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Se llama técnica histológica a la serie de pasos que han de darse para obtener un preparado
observable con el microscopio óptico. Es un proceso largo que abarca desde el momento en
que se
toma el material hasta que el preparado puede observarse.
PASOS:
1.- Toma de material.
2.- Fijación
3.- Deshidratación
4.- Aclaramiento
5.- Inclusión
6.- Modelado del bloque
7.- Sección con el micrótomo extendido de los cortes
8.- Coloraciones: de rutina o especiales
Comentario:
Procedimientos generales:
Si se extraen varios órganos se debe tener cuidado en registrar cada trozo de órgano
Envolviéndolo en una gasa o bien pasando un hilo directamente por un extremo del órgano,
mientras quede el extremo opuesto se coloca un trozo de cartulina resistente donde se
escribe con lápiz las indicaciones (órgano, porción, etc.) del caso, todo esto es necesario si
las muestras a extraerse son muchas pues luego se verá dificultado el reconocimiento.
La cantidad de líquido fijador en microscopia óptica debe ser aproximadamente 10 a 20
veces el volumen de la muestra.
Los fragmentos de órganos no deben ser mayores de 1 cm de espesor; deben ser tomados en
ángulos rectos a la superficie de los órganos y deben ser suficientemente profundos para
comprender los constituyentes anatómicos normales como por ej. cápsula, corteza, médula,
etc. A veces pueden cortarse trozos de órganos de mayor tamaño, 2 o 3 cm y luego de
algunas horas en fijador en que las piezas están más fáciles de manejar, se realizan cortes
más pequeños de los mismos.
¿Cómo realizar las secciones?
Los trozos de órganos tubulares se seccionan directamente con tijeras, los macizos han de
ser “desprendidos” con las tijeras.
Extraídos los órganos deben seccionarse en fragmentos, para esto se debe utilizar una hoja
de afeitar o de bisturí (se utilizan a manera de serrucho sin presionar). Los bordes cortados
con tijeras se seccionan y se desechan, porque comprimen los órganos y los deforman.
2.- Fijación:
Concepto:
La fijación es una operación destinada a “matar” las células, conservándolas, cuanto sea
posible en el estado en que están durante la vida.
Introducción:
Una buen a fijación debe:
- inmovilizar la célula
- conservar exactamente todas las partes constitutivas.
- no hacer aparecer artificialmente otros detalles en la estructura.
Tal fijación es por ahora imposible de realizar.
Una acción rápida y enérgica del reactivo impide bien las alteraciones espontáneas
postmortem, pero este modifica también la estructura celular.
Los mejores fijadores son los que además de actuar rápidamente producen el menor numero
posible de reacciones (modificaciones) secundarias o artificios, capaces de darnos una idea
muy falseada de la morfología interna de la célula.
Un tejido bien fijado mostrará células plenas, no vacuolizadas, ni hinchadas, ni arrugadas,
sino presentando muchos detalles de estructura fina.
¿En qué consiste esencialmente la fijación? :
Es verdad que la masa celular, formada de albuminoides, no puede ser conservada
exactamente, sino es por un proceso que la solidifique. Esta solidificación se obtiene por
coagulación o precipitación.
La coagulación es producida por agentes físicos, la precipitación, siempre acompañada de
modificaciones químicas, es producida por agentes químicos.
La rapidez de acción de un fijador debe tener por objeto el de “matar” lo más pronto
posible las células. La precipitación total, por el contrario, debe producirse adecuadamente
de modo que no se produzcan contracciones.
“La muerte de la célula debe ser inmediata y su coagulación debe ser mediata”.
Agentes fijadores:
Los agentes fijadores pueden ser de orden físico o de orden químico.
Agentes Físicos:
- Frío:
No puede ejercer ninguna acción fijadora a temperaturas que no pasen de 0° C. Endurece
los tejidos y suspende las alteraciones celulares debidas a la necrosis y a la autodigestión.
Este agente no sería más que una ayuda.
La congelación de los tejidos frescos parece ser a priori, un detestable procedimiento
histológico. El aumento de volumen de los líquidos que los llenan y la formación de agujas
de cristales no puede evitar la producción de verdaderos deterioros. Su única ventaja es la
de no precipitar los albuminoides y de no alterarlos.
- Calor:
Ejerce una acción muy diferente según se aplique a objetos secos o húmedos. La fijación
por agua hirviendo o por diversos fijadores en ebullición presta servicios para invertebrados
y búsquedas histoquímicas.
Agentes químicos:
- Ácido acético:
Incoloro, cristalizable por debajo de 17° C. Aumenta el contraste entre núcleo y citoplasma.
Forma parte de la mayoría de las mezclas fijadoras como fijador de la cromatina.
- Ácido ósmico:
Se presenta bajo la forma de cristales amarillentos. Se obtiene comercialmente en pequeños
tubitos de vidrio sellados, contienen cantidades que varían de 0.1 a 1 g.
El manejo de este cuerpo presenta dificultades, es muy volátil y emite sin cesar vapores
extremadamente irritantes.
Es un enérgico oxidante por lo cual es reducido rápidamente por trazas de materia orgánica,
por lo que se debe tener especial precaución para preparar las soluciones. El título habitual
es de 1 a 2 %, puede prepararse en agua destilada o en ácido crómico.
Desde el punto de vista morfológico, fija sin precipitar, impidiendo además la precipitación
por el alcohol durante la deshidratación. El osmio es un buen fijador de sustancias grasas y
de la mielina. Es poco difusible y por consiguiente poco penetrante de manera que las capas
superficiales de las piezas están superfijadas mucho antes que el reactivo haya llegado al
interior.
- Ácido pícrico:
Pequeños cristales amarillentos que se emplean en soluciones acuosas saturadas o en
soluciones alcohólicas. Solubles en frío en agua, mayor solubilidad con temperatura.
Es un reactivo muy penetrante que no se lo emplea solo, sino formando parte de mezclas,
como en el líquido de Bouin. El ácido pícrico es un excelente fijador, sobre todo desde el
punto de vista tintorial. Se fija con intensidad sobre los citoplasmas, facilita todas las
coloraciones.
Contrae pero endurece poco.
- Alcohol metílico:
Reactivo importante en la técnica de frotis desecados.
- Alcohol etílico:
Puede servir como fijador el alcohol absoluto o el de 96 °.
El alcohol 100, puede dar excelentes fijaciones, por ej. para el sistema nervioso o frotis
desecados.
Disuelve los lípidos, precipita el glucógeno sin fijarlo y da con los nucleoprótidos un
precipitado hidrosoluble. Es poco penetrante, fija mal los núcleos y poco los citoplasmas.
- Bicloruro de Mercurio:
Pequeños cristales blancos muy venenosos, solubles en agua, en frío (7%) en ebullición
(54%), muy soluble en alcohol (32%). En solución acuosa precipita enérgicamente los
albuminoides, principalmente los del núcleo. Estas propiedades se exaltan por la adición de
ácido acético, que vuelve más penetrante el fijador. Una vez terminada la fijación es
necesario eliminarlo de los
tejidos para evitar la formación de cristales.
- Bicromatos:
Los bicromatos alcalinos, (Potasio, sodio, Magnesio, Estroncio, Zinc) fijan bien los
citoplasmas pero destruyen los núcleos. Los bicromatos de Bario, Calcio, Cobre, fijan bien
las mitosis pero no los citoplasmas. El más empleado de los bicromatos es el de Potasio,
gruesos cristales de color rojo anaranjado, fácilmente solubles en agua (12.4%).
- Formaldehído:
Este cuerpo es un gas cuya solución acuosa lleva el nombre de formalina o de formol. Toda
vez que hablemos de formol puro tendremos en vista la solución comercial al 40%.
El formol es el fijador más utilizado, a causa de su bajo precio y la facilidad de su empleo.
Es un fijador importante a causa de su poder coagulante y su notable capacidad de
penetración.
El formol comercial es un líquido incoloro, que emite vapores irritantes. A veces los
vapores del formol pueden producir accidentes febriles, bronquitis, queratitis.
Resulta muy desagradable manejar piezas embebidas en formol a causa de las violentas
punzadas que no se tarda en sentir en los ojos, la acción sobre la mucosa olfatoria, es tal vez
menos sensible, pero más durable y la olfación puede terminar por quedar notablemente
disminuida.
Conviene no poner los dedos en contacto con las soluciones que contienen formol porque la
epidermis se fija rápidamente y endurece de manera poco agradable, además de poder
ocasionar dermatitis alérgicas por contacto.
Para manejar piezas que han permanecido en formol sin sufrir los inconvenientes
mencionados,
se las lava con agua y luego se las introduce en agua ligeramente amoniacal, así se suprime
todo olor.
El formol de comercio casi siempre contiene una cantidad más o menos considerable de
ácido fórmico. Esta impureza daña muchas veces la fijación, produce precipitación en los
tejidos, destruye las células mucosas y daña seriamente los citoplasmas por lo que es
necesario emplear siempre formol neutro.
Es conveniente adoptar una convención para formular el título de las diluciones:
El porcentaje mirará siempre la solució n comercial de 40%, para preparar una solución al
5% se mezcla 5 cc. de formol con 95 cc. de agua. La solución comercial presenta a veces
una alteración particular que se manifiesta por un aspecto lechoso y por la formación de
precipitado blando más o menos abundante, el frío interviene mucho en este fenómeno.
3.- Deshidratación:
Concepto:
Los tejidos contienen grand es cantidades de agua, tanto intracelular como extracelular, que
debe ser eliminada y reemplazada por parafina.
Detención de la fijación:
Una vez transcurrido el tiempo de fijación deseado es preciso detenerlo rápidamente.
El fijador que rodea la pieza p uede ser eliminado por lavado en:
a.- agua
b.- alcohol
a.- Es imprescindible hacerlo después de la fijación con ácido crómico, bicromato de
potasio y
ácido ósmico.
Se hace en agua corriente de 2 a 24 h.
b.- Piezas que han estado en alcohol, ácido pícrico o formol, se llevan directamente al
alcohol 70 o
80%, llevándose así a cabo el lavado y el inicio de la deshidratación.
La deshidratación se realiza por medio de un reactivo anhidro pero ávido de agua. Puede
utilizarse la acetona o el alcohol etílico (es el más utilizado).
La deshidratación se hace en forma progresiva con sucesivos baños de alcohol, cada vez
menos hidratados 70° – 80° – 90° – 96° – 100°.
Tiempos de permanencia en cada líquido:
Alcohol 70 las piezas pueden perman ecer varios días.
Alcohol 96 2 baños en un lapso de 24 h.
Alcohol 100 3 baños de una hora c/u.
Como han de introducirse las piezas:
Las piezas se han de envolver en gasa a manera de bolsitas, colocarlas en cartulina, etc.
Pero siempre suspendidas.
Para la deshidratación deberán emplearse frascos anchos y de cierre hermético. Los
recipientes deben ser agitados periódicamente para que la mezcla de alcohol y agua sea lo
más perfecta posible.
En cada etapa la cantidad de deshidratante debe ser superior a 10 veces el volumen del
tejido por deshidratar. Una mala deshidratación es siempre perjudicial por lo que es
necesario controlar el resultado de la misma.
Los disolventes utilizados antes de la parafina son el xileno, benceno, tolueno, butilo, si la
pieza ha sido mal deshidratada los líquidos se tornan opalinos.
4.- Preparación para la Inclusión:
El aclaramiento o desalcoholización permite que el alcohol de los tejidos sea reemplazado
por un líquido (solvente) que disuelva la parafina con la cual el tejido va a ser impregnado.
La parafina es un hidrocarburo sólido, con escasa elasticidad que ha de penetrar a los
tejidos, ocupando hasta sus últimos intersticios. Para lo cual ha de licuarse mediante
temperatura.
Solventes:
Benceno – xileno – tolueno – cloroformo – fenol en alcohol – carbolxilol – etc.
La palabra aclarar proviene de que además de eliminar el alcohol muchas de estas
sustancias tienen la propiedad de trasparentar los tejidos.
Xileno: es un excelente agente aclarante pero tiende a hacer que los tejidos sean
excesivamente duros y quebradizos y esto nunca deben dejarse en este líquido más de 3
horas.
El xileno es inadecuado para el encéfalo y los ganglios linfáticos, pues los hace demasiado
quebradizos, para estos órganos es mejor utilizar cloroformo.
Tolueno: tiene las mismas propiedades generales que el xileno pero resulta mejor porque
endurece mucho menos los tejidos.
Cloroformo: resulta excelente para el tejido nervioso, ganglios linfáticos y emb riones
pues produce poco encogimiento y no endurece mucho los tejidos.
¿Cómo se realiza el aclaramiento? :
Las piezas se trasladan a un frasco que contenga el volumen adecuado del solvente (30
veces).
Si cuando las piezas son colocadas en el solvente se observa que están formando
nubosidades opalinas y que estas no desaparecen de inmediato, quiere decir que la
deshidratación no ha sido completa. Debe volverse al alcohol absoluto.
¿Cuándo esta terminado este paso? La finalización de este paso es tarea de la vista, si las
piezas se han vuelto diáfanas, trasparentes, lo está. Las piezas pueden ser trasladadas a la
parafina.
5.- Inclusión:
La parafina es un hidrocarburo no cíclico. A la temperatura ambiente es sólido. La
temperatura suave la disuelve por completo. Una temperatura mayor de 65° llega a
disolverla, produciéndose vapores de olor desagradable, inflamables y también tóxicos.
Hay parafinas que funden a distintas temperaturas, para la mayoría de los trabajos pueden
utilizarse las que lo hacen a 56-58°. En la estufa debe haber cuatro vasijas con parafina ya
disuelta. En cada vasija ha de haber un volumen suficiente como para cubrir por completo
las piezas que se han de colocar. Es conveniente que cada vasija posea su número de orden
1, 2, 3 y 4.
El recipiente número 1 debe tener parafina ya fundida a la que se mezclará una pequeña
cantidad de solvente, el 2 y 3 deben contener parafina pura, que poco a poco ira
adquiriendo algo de solvente cuando las piezas vayan pasando por ellas.
El 4 debe tener parafina completamente pura.
Tiempo de cada baño:
Depende un poco del tamaño de cada pieza. En cada recipiente pueden estar de 2 a 3 h. Lo
que se ha hecho hasta ahora mediante los baños de parafina se conoce con el nombre de
impregnación.
La inclusión consiste en encerrar cada pieza dentro de un bloque de parafina pura.
Pasos de la inclusión:
Se ha de preparar tantos moldes cuantas piezas han de incluirse.
Se extrae una pieza, se la libera de la envoltura de gasa, se la ubica en el fondo del molde,
orientándola para saber luego por donde ha de ser cortada.
Sobre la pieza puesta en el molde se vierte parafina fundida, pura de la cuarta vasija. Se
deja el molde sobre una superficie plana y fría, se espera que la falta de calor solidifique
toda la parafina, formándose así un bloque. Mientras se trabaja en una pieza las demás
deben estar en la estufa.
Los moldes:
Los hay de varias clases: barras de Leukart, cajas de papel, hormas de metal.
Barras de Leukart:
Consisten en un par de barras de metal, dobladas en ángulo recto a manera de escuadras. A
su vez cada rama de la escuadra tiene un ángulo recto en el extremo. Esta disposición
permite que una barra se aplique contra la otra, como permite deslizamiento es posible
agrandar o achicar el molde conforme las necesidades.
Colorantes para el núcleo: su base es la que se combina con los ácidos nucleicos, por lo
tanto ésta es la coloreada. El ácido es el incoloro.
Colorantes para el citoplasma: el ácido del colorante es el que se combina con el
citoplasma. a base es la incolora.
Colorantes artificiales más comunes: vesubina, tionina, azul de toluidina, azul de metileno,
fucsina básica, violeta de metilo, verde de metilo, anaranjado de acridina.
Se ha dividido a los colorantes según su afinidad que presentan con el núcleo o con el
citoplasma:
· colorantes nucleares o básicos su componente colorante activo es una base coloreada.
· Colorantes citoplasmáticos o ácidos: su componente activo es un ácido coloreado.
· Colorantes neutros.
La mayor p arte de los colorantes que se utilizan son sales.
Los colorantes básicos son sales cuya base es coloreada y su ácido es incoloro, Ej. azul de
metileno—clorhidrato de tetrametiltionina o sea es una sal formada por la combinación de
la tetrametiltionina (base coloreada) de azul de metileno con el ácido clorhídrico.
Reaccionan con los grupos fosfato de los ácidos nucleicos (DNA-RNA), los grupos sulfato
de los glucosaminoglucanos y los grupos carboxilo de las proteínas.
Los colorantes ácidos llevan una base que es incolora combinada con un ácido coloreado,
Ej. eosina—eosinato de potasio (base incolora) combinada con el ácido eosínico
(tetrabromofluoresceína) que es coloreado.
Los colorantes neutros tanto el ácido como la base son coloreados Ej. eosinato de azu l de
metilenoazur de metileno.
Los componentes que se tiñen con colorantes ácidos se dicen que son acidófilos (filamentos
citoplasmáticos, la mayor parte del citoplasma no especializado, y las fibras extracelulares).
Cualquier componente de los tejidos que reaccione con un colorante básico se dice que es
basófilo (heterocromatina, nucleolos, ergastoplasma, matriz del cartílago).
Proceso de coloración:
Tomaremos como base para la descripción de este proceso a la coloración de hematoxilina
y eosina considerada como la “coloración de rutina”.
Coloración de hematoxilina y eosina:
Desparafinar los cortes: realizar dos baños de xileno de 10 a 15 min. c/u.
Eliminamos el solvente por sucesivos baños en: alcohol de 100°, 96°, 70° de 1 a 2 min. c/u.
Hidratación de los cortes: en agua destilada durante 1 a 2 min.
Tinción nuclear: en hematoxilina durante 2 a 12 min. de acuerdo a la formula utilizada.
Viraje de la hematoxilina: en agua corriente hasta desprendimiento total del color (3 a 5
min.).
Lavado en agua destilada o corriente.
Coloración citoplasmática: eosina al 0.5% o en una mezcla de eosina/floxina al 0.5%
durante 15 a 30 seg.
Lavado en agua destilada.
Deshidratar, aclarar y montar.
Los pasos de la deshidratación pueden ser suplidos dejando secar el corte en estufa a 37°
por 15 a 20 min.
Coloraciones especiales:
Las coloraciones especiales comprenden un conjunto de tinciones o impregnaciones
utilizadas para poner de manifiesto o resaltar determinadas estructuras de los tejidos.
Para tejido conectivo:
Fibras colágenas:
Tricrómico de Van Gieson: las fibras colágenas se observan de color rojo.
Tricrómico de Gomori: se observan de color rojo.
Tricrómico de Masson: las fibras colágenas se observan de azul.
Fibras Elásticas:
Método de Gomori: las fibras elásticas se tiñen de púrpura oscuro.
Orceína: se tiñen de púrpura.
Fibras reticulares:
Método de Gomori para la impregnación argentica de la reticulina: las fibras reticulares se
observan negras.
Tejido adiposo:
Sudan black: el tejido adiposo se observa de color negro.
Sudan IV-rojo Escarlata:
- grasas neutras: se observan de color rojo vino.
- lipoides: rojo anaranjado
- fosfolípidos: se tiñen poco o nada.
Carbohidratos y mucopolisacáridos:
Acido Peryódico de Schiff (PAS): los mucopolisacáridos básicos o neutros se observan de
color rojo.
Azul alcian: los mucopolisacáridos ácidos se observan de color azul.
Coloración para el estudio neurohistoquímico:
Coloración de la sustancia de Nissl- método de la tionina fenicada: los grumos de Nissl y
núcleos aparecen teñidos de color azul profundo.
Luxol fast blue-PAS-hematoxilina: la mielina se observa azul brillante
Modificación de la técnica de Glees-método de Marsland, de impregnación argéntica a
cortes de parafina: células nerviosas, neurofibrillas y células de la glia en diversas
tonalidades de negro, fondo de color habano.
BIBLIOGRAFÍA
.
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