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PRACTICA Nº 7

TINCIONES SIMPLES, COMPUESTAS Y OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE BACTERIAS.


Felipe banguera 1​​ -211009, Lina Oliveros​1​ -211038, Lina Pascumal​2​- ​510033​, Juan P. Giraldo​2​-510052
1​
Facultad de Ciencias Agropecuarias, 2​​ Facultad de Ingeniería y Administración
Universidad nacional de Colombia- sede Palmira.

RESUMEN
Las ​tinciones tienen como objetivo mejorar la observación de las estructuras tanto generales como especificas y
facilitan el analisis ​morfologíco​, y agrupamientos de los microorganismos. Para esto se utilizan diferentes técnicas de
tinción, las utilizadas en la práctica de laboratorio fueron: ​tinción de gram, tinción de endosporas, tinción de capsulas y tinción de
flagelos. ​Haciendo énfasis en que las tinciones utilizadas son compuestas ya que se utiliza más de un colorante para observar la
estructura especifica de la bacteria.

Palabras claves​:​ ​tinción de gram, tinción de endosporas, tinción de capsulas y tinción de flagelos estructuras.

INTRODUCCIÓN

El tamaño de la mayoría de las células bacterianas resulta difícil de ver con el microscopio óptico. La principal
dificultad es la falta de contraste entre la célula y el medio que la rodea, sin embrago, el medio más simple de
aumentar el contraste es la utilización de colorantes. Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes
de células o para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas,
cápsulas ,etc. Para ello se utilizan las tinciones, que posibilitan la observación de la cantidad, tamaño, morfología y
disposición relativa de los microorganismos.

MATERIALES

Para el desarrollo de la practica se utilizaron los siguientes materiales: portaobjetos, cubreobjetos, Asa
bacteriológica, Mechero de bunsen, Cristal violeta, Alcohol etílico, safranina, aceite de inmersión, papel toalla
(tinción), tinta china, pinzas, verde de malaquita, sulfato de cobre, nitrato de plata, , estufa, AFA (acido acético con
formalina y alcohol), pipeta, papel de filtro,rejilla mecanica,cultivo bacteriano.

METODOLOGÍA

Para las siguientes tinciones realizamos los siguientes pasos.

Tinción de gram:
En un porta objetos limpio, se agrega un poco de agua con una asa bacteriológica estéril tomo una muestra de la
bacteria del cultivo, se emulsiona y se distribuye en el porta objetos se deja secar a temperatura ambiente. Se lleva a
la primera tinción en cristal violeta por 1 minutos se lava el colorante. Luego al yodo de gram (lugol) por 1 minuto se
lava, se le agrega alcohol etílico durante 30 segundos se lava y se introduce a la safranina durante 45 segundos se
lava y se deja secar a temperatura ambiente, luego se flamea para que el frotis quede fijo y observar al microscopio
hasta el objetivo de inmersión (100x).

Tinción de endosporas:
En el portaobjetos se hace un frotis fijo de la bacteria, a continuación sobre el porta objetos se cubre con papel de
filtro,se agregan gotas de verde malaquita humedeciendolo continuamente y flameando por 5 minutos hasta que
desprenda vapores,cumplido el tiempo establecido se retira el papel, se lava la placa y se introduce en el tinte de
safranina durante 2 minutos ,se lava y se deja secar y por ultimo se observa hasta el objetivo de inmersión (100x) .

Tinción de capsulas:
En un extremo de la placa agregamos tinta china ,se toma una muestra de la bacterias y se homogeniza
esparciendola por toda la placa con el cubreobjetos, se deja secar y se cubre con safranina durante 10 segundos, se
lava y se deja secar a temperatura ambiente; por ultimo se observa hasta el objetivo de inmersión (100x).

Tinción de flagelos:
En el tubo con el cultivo bacteriano agrego agua se mezcla y se deja reposar durante 10 minutos, luego en un
extremo de la placa agrego 2 gotas de AFA y luego con una pipeta por capilaridad tomo una muestra de la bacteria,
se agrega al portaobjetos y se homogeniza dejar secar a temperatura ambiente agrego el mordiente por 4 minutos,
lavo y le agrego el colorante Nitrato de Plata se pone sobre la reja de la estufa para ​calentar durante un minuto se
retira de la estufa y dejar reposar 4 minutos, lavo, seco y observar hasta el objetivo de inmersión (100x).

RESULTADOS
En base a las observaciones vistas en el microscopio se obtuvieron las siguientes imagenes.

Tinción de gram:

De acuerdo a lo observado las bacterias (bacilos) son gram positivas ya que presentan una todalidad entre violeta y
morado.

Tinción de endosporas:

Se observaron con forma bacilar donde las endosporas tomaron un color verde y la celula vegetativa color rosado.

Tinción de capsulas:

Se observa las capsulas transparentes y el medio oscuro dando como resultado una tincion negativa.
Tinción de flagelos:

No se observaron flagelos los bacilos se colorearon de rojo.

DISCUSIÓN

Con base en los resultados de la tinción de gram se puede decir que en el cultivo bacteriano escogido se observaron
bacterias gran negativas ya que toman el color que les da el reactivo de contratincion (safranina) entre violeta y
morado, se debe a que el agente decolorante (alcohol etílico) forma grandes poros en la capa externa que no se
cierran a causa de la deshidratación de las proteínas las cuales se decoloran y toman el color del colorante contraste.

En la tinción de endosporas se pudo diferenciar facilmente las endosporas de la celula vegetativa teñidas de color
verde y la célula vegetativa de color rosado ,esto es debido a que al teñir las bacterias con el verde malaquita y
calentarlo este penetra tiñendo las endosporas de color verde, pero al aplicarle el colorante de contraste (safranina)
estas se resisten a la sustitución de dicho colorante quedando el resto de la célula rosada.

En la tinción de capsulas solo el medio es teñido ya que las partículas de la tinta china son grandes para penetrar en
la bacteria, en la cual se observa una zona transparente que podría ser la capsula, no se puede afirmar que todas las
zonas transparentes son capsulas ​(A. Rojas ,2011 curso de microbiología, guías prácticas).

En la tinción de flagelos no los observamos, puede ser que la muestra extraída escaseé de bacilos con flagelos o que
el procedimiento en algún paso se haya realizado mal y no se haya teñido el flagelo cuando se aplica el mordiente y
el colorante no aumentando su tamaño para poder observarlo con el microscopio óptico.

CONCLUSIÓN
Las tinciones tanto simples como compuestas ayudan a la observación más clara de la bacteria y su morfología y así
como también de sus estructuras específicas sabiendo que para cada estructura de interés hay un método de tinción
que se adecua más al propósito, debido al error experimental se puede tener o no el resultado esperado.
Pudimos concluir que las bacterias Gram-positivas y gran negativas tiñen de forma distinta debido a la diferencia en
la estructura de sus paredes celulares, la pared de las Gram positiva es gruesa y tiene varias capas de
peptidodiglano, ácido teicoico, y las Gram negativas tiene una capa más delgada compuesta por peptodiglano y
tiene una membrana exterior compuesta por fosfolípidos, lipopolisacaridos y lipoproteínas.

Las tinciones son necesarias para el reconocimiento de las mismas y su clasificación: morfología, tamaño y reacción
al color, o diferenciación las unas de las otras. Por medio del contraste entre la célula y el medio que lo rodea.

Se observó que la tinción simple, aumenta el contraste de la muestra para ver agrupaciones celulares o la
morfología externa, y la negativa donde se tiñe el medio y el colorante no penetra el medio por que tiene carga
negativa.

BIBLIOGRAFÍA

● Anónimo, 2011, técnicas de tinción​ ​[en línea]. .[consultado nov;2011] disponible en internet;
http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioTinciones.htm

● Tortora, Funke, Case, 2007, Introducción a la microbiología​ [en línea],​ panamericana; argentina.cap 3 pág.
69-73.​ [consultado nov;2011] disponible en internet;
http://books.google.com.co/books?id=Nxb3iETuwpIC&pg=PA69&dq=tinciones&hl=es&ei=BJnVTr20G8nTgAezwvS7AQ&
sa=X&oi=book_result&ct=result&resnum=1&ved=

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