util para especificar la produccién de un deter- ‘minado reactor o planta de produccién. Las velocidades de produccion de las fibricas se expresan a menudo como vvelocidades totales: por ejemplo: «La velocidad de pro- duccién es 10° toneladas por afio>. Si se construyen reac- tores adicionales con el fin de aumentar el volumen de reaccién en la planta, también debe aumentar entonces Ia velocidad total de reaccién. De igual manera, si se aumenta la cantidad de células o enzimas utilizados en ‘cada reactor entonces aumentarfa, incluso més, la velo- ccidad total de produccién. (ii) Velocidad volumétriea. Como ta masa total de reactante convertido en una mezcla de reaccién depende del tama- fio del sistema es conveniente especificar Ia velocidad de reaccién como velocidad por unidad de volumen. Las 273 tunidades de la velocidad volumétrica son, por ejemplo, kg m2 57. La velocidad de reaccién expresada en base de volumen se utiliza para tener en cuenta las diferen- cias en volumen entre diferentes sistemas de reacci6n. Por lo tanto, si la mezcla de reaceiGn en un sistema ce- rrado tiene un volumen V: yal, MARE oa db donde r, es In velocidad volumétrica de reaccién con respetca A, Cuando Ves constant, In eeuscign (1.16) puede eserbise como: 1.16) -dc, ca a.i7 donde C, es la concentracién de A unidades, por ejem- plo, de ke m*. Las velocidades volumétricas son ttiles especialmente para comparar el rendimiento de reacto- res de diferente tamafio. Un objetivo comiin a la hora de coptimizar procesos de reaccién consiste en hacer maxi- ma la productividad volumétrica de tal manera que la velocidad total de produccién deseada pueda alcanzarse con reactores de menor tamaiio y, por tanto, de minimo coste, (ii) Velocidad especifica. Las reacciones biol6gicas utilizan catalizadores enziméticos y celulares. Puesto que la ve- locidad total de conversién depende de ta cantidad de catalizador presente, algunas veces es ttl especificar la velocidad como velocidad por cantidad de enzimas 0 células involucradas en la reacci6n. En un sistema cerra- do, la velocidad especifica de reacciGn puede medirse de Ja siguiente manera: ( i yi x°E) & donde r, es la velocidad especficn de reaccién con res- pecto de A, X la cantidad de células, EB Ia cantidad de enzima y dMWdt la velocidad de cambio de masa de A en el sistema, Como la cantidad de células se expresa generalmente en masa, las unidades de a velocidad es- pecifica para una reaccién catalizada por céluls sera, por ejemplo, kg (ke células)" so simplemente s. Por ‘tro lado, raramente se conoce Ia masa de una determi- nada encima afadida ala reaccién, ya que la mayoria de Ins preparaciones enzimsticas comerciales contienen varios componentes en proporciones variables y desco- nocidas dependiendo de Ia carga suministrada por el + bricante, Para solventar estas dificultades, la cantidad de enzima se expresa generalmente como unidades de acti- vidad medidas bajo determinadas condiciones. Una‘ssi- (L.18)274 dad de enzima se toma generalmente como Ia cantidad «que cataliza la conversi6n de 1 jimol de sustrato por mi- nuto a la temperatura, pH y concentracién de sustrato E+P (1132) donde E es enzima, S sustrato y P producto. ES es el com- plejo enzima-sustrato. La unién del sustrato a la enzima en Ja primera etapa se considera reversible con una constante de reaccién directa k, y una constante de reaccién inversa ‘Tabla 11.3 Constantes Michaclis para algunos sistemas enzima-sustrato (De B. Atkinson y F Mavituna, 1991, Biochemical Engineering and Biotechnology Handbook, 2 edn, Macmillan, Basingstoke) Enzima Fuente Susiraio K, (aM) Alcohol deshidrogenasa Sacharomyces cerevisiae Exanol 130 ‘camilasa Bacillus stearothermophilus Almidén Lo Péncreas porcino Almidén 04 Beamslasa Batata Amilasa 0.07 “Aspartasa Bacillus cadavers Leaspastata 30.0 Bezalactosidasa Escherichia coli Lactosa 3.85 Glucosa oxidasa Aspergillus niger Deslucosa 33.0 Penicillium notatum eglucosa 96 Histidasa Pseudomonas fluorescens -histiina 89 Tavertasa Saccharomyces cerevisiae Sacarosa 91 Neurospora erasca Sacarosa 61 Lactato deshidrogenasa Bacillus subsiis Lactato 300 Penicilinasa Bacillus licheniformis Benzilpenicitina 0.089 Ureasa Suadias germinadas Urea 105282 Figura ILS Representacién Michaelis-Menten, K,, La descomposicién del complejo enzima-sustrato para dar el producto es una reaccién irreversible con una cons- tante de velocidad k,, también conocida como niimero de transacciones. El anilisis de los rendimientos de esta se- ‘cuencia de reacciones permite obtener la siguiente relacién: Ye he, 1133) donde e, es la concentracién de enzima activa, Como es de esperar en las reacciones catalfticas, la enzima se recupera al final de la reacci6n, ‘Una caracteristica esencial de las cinéticas Michaelis-Men- tenes que el catalizador Hega a saturarse a elevadas concen- traciones de sustrato. La Figura 11,5 muestra la forma de la ecuacién (11.31) donde Ia velocidad de reaccién v no au- ‘menta indefinidamente con la concentracién de sustrato sino ‘que tiende a un valor limite, v,,.. A elevadas concentracio- nes de sustrato s >> K,,. Por otto lado K,, en él denominador de la ecuacién (11.31) es despreciable si se compara con s, por lo que puede escribirse: “ans 11.34) a (1i34y Ve Va, (11.35) Por lo tanto, a concentraciones elevadas de sustrato, 1a velocidad de reacciGn se aproxima a un valor constante in- dependientemente de la concentracién de sustrato. En este intervalo de concentracién, la reacci6n es de orden cero con respecto al sustrato, Por otro lado, a concentraciones peque- fias de sustrato s <<, y el valor des en el denominador de Principios de ingenierta de los bioprocesos la ecuacién (11.31) puede despreciarse si se compara con el valor de K,, por lo que la écuacién (11.31) puede simpli- ficarse a: K, s (11.36) La relacién de constantes v,,,/K,,€8, en efecto, un coefi- ciente de velocidad de primer orden para la reaccién, Por lo tanto, a concentraciones bajas de sustrato existe una depen- dencia aproximadamente lineal de la velocidad de reaccién respecto de s. En este intervalo de concentraciGn las reac ciones Michaelis-Menten son esencialmente de primer or- den con respecto al sustrato, La ecuacién de Michaelis-Menten describe satisfactoria- mente el comportamiento de muchas enzimas industriales, aunque existen algunas excepciones como la glucosa iso- merasa y la amiloglucosidasa. Si existen varios sustratos 0 se perciben efectos de inhibicién deben utilizarse expresio- nes cinéticas més complejas [2-4]. En el Apartado 11.4 se ‘muestran diferentes procedimientos para comprobar si una determinada reaccién sigue una cinética Michaelis-Menten as{ como el método para calcular v,,.. y K,, partir de datos experimentales. 11.3.4Efecto de las condiciones de operacién sobre la velocidad de reaccién de la enzima, La velocidad de reaccién enzimética se ve afectada, ade- mis de por la concentracién de sustrato, por varias condi ciones de operacién como la temperatura y el pH. Para enzimas con una etapa controlante de la reacciGn, el efecto de Ia temperatura se describe razonablemente bien mediante la expresiGn de Arrhenius de la ecuacién (11.21) sustituyen- do k por v,,.. En la Figura [1.6 se muestra un ejemplo de la relaciGn existente entre la temperatura y la velocidad de in- versi6n de I sacarosa mediante levadura invertasa. Las ener- gfas de activacién para las reacciones enziméticas son del orden de 40-80 KI mol" [5]. A groso modo esto significa gue un aumento de 10 °C en la temperatura, entre 20 y 30 °C, producirs un aumento de 2-3 veces la velocidad de reaccién, Aungue para enzimas se observa una relacién tipo Arrhenius entre la temperatura y la velocidad de reaccién, el intervalo de temperaturas sobre el que puede aplicarse la cecuacién (11.21) es bastante limitado, Muchas proteinas co- mienzan a desnaturalizarse a 45-50 °C, de manera que si se sobrepasa dicha temperatura se produce la desactivactivacién térmica y la velocidad de reaccin disminuye répidamente. La Figura 11.7 muestra como la relacién de Arrhenius deja de cumplirse a elevadas temperaturas. En este experimento, la ley de velocidad de Arrhenius se cumple en el intervalo de temperatura comprendido entre 0 °C (T = 273.15 K;Reacciones homogéneas ‘Figura 11.6 Representacién de Archenius para la inversién de Ta ‘sacarosa con levadura invertasa, (De LW. Sizer, 1943, Effects of temperature on enzyme kinetics. Adv. Enzymol. 3, 35-62.) Figura 11.8 Efecto del pH sobre Ia actividad enzimética. (De JS. Fruton y §.Simmonds, 1958, General Biochemistry, 2 eda, John Wiley, New York.) iene toa (mg azar veto mi) L L L 35 dxto! (x) ‘Figura 11.7 Representacién de Afthenius para catalasa. La enzi- ‘ma se destruye a elevadas temperaturas. (De IW. Sizer, 1944, ‘Temperature activation and inactivation of the crystalline catalase- faydrogen peroxide system. J.Biol. Chem. 154, 461-473.) 25 24 23 22 24 20 oa (re, min) 19 18 @ 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 1 087 For) Descartodlasa del io ghadmico 100 80+} 8 [2 40 = ‘anilasa (saliva) 20 a Ta ease oe ecm nCuer 2) pH 'Ip= 3.66 x 10 K") y alrededor de 53 °C (T= 326.15 Ks 3.07 x 10° K~), Posteriores aumentos de temperatura producen una répida disminucién en Ia velocidad de teac- cidn debido a la desactivacién térmica. La estabilidad enzimética y la velocidad de desactivacién son factores im- portantes que afectan al rendimiento catalitico global en los reactores. Este tema se discutiré posteriormente en el Apar- tado 11.5. El pH ejerce un mareado efecto sobre las cinéticas de las cenzimas, tal como se muestra en Ia Figura 11.8. La veloci- dad de reaccién es maxima en un determinado pH y dismi- nuye drésticamente si se desplaza el pH hacia cualquier lado del pH éptimo. Se han desarrollado varias ecuaciones cinéticas para describir el efecto del pH sobre Ia actividad cenzimtica aunque generalmente la influencia del pH se de- ‘termina experimentalmente en cada caso, La fuerza iénica y Inactividad del agua presentan también un considerable efec- to sobre la velocidad de reaccién enzimitica pero se dispone de pocas correlaciones capaces de predecir estos efectos. 11.4 Determinacién de las constantes cinéticas enzimaticas a partir de datos obtenidos en un reactor discontinue Para especificar completamente las cinéticas de Tas reac ciones Michaelis-Menten es necesario calcular des comstan—284 tes de velocidad, v,,, y K,. La determinacién de los parimetros cinéticos de las reacciones Michaelis-Menten no es tan sencillo como para las reacciones de orden cero 0 de primerorden. Paraello, existen varios métodos grificos aun- que desafortunadamente no consiguen resultados precisos, EI primer paso en el anilisis cinético de las reacciones enzimiticas consiste en obtener datos de velocidad de reac- ci6n v en funcién de la concentraciGn de sustrato s. Las ve~ locidades de reaccién pueden determinarse a partir de datos, de concentracién obtenidos en reactor discontinuo a dife- rentes tiempos, tal como se describié en el Apartado 11.2. Generalmente s6lo se utilizan los datos de velocidad inicia- les. Esto significa que se realizan varios experimentos discon- tinuos con diferentes concentraciones iniciales de sustrato y de cada uno de ellos se obtiene Ia velocidad inicial a tiempo cero. Las velocidades iniciales y las correspondientes con- centraciones iniciales de sustrato se utilizan como parejas (v, 5) que pueden representarse de diferentes maneras, para la determinaci6n final de v,.,.¥ K,. Bs preferible utilizar los datos de velocidad inicial para las reacciones enzimaticas porque las condiciones experimentales, como la concentra- cidn de sustrato y de enzima, se conocen con mayor preci- si6n al comienzo de la reaccién. Menten 11.4.1 Representacién Michaelis Este procedimiento consiste en representar directamente parejas de valores ( s) tal como se muestra en la Figura 11.5. Los valores de v,,, ¥ K, pueden calcularse, de manera aproximada, a partir de esta representaci6n: ¥,. €S la veloci- dad cuando s — ov y K, es el valor des cuando v= vj,/2. La precisién de este método es generalmente pobre debido a la dificultad de extrapolacién de v__. 11.4.2 Representacién Lineweaver-Burk ara esta representacién es necesario utilizar un método de linealizaci6n con el fin de obtener una linea recta a partir de la cual pueda calcularsev,,,¥ K,. Invirtiendo la ecuacién (1131) se obtiene: es 1.37) por lo que una representacién de I/v frente a 1/s daria una linea recta de pendiente K,/v,,, y ordenada en el origen v_.,. Esta representaci6n de los inversos de los valores de vy 5se conoce como representacién Lineweaver-Burk, y se encuentra frecuentemente en Ia bibliografia sobre reaccio- nes enziméticas. Sin embargo, el proceso de linealizacién ulilizado en este método distorsiona el error experimental Principios de ingeneria de los bioprooesos en v (véase el Apartado 3.3.4) porlo que estos errores se vem aumentados a concentraciones bajas de sustrato. Como con= secuencia, la representacién Lineweaver-Burk a menudo produce resultados imprecisos y no es muy recomendable Gl 11.4.3 Representacién Eadie-Hofstee Si se multiplica la ecuacién (11.37) por y se reordena, se obtiene otra forma linelizada dela eous- cién de Michaelis-Menten: “kK, (11.38) De acuerdo con la ecuaci6n (11.38), al representar vs frente ‘vse obtiene una linea recta de pendiente ~1/K,, y ordenada en el origen v..,/K,, que se denomina representacién Eadie~ Hofstee. Al igual que en la representacién Lineweaver-Burk, Ia linealizacién Eadie-Foster distorsiona los errores exis- tentes en los datos originales por Io que este método presen- ta-una precisién limitada, 11.4.4 Representacién Langmuir Multiplicando la ecuacién (11.37) por s se produce la for ‘ma linealizada de In ecuaci6n de Michaelis-Menten de acuer- doa Langmuir: Sans (11.39) Por lo tanto, una representacién Langmuir de s/v frente & ss deberia dar una Ifnea recta de pendiente 1/v,., ¥ ordenada en el origen K,/v,,- La linealizacién de los datos para la representacin Langmuir minimiza la distorsién de los erro- res experimentales, por lo que se recomienda su utilizaciéa para el célculo de v,,,¥ K,, (61 11.4.5 Representacién lineal directa Eisenthal y Comish-Bowden (7] han propuesto un méto- do diferente de representar datos cinéticos. En dicho méto- do se representa la velocidad de reaccidn v en el eje vertical frente a s en el eje horizontal negativo para cada observa cidn, tal como se muestra en la Figura 11.9 para cuatro pareReaociones homogéneas 285 ‘Figura 11.9 Representacin lineal dicta para la determinacin de los pardmetros cinéticos enziméticos. (De R. Bisenthal y A. Cornish- Bowden, 1974, The direct linear plot: a new graphical procedure for estimating enzyme kinetic parameters. Biochem. J. 139, 715-720.) {25 de datos (;s). Entonces se traza una linea recta para unir ‘os correspondientes puntos (-,). En ausencia de errores ‘experimentales, las lineas de cada par (-s,v) intersectan en ‘un tinico punto, (K,, v,,,)- Cuando se representan datos rea- Jes que contienen errores se obtiene una familia de puntos ‘Ge interseocidn, Cada interseccién da un valor diferente de ¥_.y K,, tomindose como parmetros cinsticos de la reac Sa los valores medios de v,,, ¥ K,. Este método es relati- ‘yamente insensible a las lecturas errGneas individuales que ‘s= encuentren lejos de los valores correctos. Sin embargo, “sz iinconveniente de este método es Ia dificultad de detectar ‘iss desviaciones del comportamiento de Michaelis-Menten. “Porlo tanto, ste método se recomienda para aquellas enzimas ‘se conoce que obedecen a una cinética Michaelis-Men- Cinética de desactivaci6n enzimatica ‘Les enzimas son moléculas protefnicas de configuracién ja que pueden ser desestabilizadas por fuerzas relati- débiles. En el transcurso de las reacciones por enzimas, 1a desactivacién de la enzima se ‘una velocidad que depende de su estructura y de fiones de reacciGn, Entre los factores medioam- ‘que afectan a Ja estabilidad enzimética pueden ci- tarse la temperatura, el pH, la fuerza iénica, las fuerzas me- cdinicas y la presencia de sustancias extrafias como disol- ventes, detergentes y metales pesados. Debido a que la can- tidad de enzima puede disminuir considerablemente durante a reaccién, en muchas aplicaciones la cinética de desactivacién de la enzima.es tan importante como lacinética de la propia reaccién, En el modelo mas simple de desactivacién enzimética, la cenzima activa E, sufre una transformacién irreversible hacia tuna forma inactiva E; EE (a.40) La velocidad de desactivacién se considera generalmente de primer orden respecto de la concentraci6n de enzima ac- tiva. (1.41) donde r, ¢s la velocidad volumétrica de desactivacién, ¢, la concentracién de enzima activa'y k, la constante de la velo- cidad de desactivacién. En un sistema cerrado donde ta desactivacién de ta enzima es el nico proceso que afecta a Ta concentraci6n de enzima activa: =de, ae286 Prineipios de ingenieria de los bioprocesos La integracién de la ecuaci6n (1.42) produce una expre~ sin para la concentraciéin de enizima activa en funcién del tiempo: e=eeu (11.43) donde ¢,, es la concentracién de enzima activa a tiempo cero. De acuerdo con la ecuacién (11.43) Ia concentracién de en- zima activa disminuye exponencialmente con el tiempo, de manera que la mayor velocidad de desactivacién de la enzi ma se produce cuando ¢, es alto. Tal como se indicé en la ecuacién (11.33), el valor de v,., para la reaccién enzimética depende de la cantidad de enzi- ma activa presente. Por lo tanto, conforme disminuye e, de~ bido a ta desactivacién, v,,, también disminuye. La varia- cidn de v,,,. con el tiempo puede calcularse sustituyendo en Ia ecuacién (11.33) la expresién de e, mostrada en la ecua- cidn (11.43): Vas = he gH! = Vg Ht (44 donde ¥,,. & él valor inicial de v,,, antes de que se produz- ca Ia desactivacién, La estabilidad de las enzimas se expresa generalmente en términos de la vida media o periodo de semidesactivacién. La vida media es el tiempo necesario para que se pierda la id de la actividad enzimética como resultado de Ia desactivaciGn; después de una vida media, la concentracién, de enzima activa es igual a ¢,/2. Sustituyendo e, = ¢,/2 en la ecuacién (11.43), tomando logaritmos neperianos y reordenando los rendimientos se obtiene la siguiente expre- sign: (11.45) donde ¢, es la vida media de la enzima. La velocidad de desactivacisn enzimética depende fuerte- mente de la temperatura. Esta dependencia se describe razo- nablemente bien mediante la ecuacién de Arrhenius: (11.46) k, = Aetuar donde A es la constante de Arrhenius 0 factor de frecuencia, E, laenergfa de activacién para la desactivacién enzimética, Ril constante de los gases ideales y T la temperatura abso- luta, De acuerdo con la ecuaci6n (11.46), conforme aumenta T disminuye la velocidad de desactivacién enzimética de ‘manera exponencial. Los valores de B, son altos, general- ‘mente del orden de 170-400 kJ mol" para muchas enzimas [5]. De acuerdo con ello, un aumento de temperatura de 10°C, entre 30°C y 40°C, produciré un aumento entre 10 y 150 veces en Ia velocidad de desactivacién enzimética, El efecto estimulante del aumento de temperatura sobre la ve~ locidad de Ia reaccidn enzimitica se ha descrito en él Apar~ tado 11.3.4. Sin embargo, como se ha mostrado anterior mente, un aumento de temperatura produce también una dis- minuci6n de la cantidad de enzima activa presente. Esti cla- +o que la temperatura presenta un efecto crucial sobre la cinética enzimatica Ejemplo 11.5 Vida media de Ia enzima ‘Se inmoviliza la amiloglucosidasa procedente de la Endomycopsis bispora sobre poliacrilamida gel. Se comparan las actividades de Ia enzima inmovilizada y de la soluble a 80 °C. Los datos de velocidad inicial medidos con una concentra- cin fija de sustrato se muestran en la siguiente tabla, Tiempo Actividad enzimética (min) (mol ml! mine!) Enzima soluble Enzima inmovilizada 0 0.86 0.45 3 0.79 0.44 6 0.70 0.43 9 0.65 0.43 15 0.58 O41 20 0.46 0.40 25, O41 039 30 - 0.38 40. = 0.37 ¢Cual es la vida media para cada forma de enzima?Reacciones homogéneas Solucién: proporeional a, vez de v.,. Tomando logaritmos neperianos se obtiene: Inv=iny,— ke Figura IIES.1 Anilisis cinético de la desactivacién enzimética, ‘atv enc rol mi mk) 0 10 2» Tiempo (in) In2 (soluble) = 555 a7 In2 0.005 min 4,(inmovilizada) 287 De la ecuacién (11.31); a cualquier concentracién fija de sustrato, la velocidad de reaccién enzimética v es directamente . Por lo tanto, k, puede calcularse a partir de la ecuacién (11.44) utilizando la acti \d enzimitica ven donde y, es Ia actividad inicial de la enzima antes de Ia desactivacién. Por lo tanto, si la desactivacién sigue una cinética de primer orden, una representaci6n semilogaritmica de la velocidad de reaccin frente al tiempo deberfa dar una Ifnea recta de pendiente -K,, Los datos se han representado en la Figura 115.1 ‘De las pendientes se obtiene un valor de k, para la enzima soluble de 0.03 min, mientras que para la enzima inmovilizada el valor es de 0.005 min-'. Aplicando la ecuacién (11.45) para la vida media inmovilizacién favorece de manera significativa la estabilidad de Ia enzima. Rendimientos en cultivos celulares El concepio bisico de rendimiento de Ia reacci6n se intro- jo en el Apartado 11.1.2 para reacciones simples en una Cuando se consideran procesos como el crecimiento se estin agrupando muchos efectos individuales de jones quimicas y enzimaticas. A pesar de esta com- Jos principios del rendimiento pueden aplicarse al ‘metabolismo celular para relacionar el flujo de sustrato en Jas rutas metabélicas para la formacién de biomasa y otros productos. Los rendimientos que se muestran generalmente y aquéllos de especial importancia se expresan mediante Coeficientes de rendimiento 0 factores de rendimiento. Wax rios coeficientes de rendimienio son de uso comin, como et rendimiento de biomasa a partir de sustrato, el rendimiento de biomasa a partir de oxigeno 6 el rendimiento de producto288 a partir de sustrato, Los coeficientes de rendimiento permi- ten cuantificar la necesidad de nutrientes y las caracteristi- cas de produceién de un organismo. Algunos coeficientes de rendimiento metabslico ya se de- finieron en el Capitulo 4: el rendimiento de biomasa ¥,., el rendimiento de producto ¥,, y el cociente respiratorio RO. La definicién de los coeficientes de rendimiento pueden ge- neralizarse de la siguiente manera: ~AF y, AG aay donde ¥,,, es el factor de rendimiento, F y G son las sustan- cias involuctadas en el metabolismo, AF la masa o moles de F producidos y AG la masa o moles de G consumidos. Como ‘AG es negativo en valor para una sustancia consumida, para que el rendimiento se calcule como una cantidad positiva es necesario afiadir un signo negativo a la ecuacién (11.47). En la Tabla 11.4 se muestra una lista de los coeficientes de ren- dimiento mds frecuentemente utilizados. Obsérvese que en algunos casos, como el de Y,., ambas sustancias representa- das por el coeficiente de rendimiento son productos del me- tabolismo, Aunque el término «tendimiento> se refiere ge- neralmente a la cantidad de producto formado por cantidad de reactante, el rendimiento puede utilizarse también para relacionar otras cantidades. Algunos coeficientes de rendi- ‘miento se basan en cantidades tales como el ATP formado 0 el calor involucrado en el metabolismo. Tabla 114 Algunos coeficientes de rendimiento metablicos Simbolo Definicion a ‘Masa o moles de biomasa producida por unidad de ‘masa o mol de sustrato consumido. (Los moles de biomasa pueden calcularse a partir dela «férmula molecular» de la biomasa Véase el Apartado 46.1) Masa o moles de producto formado por unidad de ‘masa o mol de sustrato consumido a Masa 0 moles de producto formado por unidad de ‘masa 0 mol de biomasa formada = Masa o moles de biomasa formada por unidad de ‘masa 0 mol de oxigeno consumido 15) Masa o moles de diéxido de catbono formado por uunidad de masa o mol de sustato consumido RO Moles de disxido de carbono formados por mol de oxfgeno consumido, Este rendimiento es el deno- rminado cociente respiratorio ie Masa o moles de biomasa formada por mol de ATP formado 1 Masa o moles de biomasa formada por kilocaloria de calor involucrada en la reaccin Principios de ingenierfa de los bioprocesos 11.6.1 Rendimientos globales e instantaneos Un problema en la aplicacién de la ecuacién (11.47) es que los valores de AF y AG dependen del perfodo de tiempo en el que se miden. En un cultivo discontinuo, AF y AG pueden calcularse como la diferencia entre los valores ini- cial y final, obteniéndose un rendimiento global que repre~ senta una especie de valor medio durante el perfodo entero de cultivo, Por otro lado, AF y AG pueden caleularse entre otros dos puntos cualesquiera en el tiempo, lo cual puede producir un valor diferente de Yq. Los rendimientos pue- den variar durante el cultivo y algunas veces es necesario calcular el rendimiento instantéineo en un determinado pun- toen el tiempo. Para un reactor cerrado de volumen cons- tante en el que la reaccién entre Fy Ges la nica reacciénen Ja que intervienen estos componentes, sir, ¥ r, son veloci- dades volumétricas de produccién y consumo de F y Gres- pectivamente, el rendimiento instanténeo puede calcularse de la siguiente manera: pele a fe ac 8G Por ejemplo, Y,, en un determinado instante se define como: 5 -aF lim —— Tro = AG (11.48) velocidad de ereci 5 nto 7 velocidad de consumo de sustrato (1149) Cuando se expresan rendimientos de fermentacién debe ‘manifestarse el tiempo o perfodo de tiempo al cual se refie- ren 11.6.2 Ren jento te6rico y observado ‘Tal como se describié en el Apartado 11.1.2 es necesario distinguir entre rendimiento te6rico y observado. Este as- ecto es particularmente importante en el metabolismo ce- lular porque siempre existen muchas reacciones producién- dose de manera simulténea, por lo que ambos rendimientos pueden ser diferentes. Considérese el ejemplo de rendimiento de biomasa a partir de sustrato, ¥,),. Sila masa total de sustrato consumido es S,, parte de S, igual a 5, se utilizaré para el crecimiento celular mientras el restante, S,, se canalizaré hacia otros productos y actividades metabdlicas no relacio- nadas con el crecimiento. Por lo tanto, el rendimiento de biomasa observado basado en el consumo total de sustrato es: -Ax (11.50)Reacciones homogéneas donde AX es la cantidad de biomasa producida e Y’,, el ren- dimiento de biomasa observado a partir de sustrato. Los valores de rendimientos de biomasa observados para varios, ‘organismos y sustratos se muestran en la Tabla 11.5. A efec- to comparativo, el rendimiento de biomasa tedrico 0 verda- ddero a partir de sustrato es: as) donde AS, es la masa de sustrato realmente utiizada en la produccién de biomasa. Debido a la complejidad del meta- Dolismo, generalmente no se conoce el valor de AS, y el rendimiento observado es el tnico rendimiento disponible. ‘Los rendimientos te6ricos se refieren normalmente aun ren dimiento mdximo posible, ya que ellos reptesentan el rendi- miento en ausencia de reacciones paralelas. 8 ‘Tabla 11.5 Rendimientos a biomasa observados para varios microorganismos y sustratos (De S.J. Pirt, 1975, Principles of Microbe and Cell Cultivation, Blackwell Scientific, Oxford) Microorganismo Sustrato Rendimiento «a biomasa observado Yon 89 ‘Aerobacter cloacae Glucosa 044 Penicilium chrysogenum Glucosa 043 Candida ils Glucosa 051 Kcido acstico 036 Etanol 068 Candide imermedia —n-Aleanos (Cy-C,) O81 Pseudomonas sp. Metanol oat Methylococeus 9p. Metano LoL Ejemplo 11.6 Rendimientos en la produccién de Acido acético La eonacién para la produccién aerobia de fcido acético a partir de etanol es: CH,OH +0, > CH,CO,H+ H,0 zanol) (Gcido acético) ‘Soha afiadido Ia bacteria Acetobacter aceti a un medio altamente aireado que contiene 10 g 1" de etanol. Transcurrido cierto ‘dempo, la concentracién de etanol es 2 g I y se han producido 7.5 g I" de écido acético. ;Cémo es el rendimiento global de fcido acético a partir de etanol en comparacién con el rendimiento tedrico? Solucién: ‘Utilizanddo como base de célculo | lito, el rendimiento observado durante el periodo entero de cultivo se obtiene mediante Ta ecuacin (11.10): Elrendimiento te6rico se basa en la masa de etanol utilizada para la sintesis de fcido acético. De la ecuacién estequiométrica: 158 Cars ec=as 0° I mol fcido acético 60g - = =130¢¢4 1 mol etanol 468 El rendimiento observado es el 72% del te6rico. 11.7 Cinética de crecimiento celular La cinética de crecimiento celular se expresa mediante ‘ecuaciones sifnilares a las mostradas en el Apartado 11.3. Desde un punto de vista matemitico existe poca diferencia ‘entre las ecuaciones cinéticas para enzimas y células; des- pués de todo, el metabotismo celular depende de la accién integrada de multitud de enzimas. 11.7.1 Crecimiento en un cultivo discontinuo En un cultivo discontinuo se observan varias fases de cre- cimiento celular. En la Figura 11.10 se muestra una curva tipica de crecimiento. Las diferentes fases de crecimiento se distinguen més fécilmente cuando se representa el logaritmo neperiano de la concentraciGn de células viables freate al tiempo. La velocidad de crecimiento depende de la fase d=290 Figura 11.10 Curva tipica de crecimiento celular Fase esacionara Fase decrecinishio. Tn teoncertracin clas wales) Fase de aoseracion Fase de adaptacin Tempo crecimiento. Durante la fase de adaptacién o latencia inme- diatamente después de Ta inoculacién, la velocidad de ereci- miento es pricticamente cero, Las células utilizan esta fase para adaptarse al nuevo ambiente, y algunas veces se sinteti- ‘zan nuevas enzimas 0 componentes estructurales. Tras estes perfodo de adaptacién comienza el crecimiento en la fase de aceleracién y contintia durante Ia fase de crecimiento pro- piamente dicha y durante Ia fase de deceleracién. Si el creci- miento es exponencial, la fase de crecimiento aparece como una linea recta en una representaci6n semilogaritmica por lo que a veces se denomina fase logaritmica, Cuando los nutrientes en el medio de cultivo se han consumido o se acu- mulan los productos inhibidores, el crecimiento disminuye y las células comienzan la fase de deceleracidn, Tras este perfodo de transicién se alcanza la fase estacionaria en la ue no se produce crecimiento, Algunos cultivos presentan tuna fase de muerte cuando las células pierden viabilidad o son destnuidas por rotura. La Tabla 11.6 muestra un resumen del crecimiento y actividad metabética durante las fases de un cultivo discontinuo, Durante las fases de crecimiento y deceleracién, la veloci- dad de crecimiento celular se describe mediante I ecuacién 11.52) donde r, es la velocidad volumétrica de produccién de biomasa'con unidades de, por ejemplo, kg ms“, x la con- centracién de células viables con unidades, por ejemplo, de kg m°, y 11 la velocidad especifica de crecimiento. La velo- cidad especifica de crecimiento tiene dimensiones T~. La ecuacién (11.52) tiene Ia misma forma que la (11.27), por lo Principios de ingenicria de los bioprocesos Tabla 11.6 Resumen del crecimiento celular en un cultivo discon- Fase Descripeiin Velocidad - eipectica de crecimiento Adapiacién ——-Laseflols seadapan =O al nvovo ambiente, No existe existe muy poco crecimiento ‘Aceleracién Comienza cl crecimiento $< Hy Crecimiento El crecimiento aleanea f= we su méxima velocidad Deceleracién El crecimiento se hace més 1 10K, durante la mayor parte del perfodo del culti- vo. Esto explica por qué jt permanece constante ¢ igual a ,,, en los cultivos discontinuos hasta que el medio esta practicamente agotado de sustrato. Cuando finalmente s se sittia por debajo de 10 K,, la transicién desde Ia fase de ere- cimiento a la estacionatia puede ser muy brusca ya que el bajo nivel de sustrato remanente se consume ripidamente debido al gran ntimero de células presentes. La ecuacién de Monod es la ecuacién normalmente uti zada para relacionar Ia velocidad de crecimiento y Ia con- centracién de sustrato. Sin embargo, ésta es valida inica- ‘mente para un crecimiento equilibrado y no deberia aplicar- se cuando las condiciones de crecimiento cambian réipida- mente, Existen ademas otras limitaciones; por ejemplo, se ha en- contrado que Ia ecuacién de Monod tiene una aplicacién li mitada a niveles de sustrato extremadamente bajos. Cuando el crecimiento se ve inhibido por concentraciones altas de sustrato 0 de producto deben afiadise otros términos a la ecuacién de Monod para tener en cuenta estos efectos. Para el crecimiento celular se han desarrollado otras expresiones cinéticas que en ciertas ocasiones presentan mejores corre- Iaciénes con los datos experimentales [8-11]. 11.8 Cinética de crecimiento con plasmido inestable Un problema que puede proclucirse en el cultivo de orga- nismos recombinantes es la pérdida o inactivacién del plsmido. La inestabilidad del plasmido se produce en aque- Tas células que, por reproduccién, pueden generar una gran poblacién libre de plésmido en el reacior y reducir la veloci- {dad global de sfatesis de productos codificados con plasmido. La inestabilidad del plésmido se produce como resultado de Ja mutacién del ADN o por segregaci6n de plismido defec- tuoso, Para una estabilidad segregacional, el nimero total de phismidos presentes en el cultivo celular debe duplicarse ‘una vez por generaci6n y las copias de plismido deben estar igualmente distribuidas entre las células madres y las hijas. Principios de ingenierfa de los bioprocesos Tabla 11.7 Valores de K, para varios organismos (De $1. Pir, 1975, Principles of Microbe and Cell Cultivation, Blackwell Scientific, Oxford: y DLC. Wang, C.L. Cooney, A.L. Demain, P. Dunnitl, A.E. Humphrey y M.D. Lilly, 1979: Fermentation and Enzyme Technology, John Wiley, New York) Microorganism Sustrato K, (sénero) Timitante (me P) Saccharomyces Glacosa 5 Escherichia Glucosa 40 Lactosa 20 Fosfato 16 Aspergillus Giucosa 5.0 Candida Glicerot 45 Oxigeno 0.082.045 Preudomonas Metanol 027 Metano oa Klebsieta Didido decarbono 04 Magnesio 056 Povasio 039 Sulfato 27 Hansenula Metanol 20.0 Ribosa 3.0 Crprococeus Tiamina 14107 Se ha desarrollado un modeto sencillo aplicado a los cul- tivos discontinuos para describir los cambios en la fraccitn de células soporte de plésmido en funcién del tiempo [12] Los parmetros més importantes de este modelo son la pro- babilidad de pérdida de plésmido pot generacién de células y la diferencia en las velocidades de crecimiento de eélulas Soporte de plésmido y las células libres de plismido. A las ¢élulas anfitrionas se ies supone tn crecimiento exponencial Si x*es laconcentracién de células portadoras de plasmido y x laconcentracién de células libres de plismido, las veloci- dades a las que crecen dos poblaciones de células son: t= (1px a6 y r (11.62) donde r,, es la velocidad de crecimiento de Ia poblacién portadora de plasmido, r.. la velocidad de crecimiento de la poblacién libre de plésmido, p la probabilidad de pérdida de plismido por divisin celular (p <7), jt la velocidad espec fica de crecimiento de células portadoras de plésmido y ji-la velocidad especffica de crecimiento de células libres de plismido. El modelo supone que todas las eélulas que con- tienen plésmido son iguales en cuanto a la velocidad de ere- cimiento y a la probabilidad de pérdida de plismido, o 10 quees igual a suponer que las c8{ulas que contienen plismido pues + gecciones homogéneas sen el mismo mimero de copias. Comparando la ecuacién (4161) con la (11.52) puede observarse que la velocidad de ento de la poblacién que contiene plismido dismi- por pjt'x*. Bsto se debe a que parte de la descendencia -células portadoras de plismido no contienen plismido se unen a la poblaci6n portadora de plésmido. Por otro 1. En general, la diferencia entre y* yw | ser ms importante cuando aumenta el tamaiio del 293 ‘Tabla T1.8 Velocidades relativas de crecimiento entre células por- tadoras y libres de plsmido. (De T Imanaka y S. Aiba, 1981, A perspective on the application of genetic engineering: stability of recombinant plasmid. Ann. N.Y. ‘Acad, Sci. 369, 1-14) Organismo Plésmido Escherichia coli C600 F’ lac 099-1.10 E, coli KI2BC1055 Ri drd-19. 1.03-1.12 E.coli K121R713, ‘TP120 (varios) 150-231 E coli ICT623, Col EL 129 ColBl derivado = 1.15-1.54 de la insercién TnA, (varios) Col BI supresién ——_1.06-1.65 rmutante (varios) Pseudomonas TOL 2.00 ‘aeruginosa PAOT plésmido o el niimero de copias. En la Tabla 11.8 se mues- ‘ran algunos valores de ct obtenidos de la bibliografia; gene- ralmente 1.0 < ct< 2.0. Bajo presiGn de seleccién, ct puede ser igual a cero; si el plismido codifica enzimas biosintéticos para los nutrientes esenciales, la pérdida de plésmido puede resultar en {= 0. Eneste caso, F permanece cercano a 1 ya que la poblacién libre de plasmido no puede reproducirse, F depende también de p, la probabilidad de pérdida de pkésmido por generaciGn, que puede llegar a ser tan alta como 1 si se produce segregacién. Cuando la matacién o las inserciones © supresiones aleatorias son la tinica causa de inestabilidad de los plésmidos, p es normalmente muy inferior, tomando tun valor aproximado de 10°, La fragmentacién del plésmido dentro de una célula anfitrién puede producirse con mayor frecuencia si el vector clonante es inestable por naturaleza. Elcultivo discontinuo de microorganismos necesita gene- ralmente 25 0 mis generaciones de células. Los resultados de F obtenidos tras 25 generaciones se han calculado me- dliante Ia ecuacién (11.64) y se muestran en la Figura 11.12 en funcidn de p y a. F disminuye sustancialmente conforme © aumenta de 1.0 a 2.0. Cultivos con p < 0.01 y a< 1 son relativamente estables, con F tras 25 generaciones cercano a 1. En el Ejemplo 11.7 se muestra como aplicar la ecuacién (11.64), 11.7 Inestabilidad de plasmido en un cultivo discontinuo de E. coli portadora de plésmido se utiliza para producir protefna recombinante en un fermentador de 250 ltros: blidad de pérdida de plésmido por cada generacién es 0.005. La velocidad especifica de crecimiento de c&tulas {dsmido es 1.4 hr, mientras que la velocidad especifica de crecimiento de células portadoras de plasmids es 1-2294, hr. Caleular la fraccién de células portadoras de plismido tras 18 h de erecii c6lulas con plismido. Solucién: Principios de ingenieria de los bioprocesos nto si el inoculado contiene tinieamente El ntimero de generaciones de células portadoras de plésmido en 18 h se calcula mediante Ia ecuacién (11.66): (2h )18h In2 Sustituyendo este resultado en la ecuacién (11,64) con p = 0.005 y __t=117=0005 Sora 14 hVi.2te Por lo tanto, tras 18 h soto el 45% de las células contienen plasmido. Se han desarrollado modelos altemativos para el célculo del crecimiento celular con pismido inestable [13], algu- rnos de los cuales incluyen ecuaciones para la utilizacién de sustrato y formacién de producto [14]. Un punto débil en el modelo bésico mostrado anteriormente es Ja suposicién de {que todas las células portadoras de plismido son iguales. En realidad existen diferencias en el nimero de copias y, por tanto, en Ja velocidad especitica de crecimiento entre célu- las portadoras de plésmido, por lo que la probabilidad de péndida de plismido puede variar de una célula a otra. Exis- ten también modelos més complejos que reconocen la se~ ‘2regacién natural de poblaciones de plésmido [15, 16]. Figura 11.12 Fraccién de células portadoras de plésmido en tn cultivo discontinuo tras 25 generaciones, (De. Imanaka y S. Aiba, 1981, A perspective on the application of genetic engineering: stability of recombinant plasmid. Ann. N.Y. Acad. Sci. 369, 1-14) 11.9 Cinética de produccién en un cultivo celular En este apartado se considerard la cinética de produecién de compuestos de bajo peso molecular como ef etanol, aminodcidos, antibiéticos y vitaminas, que son expulsados como excrementos de las células en cultivo. Como se mues- tra_en la Tabla 11.9, los productos de fermentacién pueden clasificarse de acuerdo a la relaciGn existente entre sintesis del producto y generacién de energfa en la célula (10, 17] Los compuestos de la primera categoria se forman directa- mente como productos finales o subproductos del metabo- lismo energético, de manera que estos materiales se sinteti- zan en las rutas de formacién de ATP. La segunda clase de productos gstan parcialmente asociados a Ia generacién de ‘energia aunque requieren un aporte adicjonal de energfa para su sintesis. La formacién de otros productos como los anti- ‘Tabla 11.9 Clasficacién de los productos de fermentacién de bajo peso molecular Clase de metabolito Bjemplos Productos directamente asociados a la generacién de energfa en fa eélula Etanol, dcido aeético, deido slucsnico, acetona, butanol, ido Iietico, otros productos de fermentacién anaerobia Aminodcidos y otros productos, fcido citrico, nuclestidos Productos indirectamente asociados con la generacién de encrgia Productos en los que no existe ‘una clara relacién directa 0 indirecta con la generacién deenergia Penicilina, estreptomicina, vitaminas‘Reacciones homogéneas biéticos incluyen reacciones muy alejadas del metabotismo encrgético. Independientemente de la clase de producto, la velocidad de formacién del mismo en un cultivo celular puede expre- arse en funci6n de la concentracién de biomas: (1.67) donde r, es la velocidad volumétrica de formacién de pro- ducto con unidades de, por ejemplo, kg nr* s", x la concen- ftracién de biomasa y q, la velocidad especifica de forma- i6n de producto con dimensiones T". q, puede calcularse en cualquier instante durante ta fermentacién como la rela ion existente entre la velocidad de produccién y la concen- ‘zacidn de biomasa, ya que su valor no tiene por que ser cons- ‘ante durante el cultivo en discontinuo, Dependiendo de si 41 producto est 0 no asociado al metabolismo energético pueden desarrollarse ecuaciones para q, en funcién de Ia ‘elocidad de crecimiento y de otros pardmetros metabéticos. 11.9.1. Formacién de producto directamente asociado al metabolismo energético Para los productos formados en las rutas que generan ATP, Ja velocidad de produccién esta relacionada con la demanda ‘é enersia por parte de las células. El crecimiento es gene- ‘alimente la funcidn celular que mas energfa requiere. Por lo tanto, si Ia producciGn est& asociada al metabolismo energé- fico, el producto se formari siempre que exista crecimiento. Sin embargo, también se necesita ATP para otras activida- ‘€>sdenominadas de mantenimiento. Ejemplos de funciones ‘ mantenimiento son la movilidad celular, los intercambios ‘ componentes celulares y el ajuste del potencial de la mem- ‘Brana y del pH interno, Las actividades de mantenimiento ‘son realizadas por las células vivas incluso en ausencia de “ex=cimiento. Los productos sintetizados en las rutas energé- ‘Seasse producirsn siempre que se realicen funciones de man- Snimiento debiclo a la necesidad de produecién de ATP. Las ‘expresiones cinéticas de formacién de producto deben con- “Siderar la produccidn asociadsa al crecimiento y la asociada a “Banciones de mantenimiento, como en ta siguiente ecuacisn: er x7 ™,* (11.68) En Ia ecuacién (11.68) r,es la velocidad volumétrica de i6n de biomasa, ¥.,, el rendimiento tedrico o verda- de producto a partir de biomasa, m, la velocidad espe- de formacion de producto debida al mantenimiento y ‘eoncentracién de biomasa. m, tiene dimensiones T-! y tipicas de kg de producto (kg de biomasay" s~!. La (11.68) establece que la velocidad de formacién de depende no sélo de la velocidad de crecimiento 295 sino también de la concentracién de eélulas. De la ecuacién (11.52), ny e8 igual a px; por lo tanto: ; (11.69) Comparando las ecuaciones (11.67) y (11.69) se observa, 4que, para productos asociados al metabolismo energético, 4, es igual a la combinacidn de términos asociados con el ere” cimiento y de aquellos asociados a otros aspectos diferentes al crecimiento: Vc H+ mh) (11.70) = Yim, 11.9.2Formacién de producto asociado de forma indirecta al metabolismo energético Cuando un producto se sintetiza tanto en las vias metabsticas de generacién de energfa como en otras vias que necesitan energia, la relacién entre formacién de producto y crecimien- topuede ser complicada, En este texto no se pretende desarro- Tar ecuaciones para q, para este tipo de productos. Roels y Kossen {10] han dado tn tratamiento generalizado para la for- macin de producto indirectamente asociado al metabolismo cenergético.. 11.9.3 Formacién de producto no asociado al metabolismo energético La producci6n-que no esté asociada al metabolismo ener- 2ético es dificil de relacionar con el crecimiento ya que en este caso el crecimiento y la sintesis del producto estin de alguna manera disociados. Sin embargo, en algunos casos, la velocidad de formacidn de productos asociados a funcio- nes diferentes a la del crecimiento es directamente propor- cional a la concentracién de biomasa, por lo que la veloci- dad de proclaccién, tal como se define en la ecuaci6n (11.67), puede aplicarse con g, constante. Algunas veces q, es una funciGn compleja de Id velocidad de crecimiento y debe ex- presarse mediante ecuaciones empiricas obtenidas a partir de experimentos. Un ejemplo lo constituye la sintesis de la enicilina. Heijnen y col. [18] han obtenido las ecuaciones para la velocidad de produecién de penicilina en funcién de la concentraciGn de biomasa y de la velocidad especifica de crecimiento. 11.10 Cinética de consumo de sustrato en un cultivo celular Las células consumen sustrato del medio ambiente to canalizan en diferentes rutas metab6licas. Parte del sustrato Puede utilizarse directamente en el crecimiento y emi Sint296 Principios de ingenieria de los bioprocesos ‘Tabla 11.10 Coeficientes de mantenimiento para varios organismos que utilizan glucosa como fuente de enengta (De S.J. Pirt, 1975, Principles of Microbe and Cell Cultivation, Blackwell Scientific, Oxford) Microorganismo Condiciones de crecimiento m, (kg sustraro (kg eétulas)*h-!) Saccharomyces cerevisiae ‘Anaerobio 0.036 ‘Anaerobio, 1.0 M NaCl 0360 Azotobacter vinelandii jador de nitrdgeno, 0.2 atm tensiGn de oxtgeno disvelto 15 Fijador de nitr6geno, 0.02 atm tensiGn de oxigeno disuelto ous Klebsiella aerogenes Anaerobio, limilado en tipt6fano, 2 1 NH,CI 2.88 ‘Anaerobio, limitado en triptéfano, 4 g "' NH,CI 3.09 Lactobacillus casei 0.135 ‘Aerobacter cloacae Aerobio,limitadoen glucosa 0.094 Penicillium chrysogenum Acrobio 0.022 sis de producto, mientras que otra parte se utiliza para gene- rarlaenergfa necesaria para las actividades de mantenimiento. El sustrato requerido para el mantenimiento varia conside- rablemente dependiendo del organismo y de las condiciones de cultivo, De este modo, una estimacién completa del con- stimo de sustrato deberfa‘incluir un componente de manteni- miento, La velocidad espectfica de consumo de sustrato para actividades de mantenimiento se conoce como el coeficien- te de mantenimiento, mg Las dimensiones de m, son T-! y Jas unidades tfpicas son kg de sustrato (kg de biomasa)” s“. En la Tabla 11.10 se muestran algunos ejemplos de coefi- cientes de mantenimiento para varios organismos. La fuerza, iGnica afecta fuertemente el valor de m.,, ya que para mante- ner los gradientes de concentracin a través de las membra- nas celulares se necesitan cantidades importantes de ener- sia. La importancia fisiolégica de m, ha sido muy debatida, ya.que existen indicios de que m, no es constante a todas las Yelocidades de crecimiento, para un determinado organismo. La velocidad de consumo de sustrato puede expresarse en funcién de la concentracién de biomasa mediante una ecua- cin andloga a a (11.67) is a7 donde r,es Ia velocidad volumétrica de consumo de sustrato con unidades de, por ejemplo, kg ms, q, Ia velocidad espectfica de consumo de sustrato y x la concentracién de biomasa, Al igual que q,. diene dimensiones T. En el siguiente apartado se desarrollarin ecuaciones para expresar agen funci6n de la velocidad de crecimiento y de otros pars ‘metros importantes del metabolismo. 1.10.1 Consumo de sustrato en ausencia de formacién de producto En algunos cultivos no existe formaciGn de producto extracelular. Por ejemplo, la misma biomasa es el producto en Ia fabricacién de levadura de panaderfa y de protefnas de rigen unicelular. En ausencia de formacién de producto se supondré que todo el sustrato que entra a la célula se utiliza para el crecimiento y funciones de mantenimiento. Las velo- cidades de estas actividades celulares est relacionadas de Ia siguiente manera: a ao Ra tme (11.72) En la ecuaci6n (11.72), 7,¢s la velocidad volumétrica de produccién de biomasa, Y,, el rendimiento verdadero de biomasa a partir de sustrato, m, el coeficiente de manteni- ‘miento y xla concentracién de biomasa, La ecuaci6n (11.72) establece que la velocidad de consumo de sustrato depende enparte de la velocidad de crecimiento pero que varia con la concentracién de células presentes, Cuando ry se expresa ‘mediante Ia ecuaci6n (11.52), la ecuaci6n (11.72) se trans- forma en Si se expresa ten funcién de la concentracién de sustrato mediante la ecuacién (11.60), la ecuacién (11.73) se trans- a rsp Cuando 5 es cero, la ecuacién (11.74) predice que el sustrato se consumiré a una velocidad igual am.,x. El.consu- ‘mo de sustrato en ausencia de sustrato es imposible, por lo que esta situaci6n en la ecuaciGn (11.74) no es realista, El problema surge debido a Ia suposicién implicita que se ha realizado sobre la naturaleza de Tas actividades de manteni- (73) - -( ese . Ys (Ke +8) (11.74)Reacciones homogéneas ‘micnto, Puede observarse, sin embargo, que la ecuacién (11.74) es una descripciGn realista del consumo de sustrato ‘Siempre que exista sustrato en el exterior. Cuando el sustrato ‘<= agota, Ia energia para el mantenimiento es suministrada por medio de un metabolismo end6geno. 11.10.2 Consumo de sustrato con formacién de producto “Los patrones 0 modelos de flujo de sustrato en célula que “Sintetizan productos dependen de si a formacién de produc- fe se encuentra asociada 0 no al metabolismo energético. ‘Cuando se forman productos en las rutas de generacisn de ezergfa, por ejemplo en cultivos anaerobios, la sintesis del "peaducto es una consecuencia inevitable del crecimiento y el mantenimiento celular, De acuerdo con ello, tal como se “govestra en Ia Figura 11.13(a), en laeélula no existe un flujo ‘Separado de sustrato para la sfntesis de producto sino que el ‘peeducto se forma a partic del sustrato tomado como soporte Gelerecimiento y del mantenimiento, El sustrato consumido ‘gestel mantenimiento no contribuye al crecimiento sino que ‘Constituye un flujo de sustrato por separado hacia la célula ‘Potel contrario, cuando el producto no est asociado o par- “Galmente asociado al metabolismo enengético, todo o parte “Eelsustrato necesario para la sintesis del producto es adicio- ‘ea alnecesario para cl crecimiento y el mantenimiento, se ‘saministra por separado, En la Figura 11.13(b) se muestra el “iajo de sustrato en este segundo caso ‘Cuando los productos estén directamente asociados al me- “txbolismo energético, las ecuaciones para In velocidad de “consumo de sustrato no incluyen un término separado para cci6n ya que el sustrato requerido para Ia formacisn producto ya est incluido en los términos de consumo de- to asocindos al crecimiento al mantenimiento, En este > se aplican las ecuaciones presentadas en el apartado erior para consumo de sustrato en ausencia de formacién #0 La velocidad de consumo de sustrato est rela- a con él sustrato necesario para el crecimiento y el ento de a célula mediante las ecuaciones (11:73) En cultivos donde Ia sintesis del producto esté asociado dde forma indirecta al metabolismo energético, Ia velo- d de consumo de sustrato es funci6n de tres factores: Ia slocidad de crecimiento, la velocidad de formacién de pro- sto y Ia velocidad de consumo de sustrato para el mante-~ ento. Estas diferentes funciones de Ia célula pueden re- e mediante el rendimiento y los coeficientes de miento: (1.75) 297 Figura 11.13 Consumo de sustato con formacién de producto: (a) produccidn asociada de forma directa al metabotismo energético; (b) produccién no asoeiada de forma directa al metabolismo ener- sgético, Produce Sustato para el cocina Sustato para ol rmantonmiento ‘Sustato para ol crecmiante ‘Sutra para rmantenimiets Sustato para la producsion donde r,es la velocidad volumétrica de consumo de sustrato, 1 la velocidad volumétrica de produceién de biomasa, r, la ‘Yelocidad volumétrica de formacién de producto, Y,, el ten- dimiento verdadero de biomasa a partir de sustrato, Y,, el rendimiento verdadero de producto a partir de sustrato, m, cl coeficiente de mantenimiento y x la concentracién dé biomasa. Sise expresar, y r, mediante las ecuaciones (11-52) y (11.67): (11.76) 11.11 Efecto de las condiciones de cultivo en la cinética celular La temperatura ejerce un marcado efecto sobre I veloc ‘dad metab6lica. La temperatura tiene una inflsencia direst298 sobre la velocidad de reaccién de acuerdo a la ley de Arrhenius, ademés de poder cambiar la configuracién de los constituyentes celulares, especialmente las proteinas y los ‘componentes de la membrana, En general, el efecto de la temperatura sobre el crecimiento es similar al descrito ante riormente en el Apartado 11.3.4 para enzimas. De manera aproximada puede decirse que la velocidad especifica de crecimiento se duplica por cada 10 °C de aumento de la tem- peratura, hasta que empieza a producirse la rotura estructa- ral de las protefnas y lipidos celulares. Al igual que otras, onstantes de velocidad, el coeficiente de mantenimiento m, presenta una dependencia de Ia temperatura del tipo Arthenius (19), 10 cual tiene un importante efecto cinético ‘en aquellos cultivos donde el intercambio de macromoléculas constituye una contribucién importante a las necesidades de mantenimiento, Por el contrario, Ia temperatura ejerce un efecto minimo sobre el coeficiente de rendimiento de biomasa, ¥,, [19]. Otras respuestas de Ia célula a cambios de temperatura se han descrito anteriormente [1, 20, 21] La velocidad de crecimiento depende del pH del medio en modo similar a como lo hacia la actividad enzimética (Apar- tado 11.3.4). La velocidad méxima de crecimiento se man- tiene generalmente en un intervalo de pH de 1-2 unidades aunque disminuye con variaciones mayores. El pH afecta también al perfil de sintesis de producto en un cultivo anaerobio y puede variar la energia requerida para el mante- jento [1, 20, 21]. 11.12 Determinacién de los parametros cinéticos celulares a partir de datos en reactor discontinuo Con el fin de aplicar las ecuaciones mostradas en los Apar- tados 11.6-11.10 alas fermentaciones reales debemos con0- cer los parimetros y rendimientos cinéticos para el sistema y disponer de informacién sobre velocidades de crecimiento, consumo de sustrato y de formacién de producto. El cultivo en discontinuo es el método aplicado més frecuentemente para la determinaci6n del comportamiento cinético, aunque no siempre esel mas adecuado. A continuacién se describen varios métodos para la determinacién de los pardmetros cinéticos a partir de los datos obtenidos en un reactor di continuo. Principios de ingenieria de los bioprocesos 1.12.1 Velocidades de crecimiento, deformacién de producto y de consumo de sustrato El cflculo de las velocidades de crecimiento en un cultivo celular requiere la medicién de la concentracién de células. Para el célculo de la biomasa se han utilizado muchos pro- cedimientos experimentales diferentes (20, 22]. La medida directa puede realizarse sobre el niimero de células, la masa de células seca o hiimeda, el volumen de células empaqueta~ das 0 Ia turbidez del cultivo. Por otro lado, los métodos indi rectos consisten en medir la formacién de producto, Ia evo- luci6n del calor o Ia composicién celular. La viabilidad de Ia Célula se evalia generalmente mediante técnicas de marca- do 0 tintado. Cada uno de los métodos utilizados para el céleulo de la biomasa daré de algtin modo resultados dife- rentes. Por ejemplo, la velocidad de crecimiento calculada ‘mediante el peso seco de células puede ser diferente al obte- nido mediante el niimero de células porque el peso seco en el cultivo puede aumentar sin el correspondiente aumento en el mimero de células, Independientemente de c6mo se mida la concentracién de ccélulas, las técnicas descritas en el Apartado 11.2 para la diferenciacién grafica de los datos de concentracién pueden utilizarse para calcular las velocidades volumétricas de cre~ cimiento en un cultivo discontinuo. Los resultados depen- ) ,Cusl es la constante de muerte especifica a 100 °C? sin: a ITE9.1 Muerte térmica de las esporas de Bacillus subtilis. T=10°C Calcular el tiempo necesario para matar el 99% de las esporas de una muestra a 100 °% T= 120°C 240% 10° 2.05 x 107 1.75 x 10° 130% 10 ‘Caleular Ia energia de activacién para la muerte térmica de las esporas de B. subtilis. En la Figura 119.1 se muestra una representaci6n semilogaritmica del ntimero de esporas viables frente al tiempo.304 Principios de ingenietia de 1s bioprocesos De Ia ecuaci Ajustando los datos a Iineas rectas se ot (11.88), Jas pendientes de las Iineas en Ja Figura 119.1 son iguales a ~/ snen los siguientes resultados: ., @ las diferentes temperatura. £, (85 °C) = 0.012 min , (0 °C) = 0.032 min #, (110°C) K, 220 °C) La relacién entre k, y la temperatura absoluta viene dada por la ecuaciGn (11.46). Por 10 tanto, una representacién semilogaritmica de , frente a 1/T deberfa dar una linea recta de pendiente =~ E/R donde Tes la temperatura absoluta. Tse convierte a grados Kelvin mediante la ecuacién (2.24). Los valores de 1/T, con unidades K~, se han representado en la Figura 11E9. .61 mise Figura 11E9.2 Clculo de los parietros cinéticos para la muerte térmica de esporas. 10? + (rin) wot 024 0.0025 oom | 00027 .0028 Fe) La pendiente es 27030 K. De la Tabla 2.5, R = 8.3144 J K-! mol", Por lo tanto: = 27080 K (8.3144 JK mol" 25 KI mot! (©) La ecuaci6n de la linea en la Figura 1189.2 es: k= 6:52 10%e2m0T Por lo tanto, aT = 100 °C = 373.15 K, k, (© De la ecuaci6n (11.88): = 2.25 x 10° J mot" 1.23 min” =(nN -InN,)yes homogéneas 305 "Para N igual al 1% de N,, NIN, = 0.01. A 100°C, k,= 0.23 min“! y el tiempo necesario es: 1n(0.01), 0.23 min’ ain Al igual que los organismos contaminantes se destruyen ‘mediante esterilizacién por calor, los nutrientes del medio también pueden destruitse en el proceso. La sensibilidad de Jas moléculas de nutriente a la temperatura se describe me- Giante Ia ecuacién de Arrhenius, ecuacién (11.46). Los valo- ‘25 de las energias de activacién E, para la destruccién tés- ‘mica de vitaminas y aminogcidos son aproximadamente de 84.92 KI mot y para protefnas alrededor de 165 KI mol [3]. Como estos valores son algo menores que los valores ‘tipicos de £, para microorganismos, un determinado aumen- to de temperatura presenta un mayor efecto sobre Ia muerte celular que sobre Ia destruccién de los nutrientes. Esto sig- nifica que Ia esterilizacién a mayores temperaturas durante ortos perfodos de tiempo presenta la ventaja de matar céiu- Jas con destrucci6n limitada de los componentes del medio. 11.15 Resumen del Capitulo 11 Al final del Capitulo 11 se deberta ( comprender Ia diferencia entre reacciones reversibles € irreversibles, y las limitaciones del equilibrio termo- dindmico para representar reacciones celulares y enziméticas; ser capaz de calcular las velocidades de reaccién a partir de datos de concentracién en reactor discontinuo me- diante diferenciacién grafic estar familiarizado con las relaciones cinéticas para reacciones de orden cero, de primer orden y para las reacciones Michaelis-Menten; ser capaz. de determinat los parmettos cinéticos de Jas enzimas v,. y K,, a partir de datos de concentra- cidn en un reactor discontinuo; ser capaz de cuantificarel efecto de la temperatura so- bre las velocidades de reaccién y desactivacién ) Gi) iy) ~ (vi) ser capaz de calcular los coeficientes de rendimiento para un cultivo de eétulas; conocer las relaciones baisicas de la cinética de creci- miento celular y ser capaz de evaluar las velocidades de crecimiento, de consumo de sustrato y de forma- in de producto en un cultivo discontinuo; (viii) ser capaz de analizar el crecimiento en cultivos con inestabilidad de plist (wii) (ix) conocer cémo afectan las actividades de mantenimien- 10 a la utilizacién del sustrato en las células; y (x) ser capaz de describir Ia cinética de muerte celular. Problemas 11.1 Reaccién en equilibrio Calcular fas constantes de equilibrio para las siguientes reacciones en condiciones esténdar: (@) glutamina + H,0 — glutamato + NH," AG: ==14.1 KF mot! (b) malato ~> fumarato + HO AG),=3.2kI mol" {Puede considerarse alguna de estas reacciones com versible? 11.2 Rendimiento en el equilibrio La siguiente reacciGn catalizada por fosfoglucomutasa se produce durante la rotura de glicégeno: sglucosa I-fosfato <> glucosa 6-fosfato Se comieniza una reacci6n afiadiendo fosfoglucomutasa a 0.04 moles de glucosa 1-fosfato en 1 litro de disolucién a 25 °C. Laeaceién procede hasta aleanzarel equilibrio, punto en el que la concentracién de glucosa 1-fosfato es 0.002 My la concentracién de glucosa 6-fosfato es 0.038 M. (@) Calcular la constante de equitibro. (b) {Cual es el rendimiento tedrico? (©) {Cudleselrendimiento basado en la cantidad de reactante suministrado? 11.3 Velocidad de reaccién (@) Se duptica et volumen de un fermentador manteniendo ‘constantes la concentraciGn de células y otras condicio= nes de fermentaci6n. @, {Como se ve afectada la productividad volumésrica? ii) {Como se ve afectada Ia productividad espectiaes? (ii) {Como se ve afectada la productividad total?306 (b) Sien vez de (a) se duplica la concentracién de cétulas, emo se verfan afectadas las productividades volumé- trica, especifica y total? (© Un fermentador produce 100 kg de lisina por di (Sila productividad volumétrica es 0.8 g Fir, geudl es el volumen del fermentador? Gi) La concentracién de células en peso es 20 g I en base seca. Calcular la productividad especifica. 11.4 Cinética enzimitica La lactasa, también conocida como B-galactosidasa, catatiza Ia hidrdlisis de 1a factosa para producit glucosa y galactosa a partir de la leche y del suero. Se realizaron expe- +imentos para calcular los parsmetros cinéticos para la enzi- ma, Los datos de velcocidad inicial se muestran a continta- cién, Concentracién de lactosa Velocidad inieial de reaccién (mol 1" x 10°) (mol H min x 10!) 250 194 227 LoL 184 185 135 Lo 125 178 0730 146 0.460 LT 0.2204 0.779 Caleular Ya, ¥ Ky 11.5 Efecto dela temperatura sobre Ia hidrélisis del almidén Se utiliza c-amilasa de malta para la hidrdlisis de almi- én, Se determiné experimentalmente la dependencia de Ta ‘velocidad inicial de reaccién respecto de la temperatura, Los resultados obtenidos, medidos a unas determinadas concen- traciones de almid6n y enzima se muestran a continuacién, Temperatura Velocidad de producclin Co de glucosa (mmol nr! s) 20 031 30 0.66 40 1.20 60 633 (a) Calcular la energia de activaci6n para esta reaccién. (b) Se utiliza c-amilasa para la hidr6lisis del almidén utili- zado en alimentos infantiles. Se propone llevar a cabo la reacciGn a una temperatura relativamente elevada con el fin de reducir la viscosidad. ;Cémo es la velocidad de reacci6n a 55 °C en comparacién con la de 25 °C? Principios de ingenieria de los bioprocesos (©) La desactivaci6n térmica para esta enzima se describe mediante la siguiente ccuaci6n: Kg 2.25 x 10Mesieer donde k, es la constante de la velocidad de desactivacién cen Ir, R la constante de los gases ideales en cal mol! K*'y T la temperatura en K. ;C6mo es la vida media de Inenzimaa 55 °C en comparacién con la de 25 °C? {Cul de estas dos temperaturas de operacién es més préctica para la fabricacién de alimentos infantiles? 11.6 Reaccién y desactivacién enzimatica Se esta investigando la lipasa como aditivo aun detergen- te de lavanderia para la eliminacién de tinte de fabricacién, La reaccién general es: grasa — icidos grasos + glicerol La constante Michaelis para la lipasa pancrestica es 5 mM. A60 °C, la lipasa est sujeta a una desactivacién con una vida media de 8 min. La hidrélisis de la grasa se realiza en un reactor discontinuo de mezcla perfecta similar a una la- vadora de carga superior. La concentracién inicial de grasa es 45 mol m”. Al comienzo de la reaccién la velocidad de hidrdtisis es 0.07 mmol I" s. ;Cudnto tardard la enzima en hiidrolizar el 80% de la grasa presente? 41.7 Pardmetros de crecimiento para la E. coli recombinante Se est utilizando Escherichia coli para la produccién de hormona de crecimiento porcina recombinante. La bacteria crece en un cultivo aerobio discontinuo con glucosa como sustrato limitante del crecimiento. Se miden las concentra- cciones de células y de sustrato en funci6n del tiempo de cul- tivo, y los resultados obtenidos se muestran a continuacin. Tiempo Concentracin Concentracion de @) de eétulas, x sustrato,s (kg ar) Og or) 00 020 25.0 033 021 48 05 022 248 075 032 246 10 047 243 Ls 1.00 233 20 2.10 20.7 25 442 15.7 28 69 102 30 94 5.2 3. 109 1.65 32 16 02 35 ud 09 3 6 00‘Representar 4 en funcisn del tiempo. Cull es el valor dey,” ©) Cul es el rendimiento observado de biomasa a partir de ‘Sustrato? {Es ¥', constante? Pardmetros de crecimiento para raices peludas ‘Se producen races peludas mediante transformacién ea de plantas utilizando para ello Agrobacteritum genes. Durante el cultivo en discontinuo de rafces pe- sde Atropa belladonna en un fermentador de columna jeante se obtuvieron las siguientes concentraciones de say azicar, Concentracién de biomasa ConcentraciOn de aziicar (s peso seco) (er) 300 1.95 24 421 236 334 21.0 698 184 950 148 103 133 120 97 127 80 1B. 68 =) Representar ten funciGn del tiempo de cultive. ;Cuén- __ dose aleanza la maxima velocidad de crecimiento? 1) Representar la velocidad especifica de consumo de azi- ‘caren funci6n del tiempo. =) {Cuil es el rendimiento observado de biomasa a partir de sustrato? (Es ¥%,, constante? Fermentacién de etanol mediante levadura y bacteria El etanol se produce por la fermentacién anaerobia de la glucosa con Saccharomyces cerevisiae. Para la cepa espe: ica de S. cerevisiae empleada, el coeficiente de manteni- jento es 0.18 kg keh, Yq, es 0.11 kg ke", Yox €5 3.9 kg ke" yt, 8 0.4 br!, Se decide investigar la posibili- cde utilizar a bacteria Zymomonas mobilis en vez de le~ radura para la produccién de etanol. La bacteria Z, mobilis ice etanol en condiciones anaerobias utilizando una ruta etabélica diferente a la empleada por la levadura. Los va- tipicos de Y,, Son inferioresa los de la levadura alrede- 307 dor de 0.06 kg kg”. Por otro lado, el coeficiente de manteni- miento es superior en 2.2 kg kg" Ir, Yy_ para la Z. mobilis es 7.7 ke kg" i,,,€80.3 hr. (a) De la estequiometria, ;cudl es el rendimiento méximo teérico de etanol a partir de glucosa? (©) Ye méximo e igual al rendimiento te6tico cuando existe crecimiento cero y todo el sustrato que entra a la ccélula se utiliza para actividades ce mantenimiento. Sil ‘etanol es el tnico producto extracelular en el metabolis- mo productor de energfa, calcular m, para cada organis- mo. © Se cultivan S. cerevisiae y Z mobilis en feementadores discontinuos, Predecir el rendimento observado a pro- R, la velocidad Eitiea de reacci6n es constante e igual a k, indepen- OR ten tien gl R, desaparece. Sustituyendo R,= Oen la ecuacién (12.15) se obtiene: Gz0 Welocidad votuméten de raccin = en (12.9) k, 4= Cut ggn(r -R) (12.16) en r=R, (12.14) En las aplicaciones de bioprocesado es importante que el iiicleo de las partfculas de catatizador no llegue a quedarse 5 in sustrato. La probabilidad de que esto ocurra aumenta con sSolucién de Ia ecuacién (12.13) con estas condiciones Sin Sustrato. : gues x eg je €ltamafio de la particula, Para reacciones de orden cero pue- (GERAIS Sa a ONSET ver eae ar eS particula para que C, ermanezea > 0. En tal particula, el sustrato se agota justo enel punto central de la partfcula. Por lo tanto, calculando R phaels mR de la ecuaci6n (12.16) con C,: (12.15) I de aplicar en la préctica de- aque generalmente R, es desconocido. Sin embargo, la =i6n puede simplificarse si C,permanece > Oen todos donde Res el radio méximo de particula para C,> 0 (12.17) plo 12.2 Tamaiio maximo de particula para reacciones de orden cero Hamovilizan células no viables de levadura sobre portadores de alginato. Los portadores se encuentran agitados en wa Ae slucosa bajo condiciones anaerobias. La difusividad efectiva de la glucosa en los portadores depende de le dad celular de acuerdo con Ia siguiente relacion: : =633- 7.17,320 Principios de ingenierfa de los bioprocesos donde 2,¢s la difusividad efectiva x 10m?s" ey, es la fraccién en peso de levadura en el gel. La velocidad de consumo de glucosa puede suponerse de orden cero, siendo la constante de velocidad para una densidad de levadura en alginato del 15% en peso, de 0.5 g I min”. Para la méxima velocidad de reaccién, la concentracién de glucosa en el interior de las particulas debe permanecer por encima de cero. (a) Representar el tamafio de particula maximo admisible en funci6n de Ia concentracién de glucosa entre 5 gy 608. (©) Para 30 g I" de glucosa, dibujar R,.. en funcién de la carga de células, entre 10 y 45% en peso. Solucién: (@) A y= 0.15, 91,,= 5.25 x 10-" m?s* Convirtiendo k, @ unidades de kg, m y s: ky = 0SgI"'min™ kg | |1000 1) {1 min 1000 g| [im |'| 60s = 8.33 x 107 kg ms Se supone que C,,¢s igual ala existente en el seno del fluido; C,,en g es la misma que en kg m2. R._, se calcula a partir de la ecuacion (13.17). Cy (kg me) Rm) 5 1.38 x 10 15 2.38 x 107 25 3.07 x 103 45 4.13 x 107 60. 4.76 x 10° Estos resultados se han representado en Ia Figura 12E2.1. A concentraciones de glucosa bajas en el seno del fluido, tas particulas se restringen a pequefios radios. La fuerza impulsora para la difusidn aumenta con C,, hasta que pueden utilizarse Partfculas de mayor tamaiio. Figura 1262.1 Radio de particula maximo en funcién dela con- Figura 1282.2 Radio de particula maximo en funcién de Ia densS- centraciénexteraa de sustrato, dad celular 5 5 4 5 4 5, - é aa J2 * dy 1 1 ° o 1 20 300 400 5060 Ona a Oo 04 as Gu Og rw) . 7 % oe321 kg mr. Como y. varia, los valores de 2, k, se ven asimismo afectados. Los cambios en 2, pueden calcularse Ia ecuaci6n proporcionada. Se supondré que k, €s directamente proporcional a la densidad celular, tal como se la ecuaci6n (11.25), es decir, no existen impedimentos o interacciones entre las células a medida que y, aumen- j6n se muestran los resultados en funcién de y.. ae ky ine ( kg ms") (m) 5.61 x 10” 5.55.x 107 4.27% 10% 4.90 10) 1.11 x 107 2.82 103 4.18 10 1.67 x 107 2.12 103 3.46 x 10" 2.22 x 107 1.67 x 10° 3.10 x 10°" 2.50 x 107 3.10 x 103 stesultados se han representado en Ia Figura 12E2.2. A medida que y, aumenta, 9. disminuye y k, aumenta, Menores isminuyen la velocidad de difusin en el interior de Tas partfeulas mientras que mayores k, aumentan la demanda de to, Por lo tanto, aumentando la densidad de células se aumentan las restricciones debidas ala transferencia de materia, ‘estas condiciones, para asegurar un adecuado suministro de sustrato debe reducirse el tamafio de particula, .4 Perfil de concentracién: cinética de Figura 12.6 Concentraciones de oxigeno medidas y calculadas en Michaelis-Menten y geometria esférica un portador esférico de agarosa con enzima iamovilizada. Dime= ‘ro de la particula = 4 mm; C,,= 0.2 mol m?, Las eargas de enzima Si la reaccién en Ia particula sigue una cinética tipo Mi- son: 0.0025 kg rr” get (q); 0.005 kg m: gel (C); 0.0125 kg m? gel ‘chaelis-Menten, r, toma Ia forma de la ecuacién (11.30) y la (A); y 0.025 kg m gel (@). Las concentraciones medidas se mues- ‘ecuacién (12.7) se transforma en: tran mediante sfmbolos, y los perfiles caleulados mediante lineas, (De CM. Hooijmans, $..M Geraats y KCh.A.M, Luyben, 1990, | ERE RN as) Us ot a oxygen merosenor forthe determination of iin fare dr} K,+C, kinetic parameters of an inmobilised oxygen reducing enzyme donde v.,.. y K,, son los parmetros cinéticos intrinsecos de ™*e!mel Bioeng. 35, 1078-1087) Ta reaccidn. v,.” tiene unidades de, por ejemplo, kg 5! m= pparticula, y su valor depende de la concentracién de células ‘© enzimas existentes en la particula. Debido a la no linealidad de la expresién de Michaelis- Menten no es posible una integracién analitica simple de la ecuacién (12.18). Sin embargo, los resultados para C, en fancién de r pueden obtenerse utilizando métodos numé ‘cos, generalmente mediante ordenador. Puesto que la cinética ‘Michaelis-Menten cae de alguna manera entre las cinéticas dde orden cero y de primer orden (vase el Apartado 11.3.3), las soluciones explicitas mostradas en los Apartados 12.3.2 y 12.3.3 pueden utilizarse para calcular los casos extremos para las reacciones Michaelis-Menten, Los perfiles de concentracién calculados a parti de las ecuaciones presentadas en este apartado han sido verifica- das experimentalmente en diversos estudios. Utilizando microelectrodos especiales con didmetros en la punta del ‘orden de I 4m es posible medir concentraciones de oxfgeno ¢ iones en el interior de sétidos blandos y limos de células. Como ejemplo, en la Figura 12.6 se muestran las concentra-322 Figura 12.7 Perfil de concentracién de sustrato en una limina pla- na infinita sin efecto de la capa limite, Lamina plana clones de oxfgeno medidas en portadores de enzima inmo- vilizada. Los datos experimentales son muy préximos a los perfiles de concentraciGn calculados. Resultados similares se han encontrado en otros sistemas [8-10], 12.3.5 Perfiles de concentracién en otras geometrias Hasta el momento la atencién se ha centrado en catalizadores de forma esférica. Sin embargo, ecuaciones similares a Ia (12.7) pueden obtenerse a partir de balances dde materia en capas para otras geometrias. De todas las otras, formas geométricas, una de las mas interesantes en biopro- cesado es Ia Kémina plana, En la Figura 12,7 se muestra un perfil tipico de concentracién de sustrato para esta geome- tein sin efecto de la capa limite externa. Las ecuaciones para Principios de ingenierfa de los bioprocesos la geometria de lamina plana se utilizan para analizar las reacciones que se producen en las peliculas de células adhe- ridas a s6lidos inertes, siendo la biopelicula lo que constitu- ye la Idmina plana. Incluso si la superficie que soporta la biopelicula es curvada en vez de plana, pueden utilizarse las cecuiaciones desarrolladas para lmina plana si el espesor de la pelicula b es muy pequefio en comparacién con el radio de curvatura, Para simplificar el tratamiento matemitico y ‘mantener el problema en una dimensién (como lo requiere la hipotesis (vii) del Apartado 12.3.1), la Idmina plana se supone que tiene longitud infinita, En la prctica, esta supo- siciGn es razonable si su longitud es mucho mayor que su spesor. Si no, debe suponerse que las terminaciones de la }émina estén cerradas con el fin de eliminar los gradientes axiales de concentracién, Otra forma de catalizador de alguna relevancia en el bioprocesado ¢s cl cilindro hueco, que puede resultar ttl a la hora de realizar el andlisis de los reactores de membrana de fibra hueca. Sin embargo, debido a su aplicacién relativa- itada, esta geometrfa no se considerard en este Los perfiles de concentracién para las geometrias esférica y de lamina plana y para cinéticas de orden cero y de primer orden se resumen en la Tabla 12.1. Las condiciones limite Para fa lmina plana, similares a las ecuaciones (12.9) y (12.10), son las siguientes: en (12.19) G2c, (12.20) donde C,, es Ia concentraci6n de A en la interfase s6lido- liquido, z'la distancia medida desde la superficie interior de Ja lémina y b el espesor de la lamina, 12.3.6 Prediccién de las velocidades de reaccién observadas Las ecuaciones que describen la concentracién de sustrato enel interior del catalizador, como las mostradas en la Tabla 12.1, permiten predecir las velocidades globales de reacci6n. A continuacién se va a considerar a situacién para particu- las esiéricas y cinéticas de primer orden, orden cero y tipo Michaelis-Menten, Ecuaciones anslogas pueden obtenerse para otras geometrias. () Cinética de primer orden. La velocidad de reaccién en cualquier punto de la esfera depende de la constante cinética de primer orden k, y de la concentracién de sustrato en ese punto. La velocidad global para la parti-165 heterogéneas 12.1 Perfies de concemtraci6n en estado estacionario R senh(r Jk TF, ™ > senh(Ryfk; 1 Bye Limina pan?) =, 20shlevh cosh(bs|k; 1p. ky (pe Sauna Pee ea Betrigine C= Cutz "Seniesa abreviatura de seno hiperbélic. Senhxse define como: senhx Cosh es la abrevintura de coseno hiperbélico. Cosh x se define ‘como: eter cosh x= Para C, > en cualquier punto del catalizador ‘cula entera es igual a la suma de las velocidades en cada punto del sélido, Esta suma es matemiticamente equi- valente a la integracién de la expresidn k,C, sobre el volumen entero de la particula, teniendo en'cuenta la vatiacién de C, con el radio expresada en Ia ecuacién (12.11), El resultado es una ecuacién para la velocidad de reacci6n observada r,.,, en una particula: Trot = AAR IoC ERK] Gp, coth (RYT H.)~ 1) (12.21) donde coth es Ia abreviatura de cotangente hiperblica definida como: (12.22) 323 Cinética de orden cero. Siempre que exista sustrato, las reacciones de orden cero evolucionan a una velocidad constante e independiente de la concentracién de sustrato. Por lo tanto, si C, > 0 en toda la partfcula, la velocidad global de reacci6n es igual a la constante de velocidad de orden cero k, multiplicada por el volumen de la parti- cela: Ten = 5 Ri (12.23) Sin embargo, siC, es cero en algiin radio R,, el volumen interno 4/32R,*es inactivo. En este caso, la velocidad de reaceién por particula es igual ak, multiplicado por el ‘volumen activo de particula: 4 Faas =| Vian Se, Ri, (12.24) (iii) Cinética de Michaelis-Menten. Las velocidades obser- vvadas para las reacciones tipo Michaelis-Menten no pue- den expresarse de manera explicita porque no se dispo- ne de una ecuaci6n para C, en funcién del radio. r, puede calcularse, sin embargo, utilizando métodos fu: méricos. 12.4 El médulo de Thiele y el factor de efectividad Los diagramas basados en las ecuaciones de los apartados anteriores permiten calculat r,,,, en relaci6na r’,, la veloci- dad de reaccién que se produciria si todas las células 0 enzimas estuvieran expuestas a la concentracién extema de sustrato. Las diferencias entre r,.,, y r4,muestran inmedia- tamente la extensiGn en la que Ia feaceién se ve afectada por la transferencia interna de materia. La comparacién de estas, velocidades requiere la aplicacién de teorfa como la descrita en los siguientes apartados. 12.4.1 Cinética de primer orden ‘Si una particula de catalizador no se ve afectada por la transferencia de materia, la concentracién de sustrato dentro de la particula es constante e igual a la concentracién en la superficie de reaccién, C,,. Entonces, la velocidad de reac cin de primer orden sin resistencia a Ia transferencia inter nna de materia es igual a k,C,, multiplicada por el volumen de la particu: 4 Re T= GRC 225)324 El grado en que r, es diferente de rz, se expresa median- te el factor de efectividad interna n (velocidad observada) Z -es iad que ocut eel en cualquier punto de la particula (12.26) En ausencia de limitaciones debidas a la transferencia de materia, r,.,.= 73, ¥ 7)= 1; mientras que si existe resistencia ala transferencia de materia, n,< 1. Para el céleulo de 7, Tay ¥ Tygdeberfan tener las mismas unidades, por ejemplo, kg's-! m4, mol s por particula, ete. Para definir r,,., yr pueden utilizarse las expresiones de las ecuaciones (12.21) y (12.25) en la ecuaci6n (12.26) y asf obtener una expresion para 7, el factor de efectividad interna para una reaccién de primer orden: 4 1 = 2" 1RYk Tou, coth(R 75.) -11 227) Entonces, el factor de efectividad intema para una reac- ci6n de primer orden depende sélo de tres parmetros: R, k, Y Bye Estos pardmetros se agrupan generalmente para for ‘mar un grupo adimensional denominado médulo de Thiele. Existen varias definiciones de médulo de Thiele en la bi- bliograffa. Tal como fue formulado originalmente [11], la aplicacién.del médulo era complicada porque se necesitaba una definicin diferente para diferentes cinéticas de reac- Cin y geometrfas de catalizador. Desde entonces se han pro- puesto médulos generalizados que se pueden aplicar a cual- 4uier forma de catalizadory cinética de reaccién [12-14]. El ‘médilo de Thiele generalizado 9 se define como: (12.28) Vy Talc fir a SF (Eine) donde V, es el volumen de catalizador, S, la superficie ex- terna, Cy, la concentracién de sustrato en Ta superficie det catalizador, r, la velocidad de reaccin, r, ea velocidad de reacci6n cuando C,= C,,, 9, lu difusividad efectiva del sustrato y C,., 1a concentracién de sustrato en equilibro, ‘Como se explies en el Apartado 11.1.1, las fermentaciones -y muchas reacciones enzimaticas son ireversibles por lo que C,,_,€8 cero para la mayoria de las aplicaciones biol6gicas Desde el punto de vista geométrico, V/S,= R/S paraesferas b para liminas planas. Las expresiones determinadas a partir de la eouacién (12.28) para cinéticas de primer orden, orden cero y tipo Michaelis-Menten se muestran en la Tabla 12.2 como 4, 4, ¥ Oy fespectivamente. 6 representa una combi nacién adimensional de los parsmetros més importantes que Principios de ingenieria de las bioprocesos afectan a la transferencia de materia y ala reacci6n en siste- mas heterogéneos: el tamafio de catalizador (R 0 6), 1a difusividad efectiva (%,.), la concentraci6n en la superficie (C,.)y los pardmetros de velocidad intrinseca (ky ky © Vg, ¥ K,). Gnicamente el médulo de Thiele para reacclones de primer orden no depende de la concentracién de sustrat. Cuando se agrupan los parimetros R, k, y 2.,, de la ecua- ci6n (12.27) como ¢,, el resultado es: 1 1h,= 3gz (BA c0th34 —D (12.29) donde coth se define mediante la ecuacién (12.22). La ecua- ci6n (12.29) se aplica a geometria esférica y reacci6n de pri- met orden, aunque para Idminas planas se obtienen expre- siones similares, las cuales se muestran en la Tabla 12.3, Asimnismo, en la Figura 12.8 se representa, frente a 9, para catalizadores en forma de esferas, cilindros y laminas pla- nas. Las curvas coineiden exactamente para ¢,—> 0 y 9,9 . y coinciden dentro del 10-15% para el resto del intervalo. La Figura 12.8 puede utilizarse para calcular 7, para cualquier forma de catalizadorsi se calcula @, mediante lnecuacién (12.28). Debido a los errores que se cometen en el ealculo de los parimetros que definen 9, se ha sugerido ‘que las curvas del factor de efectividad se vean como ban- das difusas en vez, de como funciones precisas [15]. Entonces, si se conoce el médulo de Thiele de primer or- den, la Figura 12.8 puede usarse para encontrar el factor de efectividad interno y las ecuaciones (12.25) y (12.26) para predecir Ia velocidad global de reaceién para el catalizador, A valores bajos de , < 0.3, n,, = 1 y la velocidad de reac- cin no se ve afectada por la transferencia interna de mate- tia. Sin embargo, cuando , aumenta por encima de 0.3, n,, disminuye debido a que empieza a ser importante la limita cién debidia ata transferencia de materia. Entonces, el valor del médulo de Thiele indica de manera inmediata si Ia velo- cidad de reacci6n se ve afectada por efectos difusionales 0 si el catalizador esté operando a su maxima velocidad con la concentracién existente en la superficie. Cuando existen fuer- {es limitaciones difusionales a 4, > 10, n,, puede calcularse para todas las geometrfas como: l a9 (12.30) 12.4.2 Cinética de orden cero Cuando el sustrato est dispersado por el catalizador, el clculo del factor de efectividad interno de orden cero n,, es sencillo, En estas condiciones, la reaccién evoluciona 2 la misma velocidad que ocurrirfa si C,= C,_a través de la par- ‘cula, Entonces, de la ecuacién (13.26), Ng=l y:OO UNIVERSIDAD pg PAMPLONA BIBLIO7g., 33 édulos de Thicle generalizados ssn fasenal “ones safe ota) SAR k, 230, hasta cero dentro del catalizador, el fac- vidad debe calcularse de manera diferente. En ‘viene dado por la ecuacién (12.24) y el factor interno es: De acuerdo con el anilisis anterior, para una einética de orden cero, en primer326 Principios de ingenieria de los bioprocesos ‘Tabla 12.3 Factores de efectividad (¢ para cada geometrfa y orden cinético tal como se han definido en la Tabla 12.2) Reaccién de primer orden: r,=k, Cy 34 coth34, 1) Esferat Th = Lamina plana? Reaceién de orden cero: ry Esters? para0<¢@,<0577 Esferat para 9,> 0.577 2 ante pao ( 34 Lémina plana para0<4, <1 para 4,>1 "Cotes la abreviatura de cotangente hiperbélica, Coth x se define como: ett coth x= . ene " Tanh es la abreviatura de tangente hiperboica, Tanh x se define como: tanhx ete * Cos es Ia abreviatura de coseno. La notacién cos” x(0 arccos » significa cualquier ngulo cuyo coseno es x. Las ngulos uilizados para caleular eos y cos" estin expresados en radianes. siel sustrato se agotao no dentro del catalizador, entonces y sies as{ conocer el valor de R,,. Generalmente esta informs- cin es muy dificil de conseguir porque no es posible medir ‘concentraciones intraparticulares. Afortunadamente, un and lisis matemitico més avanzado [7] soluciona este problema representando él sistema en términos de propiedades medibles como R, ,..C,,y ken vez de R, Estos parémetros definen el médulo de Thiele para las reacciones de orden cero, @,, En la Tabla 12.3 y en la Figura 12.9 se muestran los. resultados asf obtenidos. C, permanece > 0 y T= 1 para 0<¢,< 0.577; para g,> 0.577, np disminuye conforme mas parte de la particula se va volviendo inactiva, En la Tabla 123 yen la Figura 12.9 se muestran ademés los factores de efectividad para sistemas con geomettfa de liminas planas. En peliculas planas, @,= 1 representa Ia condiciGn limite para agotamiento de sustrato, Las curvas de n, para geome- ‘rfas esférica y de lamina plana coincide exactamente a valo- res de g, pequeiios y grandes, 12.4.3 Cinética Michaelis-Menten Para un catalizador esférico, Ia velocidad de Ia reaccién tipo Michaelis-Menten en ausencia de efectos debidos a la transferencia interna de materia es: af Yen Cae anima) (12.33)327 indica de orden cro Figura 12.8 Factor de cfectividad interno n, en Tuncién del médulo de Thiele generalizado 4, para cinética de primer orden y geometrias esfé- rica, cilindrica y de Mii- ‘na plana. Los puntos re presentan los céleulos sobre cilindros y paralele~ ppedos huecos o finitos. (De R. Aris, 1975, The Mathematical Theory of Diffusion and Reaction in Permeable Catalysts, voll, Oxford University Press, London.) Figura 12.9 Factor de efectividad imterno ny en funeién del médulo de Thiele generalizado 4, para cinética de orden ‘cero y geometries esl cay de limina plana,328 = (rime orden) Geomatria de mina pana Principios de ingenier‘a de los bioprocesos Figura 12.10 Factor de efecividad interno Tae funcién del modulo de ‘Thicle generalizado $y ¥ del parémetro B para cinética del tipo Mi- chaelis-Menten y geome- trias de lémina plana B=kJC,. (De R. At 1975, The Mathematical Theory of Diffusion and Reaction in Permeable Catalysis, vol, Oxford University Press, Lon- don) El andlisis para este caso particular no puede continuarse en este texto porque no se dispone de una ecuacién para 7 soye Por lo tanto, no puede desarrollarse una expresi6n ana- iftica para n,,, en funcién de ¢,. Las ecuaciones de difusién- reaccién para cinéticas tipo Michaelis-Menten se resuelven generalmente mediante métodos numéticos realizados por ‘ordenador. Por ejemplo, en la Figura 12.10 se muestran los resultados obtenidos para una geometria de lamina plana en funcién de B, que es igual a K,/C,, Valores aproximados para 1), pueden obtenerse conside- rando como asintotas de la ecuacién de Michaelis-Menten los obtenidos con cinéticas de orden cero y de primer orden. Como se mostré en Ia Figura 12.10, las curvas para n,, caen entre las Iineas correspondientes a Ins reacciones de orden cero y las de primer orden. La posicién exacta depende del valor de B. Cuando —> es, la cinética de Michaelis-Menten puede aproximarse a la cinética de primer orden y el factor de efectividad interno calcularse a partir de la Figura 12.8 con k,= v,,,/K,- Cuando B -> 0 puede aplicarse la reacci6n de orden cero y la Figura 12.9 con k,= v,,.. Los factores de cfectividad para f entre cero e infinito deben calcularse me- diante métodos numéricos. La utilizacién del médulo de ‘Thiele generalizado tal como se ha definido en la Tabla 12.2 elimina casi todas la variaciones en el factor de efectividad interno con diferentes B, excepto en la proximidad de ¢, ‘Como se muestra en Ia Figuras 12.8 y 12.9, el médulo gene- ralizado tiende a juntar las curvas del factor de efectividad para todas las formas de catalizador en las dos asfntotas, $= 0y 6—¥c0. Porlo tanto, la Figura 12.10 es vélida para catalizadores esféricos si g, es mucho menor 0 mucho ma- yor que I. Debe tenerse en cuenta, sin embargo, que la va- Tiacién entre geometrias en a regién intermedia alrededor de @.,= 1 puede ser importante [16] Silos valores de 4, y B correspondientes a la cinética Michaelis-Menten no pueden obtenerse de manera aproxi- ‘mada mediante las ecuaciones de las cinéticas de orden cero © de primer orden, n,, puede calcularse mediante la ecua- cin propuesta por Moo-Young y Kobayashi (17]: Tha + Bi n= SB 4234) donde B = K,/C,. Ty es el Factor de efectividad interna de ; mientras que ,, es el factor de efectividad de sn obtenido utilizando los valores de ¢, calcula- dos con &,=v,,/K., Para geometrfa de kimina plana, la ma- yor desviacidn de ia ecuacién (12.34) respecto de los valo- Tes exactos de 7), €8 0.089, el cual se produce a 9,= ly B= 0.2. Para geometriaesférica, la mayor desviacién se produce alrededor de @, = 1.7 y B= 03, siendo el maximo error en esta regiGn de 0.09. Una descripcién més detallada de este caso puede encontrarse en el articulo original [17].cacciones heterogéneas 329 plo 12.3 Velocidades de reaccién para enzimas libres e inmovilizadas Se inmoviliza invertasa en una resina de intercambio i6nico que utiliza portadores de 1 mm de diémetro medio. La eantidad de enzima en los portadores se mide mediante un ensayo de protefna y es de 0.05 kg m=. Seempaquetan 20 cm? de “Portadores en un pequefio reactor de columna y se bombean répidamente 75 mil de solucidn de sacarosa con una concentra- 16 mM a través del lecho, En otro reactor se mezcla en el mismo volumen de soluci6n de sacarosa una cantidad atica de enzima libre. Suponer iguales los parmetros cinéticos para las enzimas libres y las inmovilizadas: K,, es 8.8 My el niimero de transacciones es 2.4 x 10° mol glucosa (g enzima)"'s"', La difusividad efectiva de Ia sacarosa en la ‘resina de intercambio i6nico es 2 x 10-* em? s*, Solucién: reacci6n de la invertasa es: C,H,0,, + H,0 > C,H,,0, + CH,,0, ‘sacarosa flucosa fuctosa Convirtiendo los datos a unidades de mol, m y s. 88x10" mol litro 1000 titros| Siel flujo. través del reactor es ripido puede suponerse que C, es igual ala concentracién de sacarosa en el seno del fluido Co: 16x10" mol =16mM=—" Enel reactor de enzima libre: 10“kg 75 om Coneentracién de enzima La produccién de 1 mol de glucosa consume 1 mol de sacarosa, por lo que k,= 2.4 x 10° mol sacarosa (g enzimay"! “De In ecuaci6n (11.33), v,, 8 obtiene multiplicando el niimero de transacciones por la concentracién de enzima activa. mniendo que toda la enzima presente es activa: 24107 mol va =3.19 x 107 mol ms" 33 x 107 kg mr) {1000 | Tkg330, Principios de ingenieria de los bioprocesos La reacci6n de la enzima libre tiene lugar con una concentracién uniforme de sacarosa, C,,. La velocidad volumétrica de reaccién viene dada por la eduacin de Michaelis-Menten: Van Cyy _ 3.19107 mol m? s7!)(16 mol m KytCy 8.8 mol m” +16 mol m® 2.06%10 mol m= s* La velocidad total de re: in es v multiplicada por el volumen de Ifquido: 5)¢15 em?) | 1 Velocidad de reaccién = (2.06%107 mol nr {00 em = 1.5510 mol (b) Para reacciones heterogéneas, v.., se expresa tomando como base el volumen de catalizador. Entonces: 2.4x107 mol = = = 0.12 mol sm? particula. 1000 i Joos Kem he Para calcular el efecto de la transferencia de materia debe calcutarse el valor de 1), El método utilizado depende de los valores de B y 4,: K,,_ 8.8 mol m Cy 16molm 55 De la Tabla 12.2 eal eva ees BBs GalaG)] : 5x10“ m 0.12 mol m= 1 oss_\]# $= Ge V@x 10 mis ES ee uf 2535)] =071 ioe Puesto que tanto B como ¢,, presentan valores intermedios, la Figura 12.10 no puede aplicarse para geometrfa esférica; debiendo utilizarse en este caso la ecuacién (12.34). De la Tabla 12.2: oRa lke WRBV ELC, R ¥, | Yo WIV G.Cn 5x10* m 0.12 mol m™ s WE VO x 10" m's\16 mol m™) =072 De la Figura 12.9 o de la Tabla 12.3, n, = 0.93. De igual manera:Ja Figura 12.8 0 de la Tabla 12.3, n, _ 0.93 + 0.55(0.54) mecsscs) °° 331 54, Sustituyendo estos resultados en la ecuacién (12.34): ‘La velocidad de la reaccién con enzima inmovilizada sin limitaciones difusionales es la misma que para la enzima libre: §5 X10 mol s. La velocidad de reacci6n para la enzima inmovilizada es e179% de Ia de la enzima libre incluso aunque cantidad de enzima presente y la concentracién externa de sustrato sea la mist: ‘Velocidad observada = 0.79 (1.55 x 10 mol s*) = 1,22 x 10 mol s*! 4 El modulo de Thiele observable ‘Lateoria de la difusin-reacci6n presentada en los aparta~ ‘anteriores permite cuantificar el efecto de la transferen- ‘momento es que son titiles Gnicamente si se conocen parimetros cinéticos intrinsecos 0 verdaderos de la reac- oy, 0 v,,, Y K,- En muchos casos, estos valores son jos J, tal Como se mostré en el Apartado 12.9, ser dificiles de evaluar para sistemas biol6gicos. Una para solventar este problema consiste en aplicar el jo de Thiele observable ©, algunas veces denominado jo de Weisz {18}, y que se define como: Taste o- () By) F.C, nde V, eset volumen de catalizador, S, la superficie exter Ta velocidad de reaccin observada por unidad de lumen de catalizador, &,, 1a difusividad efectiva del rato y C,, Ia concentraciGn de sustrato en la superficie exiema, En fa Tabla 12.4 se muestran las expresiones de csfers y liminas planas. El ello del médulo de Thiele observable no requiere el conocimiento a priori de los ros cinéieos sino que se define en tGzminos de la "velocidad de reaccicn medida, r,.,, ara que el m6dulo de Thiele observable sea titi es nece- sario relacionar © con el factor de difusividad intema n, (a2.35) Algunas célculos mateméticos con las ecuaciones anterior mente presentadas en este capftulo permiten obtener las si- zguientes relaciones para cinéticas de primer orden, de orden cero y tipo Michaelis-Menten: Primer orden: = g'n,, (12.36) Orden cero: © = 2¢in,, 1237) Michaelis-Menten: ©=2¢2n, (14-6) 1+B1n| 2 = +B (1238) ‘Tabla 12.4 Modulos de Thiele observables RY 4, aca = (2) lame a (5) Cus Lee 0-0 _Las ecuaciones (12.36)-(12.38) se aplican a todas fas Beo- mietrfas de catalizador y permiten representar® frentea Tm 2 = . oe —E——e = =©£©=——=—=<—@O20: ae |332 Principios de ingenieria de los bioprocesos igura 12.11 Factor de p02 (primer order) mon Geometviaestrica cfectividad interno n, en funcién del médulo de Thiele observable para geometra esférica y-cinéticas de primer or- ‘den, de orden cero y tipo Michaelis-Menten, B= KC. (De WH. Pitcher, 1975, Design and operation of inmobilized enzyme reactors, En: R.A. Messing, Ed, Immobilized Enzymes For industrial Reactors, pp.151-199, Academic Press, New York.) =0 (econ core) TTT T + oot i oot ony o4 1 © 100 LL 10 artir de relaciones entre @ y n, desarrolladas en apartados anteriores y representadas en as Figuras 12.8-12,10. En la Figura 12.i1 se muestran las curvas para catalizadores esfé- ricos y cinéticas de primer orden, de orden cero y tipo Michaelis-Menten, y en la Figura 12.12 los resultados para la geometria de lamina plana. Todas las curvas correspon- dientes a valores de B entre cero ¢ infinito se encuentran situadas entre las lineas que representan las cinéticas de pri- met orden y de orden cero. A cualquier valor de B, las curvas coinciden en las regiones asint6ticas ® > 0y@ — . para todas las geomettfas, mientras que a valores intermedios de ‘® la variacién entre los factores de efectividad para las dife- . rentes geometrfas puede ser importante. Para © > 10: Cinética de primer orden 1, = (12.39) 2 Cinética de orden cero thy = 2.40) Aunque © es un médulo observable independiente de parimetros cinéticos como ¥,,. y K,, In utilizacién de las Figuras 12.11 y 12.12 para reacciones tipo Michaelis-Men- ten requiere el conocimiento de K, para calcular el valor de a B. Esto dificulta la aplicacién del médulo de Thiele observa- ble para cinéticas del tipo Michaelis-Menten. Sin embargo, se sabe que los factores de efectividad para reacciones ‘Michaelis-Menten caen entre las curvas de primer orden y de orden cero de las Figuras 12.11 y 12.12, por lo que siempre pueden calcularse los limites superior e inferior de Mes 12.4.5 Criterios de Weisz De las Figuras 12.11 y 12.12 pueden realizarse las siguien- tes consideraciones de caracter general ‘Si@<03,n,=1 y las limitaciones debidas a la transferen- cia interna de materia son despreciables. Si@>3,7, es sustancialmente < 1 y las limitaciones debi das a Ia transferencia interna de materia son importantes. Los razonamientos anteriores se conocen como los crite- rios de Weisz y son validos para todas las geometrias y ccinéticas de reacci6n. Para valores de & comprendidos en el intervalo intermedio, 0.3 < @ < 3, es necesario realizar un andlisis més detallado para determinar Ia influencia de la transferencia de materia sobre la velocidad de reacci6n.es heterogéneas 333 Figura 12.12 Factor de cfectividad interno n,en funcién del médulo de Thiele observable @ para geomettia de Limi- na plana y cinéticas de primer orden, de orden cero y tipo Michaelis- Menten, B= Ky/C. (De WAH. Pitcher, 1975, Design and operation of inmobilized enzyme reactors. En: R.A. Messing, Ed, Immobilized Enzymes For Industrial Reactors, pp.151-199, Academie Press, New York.) 4 == (primerenden) piiiil ‘Georstria de timina pana a1 on 1 10 100 io 12.4 Transferencia interna de oxigeno hacia células inmovilizadas ide rii6n de cria de hamster se encuentran inmovilizadas en portadores de alginato. El didmetro de partfcula medio ‘5 mm. La velocidad de consumo de oxfgeno con una concentracién en el seno del fluido de 8 x 10° kg O, m es 10° kg s“' mr” catalizador. La difusividad efectiva del oxfgeno en los portadores es 1.88 x 10” m? s*. Supéngase que itracién de oxigeno en la superficie del catalizador es igual a la existente en el exterior y que el consumo de ssigue una cinética de orden cero. ‘importante la transferencia interna de materia? ‘velocidad de reaccién se observaria si se eliminara la resistencia difusional? ‘apreciar la transferencia interna de materia debe de calcularse el médulo de Thiele observable. De la Tabla 12.4, -2eometrfa esférica: Ga. 5x107m =25x107m 25x10%m)____BAx10~kg stm? 3 (1.88 x10 m?s"!)(8 x 10° kg m~*)334 Principios de ingenieria de los bioprocesos Utilizando el criterio de Weisz. se obtiene que Ia transferencia interna de materia es importante. () Para catalizadores esféricos y reacciones de orden cero, de la Figura 12.11, para ® = 3.9, n,= 0.4. De la ecuacién (12.26), sin restri 8.4.x 10°%kg m Es 04 12.4.6 Concentracién minima de sustrato enel interior del catalizador Algunas veces es interesante conocer Ia concentracién minima de sustrato C,.,,, existente en el interior de catali- zadores s6lidos. Esta informaci6n puede utilizarse para com- probar, por ejemplo, que la concentracidn no cae por debajo de algtin valor critico para el metabolismo celular. C,.., S& calcula ficilmente para reacciones de orden cero. Si @ @s tal ue T,< 1, C.qy, €8 Cero porque n,= I si C,>0 a través de toda la partfcula. Para n,= 1, lautilizacién de las ecuaciones presentadas anteriormente en este capitulo permiten calcu- lar C, ,ay- Los resultados asf obtenidos se resumen en la Ta- bia 13°5, 12.5 Transferencia externa de materia ‘Muchas de las ecuaciones mostradas en los Apartados 12.3, y 12.4 contienen el término C, , la concentracién de sustrato ‘A on la superficie extema del catalizador, Este término se tus6 en el andlisis de las condiciones limite utilizadas en Ia solucién del balance de materia en una capa, donde se supo- fa que C,, eta una cantidad conocida. Sin embargo, dado que las concentraciones en la superficie son muy diffciles de medi con precisién, deben encontrarse diferentes maneras de calcular C,, aplicando principios te6ricos. ‘ones difusionales a la velocidad de reaccién seria: = 21x10 kg sm” catatizador La disminucién en ta concentracién de sustrato desde C,, presente en el seno del liquido hasta C,, presente en Ia st= perficie del catalizador se produce a través de la capa limite ‘que rodea al solido. En ausencia de capa limite, C, = C,,, que es fcilmente medible, Cuando existe capa limite, el valor de C,, ¢s inferior a C,,. La velocidad de transferencia de materia a través de Ia Gipa limite viene representada por la siguiente ecuacién (Apartado 9.4): Ny=ka(Cy- Cy) (12.41) donde N, es Ia velocidad de transferencia de materia, k, el Coeficiente de transferencia de materia en la fase Uquida con dimensiones LT~' y ael érea de Ia superficie externa del catalizador. SiN, se expresa por volumen de catalizador con uunidades de, por ejemplo, kmol s"'m-, para que la ecuacién sea consistente, a debe expresarse en unidades basadas en el volumen de catalizador, como por ejemplo, m? mo m-! Utilizando la notacién anterior del capitulo, a en la ecuacion (12.41) es igual a S,/V, para el catalizador. En estado esta- ionario, la velocidad de transferencia de sustrato a través de la capa limite debe ser igual a la velocidad de consumo porel catalizador, ,.,,..Por lo tanto: S, Fase By (Cu-Cu) (12.42) donde r,.,, es Ia velocidad por volumen de catalizador. Reordenando, se obtiene: ‘Tabla 12.5 Concentracién minima de sustrato en el interior del catalizador para cinéticas de orden cera (@ para cada geometria esté definido en 1a Tabla 12.4) Esfera Can ‘Lamina plana’ Cyan =0 para tb > 0.667 para b < 0.667 para 2 2 para <2(12.43) La ecuacién (12.43) puede utilizarse para calcular C,, an- de apticar las ecuaciones en los apartados anteriores y asf ar las concentraciones internas de sustrato y los facto- de efectividad. La magnitud de los efectos de la transfe- externa de materia puede calcularse mediante la ecua- (12.43), Que la concentracién de sustrato en la superfi- es aproximadamente igual a la existente en el seno del ido, C,,/C,y~ 1, indica que no existen limitaciones debi- ‘das a la transferencia externa de materia. Por otro lado, €.JC,,<<1 indica un gran gradiente de concentracién en la ‘capa limite y unos efectos muy importantes debidos a la trans- ferencia externa de materia. A partir de la ecuacién (12.43) puede definirse un médulo observable para la transferencia externa de materia, : eas Shaw 12.44) En la Tabla 12.6 se muestran las expresiones de para diferentes geometrias de catalizador. Los crterios para valo- ‘ar la transferencia externa de materia son los siguientes: SiQ << 1, C,=C,, y los efectos de la transferencia ex- tera de materia son despreciables Por otro lado, si C,.< Cy, los efectos de la transferencia externa de materia son importantes, Para reacciones afectadas tanto por la transferencia inter- nna como externa de materia, puede definirse un factor de efectividad total n,: (velocidad observada) ;, [velocidad que ocurtiria si C, =C,, en toda la particula (1245) Thy Puede relacionarse con el factor de efectividad ny, y Ia ecuaci6n (12.45) escribirse como: mM, (12.46) donde n, es el factor de efectividad externo y n, el definido en Ia ecuacién (12.26). Por lo tanto, n, tiene el siguiente significado: 335 ‘Tabla 12.6 Médulos observables para Ia transferencia externa de ‘materia Esfora ‘Lémina plana a Tao So Reacci de orden cero: r, = Nast = Yan, RReaccién Michaelis-Menten: mE velocidad que ocurtiria si C, = C, ( en toda la particula i (velocidad que ocurriria si C, = Cy, ) Luineeomme ne! (1247) En la Tabla 12.7 se muestran las expresiones de 1), para cinéticas de primer orden, de orden cero y tipo Michaelis Menten, Para reacciones de orden cero, cuando C,, y C,>0, To= 1. Sin embargo, N.y= | no significa que no éxista Capa limite externa; incluso si existe una disminucién de concen- tracién a través de la capa limite, debido a que rz, y m, son independientes de C,, n.,= 1. Ademés, n,,= 1 no implica que eliminando la capa imite externa se mejore la velocidad de reaccién. Eliminando la capa limite se aumentarfa el va lorde C,, y se establecerfa una mayor fuerza impulsora pars la transferencia interna de materia, reduciendo deeste mad la probabilidad de que C, disminuya a cero enel interiord= Ja particula,336 Principios de ingenieria de los bioprocesos Ejemplo 12.5 Efecto de la transferencia de materia en la desnitrificacién bacteriana Para Ia eliminaci6n de nitratos en aguas subterrdneas se utilizan bacterias desnitrificantes inmovilizadas en portadores de gel en un reactor agitado. A una concentracién de nitratos de 3 g m=, la velocidad de conversin es 0.011 gs! m= catalizador. La difusividad efectiva del nitrato en el gel es 1.5 x 10” m? s“, los portadores son de 6 mm de didmetro y el coeficiente de transferencia de materia liquido-sotido es 10° ms". K, para las bacteria inmo ilizadas es aproximadamente 25 gm, (a) ¢Afecta la transferencia externa de materia a la velocidad de reacciGn’? (b) {Son importantes los efectos de Ia transferencia interna de materia? (€) {Cuénto se mejorarfa la velocidad de reaccién si se eliminardn las resistencias externa e intema a la transfere ‘materia? Solucién: 6x10m a El efecto de Ja transferencia externa de materia se encuentra calculando Q. De la Tabla 12.6: =3x10%m 10m 0.011 gs" 2 Caw 3 G0" ms*)3 gm) ~ Como este valor de © es relativamente grande puede concluirse que la transferencia externa de materia influye sobre la velocidad de reaccién. De Ia ecuaci6a (12.43): 037 Gi =063 63 Cy, = 0.63 3 gm) =1.9 gm (b) Calcular ef médulo de Thiele observable con C, oi) 32 3) Cu ors) 0.011 gs 3) (3x10? ms) 09em)~ > .9 g m- mediante la ecuaci6n para esferas de la Tabla 12.4: m Utilizando el criterio de Weisz, los efectos de la transferencia intema de materia son importantes (©) Dado que la concentracién de nitratos es mucho més pequefia que K,, puede suponerse que Ia reaceién es de primer orden. De la Tabla 12.7: ¢ = 8-063 mao La Velocidad de reaccién en ausencia de los efectos de la transferencia de materia es ry mediante la ecuacién (12.45), Por lo tanto, m, puede calcularse si se conoce 1,,. De la Figura 12.11,a © = Como n, = 0.63, de Ia ecuacién (12.46): Mes = Nyy N= O.2I (0.63) = 0.13 Por lo tanto, de Ia ecuacién (12.45): Ia cual esté relacionada con 7.9, 9, N= 0-21 + _Tasm _ 011g Toa OTE 085 g En ausencia de efectos difusionales, la velocidad de reacci6n se aumentarfa 7.7 veces, aproximadamente.heterogéneas Correlaciones para calcular la transferencia de materia liquido-sélido ‘Para conocer los efectos de la transferencia externa de ma- Sa es necesario calcular el coeficiente de transferencia de da k,, que depende de Ia hidrodindmica del reactor y de s del Iiquiddo como la viscosidad, la densidad y la idad. Es dificil calcular el valor de k, con precisién, Jimente para particulas con propiedades flotantes. Sin >, su valor puede calcularse mediante correlaciones ates en Ia bibliografia, as cuales se cumplen bajo las, fciones especificadas con una precisién del 10-20%. A. nuacidn se muestran algunas correlaciones selecciona- ‘aunque una informacién més detallada puede encontrar- fen varios libros de texto de ingenierfa quimica {19,20}. Las correlaciones para k, se expresan utilizando los si- ents grupos adimensionales: Poti Pr a {mero de Reynolds (de particula) (12.48) He Se=Nimero de Schmidt= (12.49) oa Sh =Niimero de Sherwood =~ 5 (1250) Dip.(P,~P.) me Gr=Nimero de Grashof (1251) donde D, es el difmetro de particula, u,, [a velocidad tineal ‘de [a paiticula en relacin con la existente en el seno del Aluido, p, la densidad del tfquido, 1, la viscosidad del Kqui- do, %,, la difusividad molecular del componente A en el Tiquido, &, el coeficiente de transferencia de materia liqui- o-s6lido, g la aveleracién de la gravedad y p, tn densidad de la particula. El nimero de Sherwood contiene el coefi- ciente de transferencia de materia y representa la relacién enire las velocidades de transferencia de materia global y por difusién a través de la capa limite, El nimero de Schmidt representa la relaci6n entre Ia difusividad de Ia cantidad de ‘movimiento y la difusividad masica, y esté construido a base de propiedades fisicas del sistema. A temperatura, presién y composicién constantes, Sc es constante para fluidos new- fonianos. El nimero de Grashof representa la relacién entre Jas fuerzas gravitacionales y as fuerzas viscosas y es impor- 337 tante cuando las particulas presentan caracteristicas flotan- tes, La forma de la correlaci6n utilizada para calcular Sh y por tanto k, depende de la configuracién del sistema de trans- ferencia de materia y de las condiciones del flujo entre otros factores. 12.6.1 Particulas esféricas en movimiento libre Las ecuaciones agut presentadas se aplican a particulas solidas en suspensi6n en reactores agitados. La velocidad de transferencia de materia depende de la velocidad del s6lido en relaci6n’con la del Iiquido, también denominada veloci- dad de deslizamiento. La velocidad de deslizamiento es i- ficil de medir en suspensiones y debe calcularse previamen- teak, Las siguientes ecuaciones permiten calcularel ngime- ro de Reynolds de particula, el cual incorpora Ia velocidad de deslizamiento, «,, [71 Para Gr < 36 Re, W8 (12.52) Para 36

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