Principios del Diagnóstico

Las enfermedades infecciosas pueden ser

diagnosticadas por:
• Presencia de un agente capaz de provocar la
enfermedad, por observación directa en el
material obtenido del paciente o por cultivo de
laboratorio.
• Producto específico del agente infeccioso en el
material clínico obtenido del paciente
• Detección en el suero del paciente de una
respuesta inmunológica específica dirigida contra
el agente infeccioso
 Serología

El diagnóstico de las enfermedades por la

medición de los niveles de marcadores en
suero.
 Generalidades

• Los Acs están dirigidos contra un

determinante antigénico (epitope)
• Los microorganismos pueden contener
numerosos determinantes antigénicos
 Unión antígeno-anticuerpo

Los Ags y Acs interactúan por

complementariedad espacial y no
por uniones covalentes
 Reacción Primaria

• Consiste en la combinación del epitope con el paratope.

• No es observable pero puede demostrarse con diversos
métodos como:

❖Radioinmunoanálisis
❖Enzimoinmunoanálisis
❖Inmunofluorescencia
 Reacción Secundaria
• Se caracteriza por la aparición de un
fenómeno visible:

❖Aglutinación.
❖Precipitación.
 REACCIONES DE AGLUTINACIÓN

La interacción secundaria entre Ag-Ac da lugar a

un aglutinado que se visualiza como grumos. Los
principios fisicoquímicos son los mismos que los
de precipitación. Pero el Ag es particulado.
 VENTAJAS DE LAS REACCIONES DE
AGLUTINACIÓN

➢Son muy sencillas de realizar,

➢No requieren de ningún equipamiento para su
lectura,
➢Son rápidas y fáciles de implementar.
➢Presentan una mayor sensibilidad que las
reacciones de precipitación.
 TIPOS DE REACCIONES DE
AGLUTINACIÓN
• ACTIVA: cuando el determinante antigénico es un
componente natural o un constituyente
intrínseco propio de la partícula Ej. Gr para
determinación de grupo sanguíneo, bacterias
para determinación de Brucelosis
• PASIVA: se basan en el empleo de una partícula
aglutinante (soporte inmunológicamente inerte)
a la cual se la ha unido un Ag Ej. Chagas ( HAI
hemoaglutinación pasiva)
 Aglutinación activa
Activa Directa
• La interacción del Ag-Ac
conduce al fenómeno
visible de la aglutinación sin
mediar un tercer
componente que la
propicie. Ej. Reacción de
Huddleson (Brucelosis)
Activa Indirecta
• El Ag-Ac interaccionan pero
no se produce aglutinación.
Para hacer posible la
aglutinación se utiliza un
tercer componente que es
un 2º Ac dirigido contra el
1º que permite el enganche
de las partículas a través de
el. Ej. Reactivo de Coombs
Aglutinación Activa
 AGLUTINACIÓN PASIVA
• El soporte particulado puede ser un glóbulo
rojo que está sensibilizado con el Ag
Hemoaglutinación
• El soporte particulado pueden ser partículas
inertes como látex o partículas de gelatina
Aglutinación de partículas
Aglutinación pasiva
TÍTULO Y PROZONA
Aglutinación
 TÍTULO

• La inversa de la máxima dilución de suero que

produce aglutinación visible.
• Cuando existe una gran cantidad de Ac, es
posible que a diluciones bajas no se observe
aglutinación. Este fenómeno efecto “prozona”
y se debe a que en exceso de Ac se forman
preferentemente complejos Ag-Ac solubles.
 INTERACCIÓN PRIMARIA AG-AC
Si bien la interacción primaria Ag-Ac no es
visible, existen distintos métodos que hacen
posible visualizarla. La estrategia consiste en
"marcar" al Ac o al Ag con determinadas
moléculas para poder hacer visible esa primera
interacción, tales como
❖FLUOROCROMOS
❖ISOTOPOS RADIOACTIVOS
❖ENZIMAS
 INMUNOMARCACIÓN
• Utilizando Ac conjugados permiten detectar la presencia de
Ags en tejidos (inmunohistoquímica) o células
(inmunocitoquímica).
La imunomarcación de tejidos se realiza sobre cortes de tejido
fijado montado sobre un portaobjetos. A través de estas
técnicas es posible detectar Ags celulares (de membrana,
citoplasmáticos o nucleares) y extracelulares (matriz
extracelular, membrana basal, etc.)
La imunomarcación de células puede efectuarse sobre células
vivas o fijadas, las cuales pueden hallarse en suspensión o
adheridas a un soporte sólido. Esta técnica permite detectar
Ags localizados en la membrana plasmática, citoplasma o
núcleo de la célula.
 INMUNOMARCACIÓN DIRECTA
Consiste en utilizar un Ac "marcado" específico para dicho Ag (Ac
primario). Para realizar esta técnica, se incuba la muestra con el Ac
primario "marcado" durante un determinado tiempo, a la temperatura
indicada, luego del cual se retira el exceso de Ac mediante un lavado y
se procede a la detección de la marca.
 INMUNOMARCACIÓN INDIRECTA

• Utiliza un Ac primario sin marcar que reconoce al Ag de interés y luego,

emplea un segundo Ac marcado (Ac secundario) capaz de reconocer el Ac
primario.
• Se incuba la muestra con el Ac primario, se realiza un lavado para retirar el
exceso de Ac y luego se incuba con el segundo Ac marcado.
 INMUNOFLUORESCENCIA

Los fluorocromos emiten luz de una determinada longitud de

onda luego de ser excitados por un haz de luz de longitud de
onda menor.
Cada fluorocromo es capaz de emitir luz dentro de un
determinado espectro de longitud de onda. Por ejemplo, el
fluorocromo denominado Isotiocianato de Fluoresceina emite en
la gama del verde, mientras que la Ficoeritrina emite en la gama
del rojo.
 INMUNOENSAYOS

• Están disponibles en varios formatos que pueden ser

utilizados para detectar Acs, Ags o una combinación de
ambos.
• Generalmente, los ensayos más simples para detección de
Acs están basados en el uso de Ags inmovilizados los cuales
capturan el Ac presente en la muestra, los ensayos más
simples para detección de Ag se basan en el uso de Acs
inmovilizados para capturar Ags de los patógenos presentes
en la muestra.
• La detección de los complejos inmunes puede ser:
ELISA (generación de color)
CLIA (medición de luz)
Enzimoinmunoensayo
ELISA: ENSAYOS DE DETECCIÓN DE AC
ENZIMOINMUNOENSAYOS
ELISA: ENSAYOS DE DETECCIÓN DE AC
• Ensayo antiglobulina
• Ensayo sándwich
• Ensayo competitivo
• Ensayo de captura
 ENSAYO ANTIGLOBULINA

• Ag unido a fase sólida.

• Incubación con la muestra diluida, el Ac se une al Ag.
• Lavado para eliminar proteínas no unidas.
• Adición de conjugado anti globulina humana unida a la
enzima marcada que se une a los Ac unidos a la fase
sólida.
• Lavado de conjugado no unido
• Sustrato (OPD o TMB)
• Frenado de la reacción con ácido sulfúrico
• Lectura
ENSAYO ANTUGLOBULINA
 ENSAYO SANDWICH

• Ag unido a fase solida.

• Incubación con la muestra, el Ac se une al Ag.
• Lavado para eliminar proteínas no unidas.
• Adición de conjugado: el mismo Ag que el unido a la fase
solida pero en solución y unido a la enzima marcada que se
une a los Ac unidos a la fase sólida: queda formado el
sándwich Ag-Ac-Ag.
• Lavado de conjugado no unido
• Sustrato (OPD o TMB)
• Frenado de la reacción con ácido sulfúrico
• Lectura
ENSAYO SANDWICH
 ENSAYOS COMBINADOS
• Varios fabricantes están produciendo kits para
detectar individuos infectados recientemente:
• Ensayos de 4º generación o combo Ej.HIV
 INMUNOBLOTTING
• Blotting: transferencia de una sustancia desde
un gel, donde se separaron sus diversos
componentes por electroforesis, a un soporte
manejable fácilmente.
 WESTERN BLOT

• Separación electroforética de proteínas

• Transferencia a un soporte sólido (membrana
de nitrocelulosa)
• Detección de una o más bandas identificadas
por Acs específicos conjugados a enzimas.
 Reacción en cadena de la polimerasa
PCR
• Esta técnica se fundamenta en la propiedad
natural de los ADN polimerasas para replicar
hebras de ADN, para lo cual se emplean ciclos
de altas y bajas temperaturas alternadas para
separar las hebras de ADN recién formadas
entre sí tras cada fase de replicación y, a
continuación, dejar que las hebras de ADN
vuelvan a unirse para poder duplicarlas
nuevamente.
PCR
PCR