Manual de Prácticas de Bioquímica

PRACTICA N° 2

CARACTERIZACION DE CARBOHIDRATOS
Los carbohidratos son compuestos polifuncionales que contiene grupos carbonilo
(aldehído o cetónico) y grupos hidroxilo alcohólicos. Por esto; poseen propiedades de
aldehídos y cetonas y de alcoholes polihidroxílicos. Los carbohidratos se dividen en
monosacáridos, oligosacáridos y polisacáridos.

Los monosacáridos pueden unirse entre sí mediante un proceso denominado síntesis

por condensación o deshidratación. En dicho proceso se unen dos o más monosacáridos para
formar un disacárido, trisacárido, tetrasacárido, etc. liberándose una molécula de agua. La
fórmula general de los carbohidratos es (CH2O)n. Todos los monosacáridos naturales que
tienen átomos de carbono asimétrico, son ópticamente activos y desvían el plano de la luz
polarizada.

Los oligosacáridos y los polisacáridos son carbohidratos complejos, los cuales al ser
calentados con ácidos diluidos o hidrolizados por enzimas, se desintegran en monosacáridos.
Los polisacáridos poseen una masa molecular muy elevada, son insolubles en agua y la
mayoría de ellos forman soluciones coloidales.

Los carbohidratos están muy difundidos en la naturaleza, sobre todo en el reino vegetal.
Constituyen los productos finales de la fotosíntesis en las plantas verdes. Los animales,
incapaces de tal acumulación de energía solar, aprovechan las sustancias acumuladas por las
plantas. Los carbohidratos participan en la construcción de las estructuras del organismo vivo,
sirve como material para la biosíntesis de otro tipo de compuestos y juega un papel importante
en la bioenergética de la célula. Los carbohidratos entran a formar parte de los ácidos
nucleicos las glicoproteínas, glicolípidos y de algunas vitaminas y coenzimas. Como
integrantes de las glicoproteínas, participan en la formación de la capa externa adyacente a la
membrana, que desempeña un papel importante en la protección de las células contra la
penetración en ellas de microorganismos y virus. Estos carbohidratos están relacionados con
las propiedades inmunoquímicas de los tejidos.

PARTE EXPERIMENTAL

REACCIONES DE RECONOCIMIENTO DE LOS CARBOHIDRATOS

EXPERIMENTO N° 1. FORMACION DE FURFURALES

FUNDAMENTO
Esta reacción es general para los hidratos de carbono y se aplica para detectar su
presencia en los materiales biológicos. Por acción del ácido sulfúrico concentrado se forma
furfural a partir de pentosas 5-hidroximetilfurfural a partir de las hexosas. Cuando estos se
combinan con el α-naftol aparece un color violeta característico, y al combinarse con timol da
una coloración roja.

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MATERIAL
Tubos de ensayo
Pipetas
Gradillas
Timol al 1% en alcohol etílico
α-Naftol al 0.2% en alcohol etílico
Acido sulfúrico concentrado
Soluciones al 1% de almidón, glucosa, maltosa, sacarosa, etc.

METODO DE TRABAJO
En cada uno de los tubos de ensayo colocar 2.0 ml de solución de carbohidrato. Añadir
4 gotas de α-Naftol o Timol. Luego añadir, por las paredes del tubo, 2.0 ml de ácido sulfúrico
concentrado teniendo cuidado que no se mezcle con la capa acuosa. En la interfase aparecerá
una coloración violeta (α-Naftol) o roja (Timol).

Anote sus resultados en la siguiente tabla:

Carbohidrato Glucosa Sacarosa Almidón

¿Anillo de color rojo?

¿A qué se debe la coloración en la interface?.

¿Cuál es la importancia o cómo aplicaría este experimento?

EXPERIMENTO N° 2. REACCIONES DE REDUCCION: PRUEBA DEL HIDROXIDO

CUPRICO.

FUNDAMENTO
Los carbohidratos que en su molécula poseen un grupo carboxilo libre, se llaman
reductores. Estos azúcares, en un medio alcalino tienen la capacidad de oxidarse, reduciendo
a su vez las sales de óxido cúprico (Cu+2) a sales de óxido cuproso (Cu+). Esta es la base para
una serie de métodos de determinación cualitativa y cuantitativa de carbohidratos. En solución
alcalina los monosacáridos y disacáridos reductores reducen el hidróxido cúprico (II) en óxido
cuproso (I).

MATERIAL
Tubos de ensayo
Pipetas
Gradillas
Baño maría
Reactivo alcalino de cobre
Soluciones al 1% de almidón, glucosa, maltosa,sacarosa, etc.

METODO DE TRABAJO
En los tubos de ensayo vierta 2.0 ml de solución de carbohidratos; luego añada 2.0 ml
del reactivo de cobre y agite. Colocar en baño maría hirviente. La aparición de un precipitado
de color rojo (óxido cuproso) indica la presencia de carbohidratos reductores.

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En otro tubo de ensayo colocar 2.0 ml del reactivo alcalino de cobre. No se añade
carbohidrato. Al calentar esta solución, se forma un precipitado negro de óxido cúprico. Por
esta razón en esta reacción se debe evitar el exceso de hidróxido cúprico o sulfato cúprico ya
que la reacción entre el glúcido reductor y el Cu(OH)2 se da cuantitativamente. El exceso del
último durante el calentamiento pierda agua y se transforma en óxido cuproso, lo cual
oscurece la reacción principal y constituye un defecto del método.

Anote sus resultados en la siguiente tabla:

Carbohidrato Glucosa Sacarosa Almidón

Color del precipitado

¿A qué se debe la formación del precipitado de color rojo ladrillo?

¿Cuáles de los carbohidratos utilizados son reductores y porqué?
¿Cuál es la importancia o la aplicación de este experimento?

EXPERIMENTO N° 3. HIDROLISIS ACIDA DEL ALMIDON

FUNDAMENTO
Durante el calentamiento del almidón con HCl diluido, este se descompone en
fragmentos de diferente tamaño llamados dextrinas. Estas se distinguen entre sí por la masa
molecular y por el color que dan en presencia de yodo. A continuación se da un esquema de la
hidrólisis ácida del almidón:

Almidón + I2 Azul
Amilodextrinas + I2 Violeta azul
Eritrodextrinas + I2 Pardo rojiza
Acrodextrinas + I2 Incolora
Maltodextrinas + I2 Incolora
Maltosa + I2 Incolora
Glucosa + I2 Incolora

MATERIAL
Tubos de ensayo
Pipetas
Gradillas
Baño maría
Almidón al 1%
Solución de Lugol (20 gr de ioduro potásico y 10 gr de yodo en 100 ml de agua)
Reactivo alcalino de cobre
HCl concentrado

METODO DE TRABAJO
Vierta 10.0 ml de solución de almidón en un tubo de ensayo.Añada 4 gotas de ácido
clorhídrico concentrado. Tomar 0.5 ml de la muestra y colocarla en 5.0 ml de agua destilada,
agite y añada 1 gota de lugol. Anote el color que aparece. Luego coloque la muestra en baño
maría hirviente. Después de 1 minuto se toma una muestra para la reacción con yodo. Para
esto se extrae 0.5 ml de solución y se vierte en un tubo de ensayo que contiene 5.0 ml de
agua destilada, se agita y se añade 1 gota de lugol. El color azul violeta indica la presencia de
amilodextrinas en la solución. Repita la misma operación cada minuto, hasta que la prueba
con lugol sea negativa.

Para comprobar que lo que ha quedado en el tubo es glucosa, tomar 2.0 ml de muestra

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 Manual de Prácticas de Bioquímica

y añadir 2.0 ml del reactivo de cobre. Colocar en baño maría hirviente hasta observar un
precipitado rojo ladrillo.

En la siguiente tabla anote los cambios de color observados:

Tiempo (minutos) 0 1 2 3
Color observado

¿A qué se deben los cambios de color observados?

¿Cómo se puede aplicar este experimento en la industria alimentaria?

EXPERIMENTO N° 4. HIDROLISIS ENZIMATICA DEL ALMIDON

FUNDAMENTO
Por acción de la amilasa el almidón se hidroliza para dar lugar al disacárido maltosa, que
luego se hidroliza por acción de la maltasa hasta glucosa.

MATERIAL
Tubos de ensayo
Pipetas
Gradillas
Baño maría
Almidón al 1%
Solución de Lugol (20 gr de ioduro potásico y 10 gr de yodo en 100 ml de agua)
Reactivo alcalino de cobre
Solución de saliva diluida (1:5)

METODO DE TRABAJO
Verter en un tubo de ensayo 5.0 ml de la solución de almidón; añadir 1.0 ml de solución
de saliva diluida. Tomar 0.5 ml de la muestra y colocarla en 5.0 ml de agua destilada, agite y
añada 1 gota de lugol. Anote el color que aparece. Luego coloque la muestra en baño maría a
37 °C. Después de 3 segundos se toma una muestra para la reacción con yodo. Para esto se
extrae 0.5 ml de solución y se vierte en un tubo de ensayo que contiene 5.0 ml de agua
destilada, se agita y se añade 1 gota de lugol. Se repita la misma operación cada minuto,
hasta que la prueba de lugol nos dé negativa.

Para comprobar que lo que ha quedado en el tubo es glucosa, tomar 2.0 ml de muestra
y añadir 2.0 ml del reactivo de cobre. Colocar en baño maría hirviente hasta observar un
precipitado rojo ladrillo.

En la siguiente tabla anote los cambios de color observados:

Tiempo (minutos) 0 1 2 3
Color observado

¿A qué se deben los cambios de color observados?

¿Cómo se puede aplicar este experimento en la industria alimentaria?
¿Qué ventaja tiene la utilización de amilasa frente al uso de HCl en la hidrólisis del almidón?

CUESTIONARIO
1. Decir a que compuestos pertenecen las siguientes formulas indicando en cada caso a qué
tipo de monosacárido corresponde. Señalar los carbonos asimétricos y decir cuantos
isómeros ópticos tiene cada uno.

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 Manual de Prácticas de Bioquímica

2. Sacarosa, Maltosa y Lactosa son los nombres comunes de los disacáridos que aparecen en
la figura. Identificar y nombrar cada uno de ellos. Señalar los carbonos anoméricos. Indicar
si tienen carácter reductor o no y por qué.

3. Explique el fundamento de la formación de los furfurales.

4. Describa el fundamento de la reacción de reducción de los carbohidratos

5. Analice la estructura de la molécula del almidón y explique si este puede exhibir poder
reductor frente al ion Cu++.

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 Manual de Prácticas de Bioquímica

PRACTICA N° 3

CARACTERIZACION DE LIPIDOS

Los lípidos son un grupo heterogéneo de compuestos emparentados, con los ácidos
grasos. Son constituyentes importantes de la alimentación no solo por su elevado valor
energético, sino también por las vitaminas liposolubles y los ácidos grasos esenciales
contenidos en la grasa de los alimentos naturales.

SOLUBILIDAD
Es importante tener presente que la solubilidad de los lípidos, en general, dependen de
la relación numérica entre el número de grupos hidrófilos de hidrófobos de los ácidos grasos,
mientras que los grupos hidrófobos están representados por el resto de la cadena
hidrocarbonada. De esto se desprende que, cuanto más larga sea la cadena hidrocarbonada
del ácido graso, la relación entre los grupos mencionados será tanto menor y menos soluble,
en agua, será el ácido graso. La solubilidad en los solventes orgánicos, por el contrario,
depende de la afinidad del solvente por la cadena carbónica no funcional.

INDICE DE ACIDEZ
Se define como el número de mg de KOH necesarios para neutralizar 1 gr. de grasa.
Está en relación con la cantidad de ácidos grasos libres presentes en la grasa. Tiene interés
porque nos indica el estado de conservación y el grado de ranciamiento de una grasa, puesto
que todo tipo de grasa tiene una cantidad característica de ácidos grasos libres, más allá del
cual significa alteración.

INDICE DE SAPONIFICACION
Se define como el número de mg de KOH, que se requiere para saponificar
completamente 1 gr. de grasa. Depende del tamaño de las moléculas de los ácidos grasos
que forman parte de la grasa en estudio. Las relaciones son inversas. Puesto que las grasas
son mezclas de glicéridos, la mayoría de tipo mixto, el índice de saponificación da un promedio
del tamaño molecular de los ácidos grasos presentes en los glicéridos constituyentes de
dichas grasas. Es decir, que su importancia reside en la relación existente entre el índice de
saponificación y la longitud de la cadena de los ácidos grasos del triglicérido.

PARTE EXPERIMENTAL

EXPERIMENTO N° 1. SOLUBILIDAD DE LOS LIPIDOS

FUNDAMENTO
Los grupos principales de los lípidos tienen características de solubilidad diferentes y
esta propiedad se usa en su extracción y purificación a partir de materiales biológicos. La
mayoría de los lípidos son solubles en etanol al 95%, pero forman una emulsión de gotas
pequeñas cuando se les agrega agua. Esto da a la suspención una apariencia lechosa
característica y constituye una prueba muy sencilla para grasas.

MATERIAL
Tubos de ensayo
Pipetas
Alcohol
Acetona
Eter Dietílico
Cloroformo
Aceite de Oliva

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METODO DE TRABAJO
Prepare el siguiente sistema de tubos:

TUBOS 1 2 3 4 5
Agua Destilada (ml) 2.0 - - - -
Alcohol Frío (ml) - 2.0 - - -
Alcohol Caliente (ml) - - 2.0 - -
Eter (ml) - - - 2.0 -
Acetona (ml) - - - - 2.0
Aceite de Oliva (gotas) 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0

Agitar enérgicamente, dejar en reposo. Observar y anotar los resultados obtenidos

en cada uno de los tubos. ¿A qué se debe la solubilidad o insolubilidad del aceite de oliva en
cada uno de los solventes utilizados? ¿En cuál de los solventes es más soluble el aceite?
¿Por qué?

EXPERIMENTO N° 2. PRUEBA PARA GLICEROL

FUNDAMENTO
Cuando se calienta glicerol con bisulfato potásico se produce deshidratación y se forma
el aldehído acroleína, el cual tiene un olor característico. Esta reacción ocurre tanto en el
glicerol libre como con los ésteres de glicerol.

MATERIAL
Tubos de Ensayo
Mechero
Bisulfato Potásico KHSO4
Aceite de Oliva

METODO DE TRABAJO
Coloque una capa de aproximadamente 0.5 cm de KHSO4 en un tubo de ensayo (pirex),
agregue 5 gotas de aceite de oliva, cubra con más KHSO4 y caliente lentamente en un
mechero (evitar que se carbonice). Note el olor picante característico de la acroleína. En otro
tubo, en lugar de aceite, agregue 5 gotas de glicerol y proceda como en el caso anterior.

Escriba la reacción mediante la cual, el glicerol se transforma en acroleína

EXPERIMENTO N° 3. DETERMINACION DEL VALOR DE ACIDEZ DE UNA GRASA

FUNDAMENTO
Las grasas almacenadas pueden sufrir enranciamiento debido a la oxidación de los
dobles enlaces para formar peróxidos y a su hidrólisis por microorganismos con liberación de
ácidos grasos. La cantidad de ácidos grasos libres da, por lo tanto, un índice de la frescura y
calidad de la grasa.

El presente experimento consiste en disolver la muestra con un solvente neutralizado y

en titular la acidez con una solución de KOH de normalidad conocida. Es decir, se titulan los
ácidos grasos libres.

MATERIAL
Matraz
Beaker
Cloroformo

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 Manual de Prácticas de Bioquímica

Alcohol al 95%
Fenolftaleína al 1%
KOH 0.1 N
Aceite de Oliva

METODO DE TRABAJO
Proceder de la siguiente manera:
1. Neutralización de los solventes.- En un matraz se mezclan 25 ml de cloroformo y 50 ml de
alcohol, se agregan 4 gotas de fenolftaleína, seguidamente se titula con KOH, hasta que
aparezca un leve color rosado que persista durante 30 seg.
2. En un beaker previamente tarado, pesar 10 g. de grasa (aceite de oliva u otra grasa),
agregar la mezcla alcohol-cloroformo neutralizado, mezclar bien la grasa con los
disolventes. Se agrega 4 gotas de fenolftaleína y se valora inmediatamente con KOH, hasta
que el color rosado pálido permanezca por más de 30 seg. Anote el número de mililitros
gastados de álcali.

Aceite de oliva
Gasto de KOH (ml)

Donde:
I.A. = Indice de Acidez
n = ml de KOH 0.1 N usados en la titulación.
1 ml de esta solución es igual a 0.0056 g. de KOH.
P = Peso de la muestra problema

Si se desea expresar en términos de % de ácidos grasos libres, referidos a ácido oleico,

con los mismos datos tendremos:

0.0282 = 1 g. de ácido oleico (PM = 282).

Calcule el valor de acidez de la grasa. ¿Qué indica este valor, respecto al estado de
conservación y aptitud para el consumo de la grasa utilizada?

EXPERIMENTO N° 4. INDICE DE SAPONIFICACION DE UNA GRASA

FUNDAMENTO
Este índice nos da la medida de los ácidos grasos producidos durante la hidrólisis
alcalina de una mezcla de grasa natural. Dado que una molécula de triglicérido requiere 3
moléculas de KOH (PM = 56), para saponificarse, independientemente del peso molecular de
los ácidos grasos presentes, este hecho ha sido usado para tener una información del peso
molecular medio de los ácidos grasos presentes en una grasa.

MATERIAL
Matraz
Aceite de Oliva
Mantequilla u otra grasa
Solución de KOH alcohólico 0.5 N

35
 Manual de Prácticas de Bioquímica

HCl 0.5 N

METODO DE TRABAJO
Proceda como se indica a continuación:

Beaker 1 2 3
Aceite de Oliva (g.) 1.0 - -
Mantequilla (g.) - 1.0 -
Sol. KOH en Alcohol 0.5 N (ml) 10.0 10.0 10.0

Colocar los beakers en baño de agua hirviente, durante 30 ó 45 minutos, agitar

continuamente para favorecer un mejor contacto. Transcurrido el tiempo indicado, se deja
enfriar. Seguidamente se agrega 4 gotas de fenolftaleína en cada beaker y se titula con HCl.
Anotar los mililitros gastados en cada una de las titulaciones.

Sol. KOH en
Aceite de oliva Mantequilla
Alcohol
Gasto de HCl (ml)

Calcule el índice de saponificación usando la siguiente fórmula:

Donde:
I.S. = Indice de saponificación
V = ml gastados en el blanco
V' = ml gastados en la muestra

(1 ml de solución de KOH = 0.2805 g. de la misma sustancia = 28.05 mg).

Si se desea saber el peso molecular medio de los ácidos grasos presentes en la

muestra problema usar la siguiente fórmula:

¿Cuál es el IS de la grasa utilizada? ¿Cuál es su utilidad?

CUESTIONARIO
1. Indique las estructuras de las siguientes sustancias:
a) Acido cis-9-Dodecanoico
b) 18: 1c∆11
c) cis,cis-9,12-Octadecanodienoico
d) 20:4c∆5,8,11,14

2. Calcular el índice de saponificación de la palmitodiesterina.

3. Una muestra de 250 mg de aceite puro de oliva, requiere 47.5 mg de KOH para ser
saponificada completamente. Calcular el peso molecular medio de los triglicéridos en el
aceite de oliva.

4. El índice de saponificación de una muestra de grasa de la mantequilla es 230. Calcular el

peso molecular medio de los triglicéridos presentes.

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 Manual de Prácticas de Bioquímica

5. El índice de yodo de una muestra de grasa de la mantequilla es 68. Si el índice de

saponificación de la muestra es 210. Cuántos dobles enlaces, como promedio, hay en una
molécula de triglicérido?.

6. Un triglicérido saturado simple y desconocido tiene un índice de saponificación de 189. Cuál

es su peso molecular?. Cómo se llama?

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PRACTICA N° 4

CARACTERIZACION DE AMINOACIDOS

Los aminoácidos son los sillares de construcción de las proteínas. El número de

aminoácidos comunes se reduce a 20. Todos con excepción de la prolina, tiene un grupo
carboxilo libre y un grupo amino libre no sustituido unido al carbono a. Difieren unos de otros
en la estructura de su cadena lateral que se denomina grupo R. Siendo su estructura general:

Los aminoácidos son importantes en la alimentación humana. En forma de proteínas los

aminoácidos realizan una multitud de funciones estructurales, hormonales y catalíticas
esenciales para la vida. Por lo tanto, no sorprende que defectos genéticos en el metabolismo
de los aminoácidos puedan conducir a transtornos graves como el retraso mental y muerte
temprana. Además de sus actividades como proteínas, los L-aminoácidos y sus derivados
participan en funciones intracelulares tan diversas como transmisión nerviosa, regulación del
desarrollo celular y en la biosíntesis de porfirinas, purinas y pirimidinas así como urea.

DETERMINACION DEL PUNTO ISOELECTRICO EN LOS AMINOACIDOS

Los aminoácidos presentan propiedades eléctricas por lo que son considerados como
anfolitos, puesto que poseen un grupo ácido y un grupo básico. En solución existen como
moléculas cargadas. En su punto isoeléctrico, existen en forma de zwitterion o ion dipolar (sal);
a pH menor que el punto isoeléctrico existen como cationes, que actúan como ácidos; y a un
pH mayor, existe como un anión, que actúa como base. Estas formas no tienen una acción
buffer buena o total y la adición de pequeñas cantidades de H+ ó OH- alteran rápidamente el
pH de la solución. Cuando el aminoácido existe como una mezcla de la sal y la forma ácida o
básica en concentraciones aproximadamente equimolares (en la región de sus valores de pK),
el sistema actúa como un buffer estable.

Como se mencionó anteriormente el punto isoeléctrico es el pH al que el aminoácido no

lleva carga neta; es en esta forma que los aminoácidos no poseen acción buffer. La acción
tamponante es más grande cuando la concentración de la forma de la sal iguala a la
concentración de la forma ácido o de la forma de base.

Considere la reacción:

El pK = pH cuando la [sal] = [ácido]. Esto en el rango de pH ácido para la mayor

capacidad tamponante.

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 Manual de Prácticas de Bioquímica

Similarmente para la reacción:

El pKb = pH cuando la [base] = [sal]. Esto en el rango de pH alcalino para la mayor

capacidad tamponante.

En el punto isoeléctrico la concentración de ácido iguala a la concentración de base:

Por lo tanto:

Si disponemos de una solución que contiene 1 mol de un aminoácido monocarboxílico y

monoaminado a un pH de 0 y le agregamos progresivamente alícuotas de una solución de
NaOH con el objeto de hacer variar el pH de la solución, se podrá obtener una gráfica como la
que muestra la Fig. 1.

12

10

pKb
8
pH

6 Punto
isoeléctrico

4 pKa

ml de ácido 0 ml de álcali

Fig.1. Curva de titulacion de la glicina.

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 Manual de Prácticas de Bioquímica

Se puede notar dos sectores en donde la curva tiende a la horizontalidad, es decir en

donde ocurren las menores variaciones en el pH, no obstante que la cantidad de NaOH
añadida, es la misma que para otros sectores de la curva. Si reparamos en que pH ocurren
estos sectores de casi horizontalidad de la curva, notaremos que están muy próximos a 2.3 y
9.6; lo que quiere decir que en las proximidades del pK de sus grupos ionizables, el
aminoácido tendrá una mayor acción amortiguadora del pH. Esto nos permite anotar que de
los diferentes aminoácidos, la histidina (por su núcleo imidazol) es el más importante en el
control del pH de los líquidos extracelulares, que como se sabe es de aproximadamente 7.4.

En el punto isoeléctrico los aminoácidos son menos solubles en agua y no migran a

ningún electrodo bajo la influencia de una corriente eléctrica.

AISLAMIENTO Y SEPARACION DE AMINOACIDOS

Los aminoácidos pueden ser separados por Cromatografía de intercambio iónico, en
este procedimiento las moléculas de las soluciones son separadas por diferencias en sus
propiedades ácido-base. Para tal fin, se usan columnas con resinas sintéticas, la cual tiene
grupos químicos con una carga determinada. Una de las más usadas corresponde al
poliestireno, con grupos de ácido sulfónico (SO3-) unidos coovalentemente a los anillos
bencénicos. Esta resina, por intermedio de sus grupos sulfónicos puede captar cationes e
intercambiarlos con otros cationes (resina de intercambio catiónico).

En virtud de la propiedad de los aminoácidos de adoptar determinada forma eléctrica

según el pH del medio en que se encuentren, los aminoácidos pueden ser separados
fácilmente por Electroforesis. La técnica consiste en suspender a los aminoácidos en un medio
de pH determinado y colocar la solución sobre un soporte, que puede ser simplemente papel y
someterlo a la acción de un campo eléctrico. Según la intensidad de carga y secundariamente
según su tamaño, los aminoácidos migrarán a uno u otro polo y con mayor o menor velocidad.

Existe otro método muy usado para la separación de aminoácidos y que no está basado
en sus propiedades eléctricas sino en la diferente solubilidad que tienen en una mezcla de
solventes no miscibles.

Cuando un aminoácido se disuelve en una mezcla de solvente no miscible se reparte

entre ellos de acuerdo a su grado de solubilidad, que en la práctica corresponde a su
coeficiente de partición o de reparto. Este principio se aplica en la técnica denominada
Cromatografía de Papel y Cromatografía de Capa Fina.

REACCIONES QUIMICAS DE LOS AMINOACIDOS

Los aminoácidos presentan reacciones de significación biológica que evidencian su
capacidad de interactuar coovalentemente entre sí mediante el grupo a-carboxilo de una
molécula y el a-amino de otra molécula para formar un enlace peptídico.

Los aminoácidos participan además en una gran variedad de reacciones químicas que
incluyen la alquilación, arilación y acilación del grupo amino, la formación de ésteres y
anhídridos que implican al grupo carboxilo y reacciones similares en las que interviene los
grupos reactivos de las cadenas laterales. El conocimiento de estas reacciones es útil en
varios aspectos importantes de la química proteica:
a. Para identificar y analizar los aminoácidos en un hidrolizado proteico.
b. Para identificar la secuencia de los aminoácidos en las proteínas.
c. Para la identificación de los residuos específicos de aminoácidos requeridos para la función
biológica de las proteínas.
d. Para producir cambios en la actividad biológica de la proteína mediante modificaciones
químicas de los residuos de los aminoácidos constituyentes.
e. Para la síntesis química de los polipéptidos.
Dentro de las principales reacciones podemos mencionar:

40
 Manual de Prácticas de Bioquímica

1. REACCION CON ACIDO NITROSO.- El ácido nitroso reacciona con los grupos amino
primarios alifáticos con liberación de nitrógeno para formar alcoholes. Esta reacción puede ser
usada para estimar cuantitativamente los aminoácidos midiendo la cantidad de nitrógeno
liberado.

2. REACCION CON NINHIDRINA.- Usada para la determinación cuantitativa de los

aminoácidos y péptidos. Los aminoácidos reaccionan con la ninhidrina para dar un
característico color azul violáceo llamado azul de Ruheman con una absorción máxima a 540
nm a excepción de la prolina e hidroxiprolina que dan un color amarillo, con una absorción
máxima a 440 nm. La ninhidrina es reducida y el aminoácido es desaminado y descarboxilado.
La determinación cuantitativa puede hacerse también midiendo el CO2 desprendido.

3. REACCION CON EL DINITROFLUOROBENCENO (DNB).- El grupo amino reacciona con

el DNB en condiciones alcalinas para formar un derivado amarillo. Esta reacción es importante
en la determinación del grupo amino terminal en proteínas, lo que permite identificar el
aminoácido iniciador de la cadena polipeptídica. Ya que al realizar la hidrólisis ácida de la
proteína se libera el aminoácido N-terminal arilado; pudiendo ser identificado por
cromatografía en papel o capa fina.

4. REACCION CON CLORURO DE DANSILO.- Un grupo amino libre reacciona con el cloruro
de dansilo para formar un compuesto fluorescente que puede detectarse y medirse en
cantidades pequeñas, mediante métodos fluorimétricos.

41
 Manual de Prácticas de Bioquímica

5. REACCION CON FENILISOTIOCIANATO.- Es la reacción de Edman para determinar el N-

terminal de una cadena polipeptídica. El fenilisotiocianato reacciona con los -aminoácidos
para dar los ácidos feniltiohidantóicos correspondientes. Estos ácidos al ser tratados con
solventes no hidroxilados, como el nitrometano; se ciclan para dar las feniltiohidantoínas; las
cuales son reconocidas por cromatografía de gas-líquido, de papel o de capa fina.

6. REACCION CON CLORURO DE TRIOFLUOROACETILO.- Se utiliza en la cromatografía

de gas-líquido. Los derivados trifluoroacéticos se volatilizan fácilmente sin descomponerse
para separarse por cromatografía gas-líquido mientras que los aminoácidos libres se
descomponen.

Las reacciones antes señaladas son comunes a todos los aminoácidos. Pero los
aminoácidos presentan reacciones que dan color y dependen de su cadena lateral y por lo
tanto, son más específicas en la identificación de aminoácidos. Entre las reacciones químicas
que se usan para la detección o estimación de algunos aminoácidos específicos tenemos:
reacción xantoproteica, reacción de millon, reacción del acetato de plomo, reacción de
sakaguchi, etc. Cuyo fundamento se explica en la parte experimental.

42
 Manual de Prácticas de Bioquímica

PARTE EXPERIMENTAL

EXPERIMENTO N° 1. REACCION CON NINHIDRINA

FUNDAMENTO
Los aminoácidos reaccionan con la ninhidrina dando un color azul violáceo. En esta
reacción la ninhidrina es reducida y el aminoácido es desaminado y descarboxilado.

MATERIAL
Tubos de ensayo
Pipetas
Gradillas
Baño maría
Solución de aminoácidos 0.1 M (glicina, metionina, cisteína, histidina, arginina, tirosina,
triptofano y cistina)
Ovoalbúmina 0.1% (o Clara de Huevo 5%)
Ninhidrina 0.1% en etanol de 95%

METODO DE TRABAJO
Prepare el siguiente sistema de tubos:

Color
Tubo N° 1 2 3 4 5 6 7 8
observado
Glicina 0.1 M 0.5 - - - -- - - -
Metionina 0.1 M - 0.5 - - - - - -
Cisteina 0.1 M - - 0.5 - - - - -
Histidina 0.1 M - - - 0.5 - - - -
Arginina 0.1 M - - - - 0.5 - - -
Tirosina 0.1 M - - - - - 0.5 - -
Ovoalbumina 0.1% - - - - - - 0.5 -
Agua destilada - - - - - - - 0.5
Ninhidrina 0.1% 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5

Mezclar mediante agitación suave y llevar a baño de agua hirviente por 10 minutos.
Retire y enfríe. Observe e interprete los resultados.

EXPERIMENTO N° 2. REACCION XANTOPROTEICA

FUNDAMENTO
Es una prueba positiva para aminoácidos aromáticos (tirosina, fenilalanina y triptófano).
Se basa en la nitración del núcleo de benceno (anillo aromático) dando derivados amarillos,
cuando se calientan con ácido nítrico concentrado; estos derivados se tornan anaranjados por
adición de NaOH (se forman sales).

MATERIAL
Tubos de ensayo
Pipetas
Gradillas
Baño maría
Solución de aminoácidos 0.1 M (glicina, tirosina y triptofano)
Ovoalbúmina 0.1% (o Clara de Huevo 5%)
Acido nítrico concentrado
NaOH 1 N

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 Manual de Prácticas de Bioquímica

METODO DE TRABAJO
Prepare el siguiente sistema de tubos:

Color
Tubo N° 1 2 3 4 5
observado
Glicina 0.1 M 1.0 - - - --
Tirosina 0.1 M - 1.0 - - -
Triptofano 0.1 M - - 1.0 - -
Ovoalbumina 0.1% - - - 1.0 -
Agua destiladA - - - - 1.0
Ac. Nitrico 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

Agite suavemente y lleve a baño maría por 10 minutos. Retire y enfríe. Adicione 1.0 ml de
NaOH. Observe e interprete los resultados.

EXPERIMENTO N° 3. REACCION DE MILLON

FUNDAMENTO
Esta prueba para ser positiva requiere la presencia de un radical hidroxibenceno, y por
lo tanto, es específica para tirosina y sus derivados ya sea que estén libres o en una proteína
o en sus productos de hidrólisis. Esta reacción también se emplea en la cuantificación de
tirosina.

El reactivo de Millon es una solución de nitratos mercuriosos y mercúricos, conteniendo

ácido nítrico. Las proteínas del tipo de las albúminas de huevo, que precipitan por ácidos
minerales fuertes, producen un precipitado blanco que se va volviendo rojo a medida que se
calienta. Otras proteínas como las proteosas y peptonas solo producen una coloración roja en
las mismas condiciones, debido a que las soluciones contienen sales inorgánicas (Cl-) en gran
cantidad, precipitando el reactivo de Millon, este método no se emplea para determinar
proteínas en la orina

MATERIAL
Tubos de ensayo
Pipetas
Gradillas
Baño maría
Solución de aminoácidos 0.1 M (tirosina)
Ovoalbúmina 0.1% (o Clara de Huevo 5%)
Reactivo de Millon

METODO DE TRABAJO
Prepare el siguiente sistema de tubos:

Color
Tubo N° 1 2 3
observado
Tirosina 0.1 M 1.0 - -
Ovoalbumina 0.1% - 1.0 -
Agua destilada - - 1.0
Reactivo de Millon 1.0 1.0 1.0

Mezclar y llevar a baño de agua hirviente por 5 minutos. Retire y enfríe. Observe e
interprete los resultados.

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 Manual de Prácticas de Bioquímica

EXPERIMENTO N° 4. REACCION CON ACETATO DE PLOMO

FUNDAMENTO
Cuando un compuesto orgánico que contiene azufre, es tratado con una solución fuerte
de NaOH, este se hidroliza según:

Este sulfuro inorgánico es altamente ionizable y como resultado de esto se puede

obtener algún test de precipitación para el ion sulfuro. Uno de los más comunes es la
precipitación por el plomo. En efecto, la adición de acetato de plomo causa la formación de
sulfuro de plomo (negro o pardo).

El azufre de la cisteína reacciona fácilmente con el acetato de plomo en cambio el

azufre de la metionina a causa de su gran estabilidad no ennegrese con el plomo. La mayor
parte de las proteínas contienen azufre formando parte de la metionina. Son excepciones las
queratinas, insulina y ciertas seroalbúminas que contienen azufre en forma de cistina o
cisteína. La fibroína de la seda y algunas protaminas no contienen azufre. La ergotioneina
también contiene azufre y puede dar esta reacción.

MATERIAL
Tubos de ensayo
Pipetas
Gradillas
Baño maría
Solución de aminoácidos 0.1 M (cisteína, cistina y metionina)
Ovoalbúmina 0.1% (o Clara de Huevo 5%)
NaOH 40%
Acetato de Plomo 0.5 M

METODO DE TRABAJO
Prepare el siguiente sistema de tubos:

Color
Tubo N° 1 2 3 4 5 6
observado
Metionina 0.1 M 2.0 - - - -- -
Cisteina 0.1 M - 2.0 - - - -
Cistina 0.1 M - - 2.0 - - -
Caseina 0.1% - - - 2.0 - -
Ovoalbumina 0.1% - - - - 2.0 -
Agua destilada - - - - - 2.0
NaOH 40% 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
Acetato de plomo 0.5 M (Gotas) 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0

Mezclar y llevar a baño de agua hirviente por 3 minutos. Retire y enfrie. Observe e
interprete los resultados.

EXPERIMENTO N° 5. REACCION DE SAKAGUCHI

FUNDAMENTO
Los hidrógenos del grupo amino del nucleo guanidino de la arginina reaccionan con el a-
naftol en medio alcalino, desarrollándose un color rojo-anaranjado intenso. La prueba sirve
también para determinar grupos guanidínicos. La arginina es el único aminoácido que da esta
reacción por contener este grupo. Sin embarga, la dan también, la metil guanidina agmatina y
arcaína. Esta reacción puede ser empleada para determinar cuantitativamente la arginina en

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 Manual de Prácticas de Bioquímica

las proteínas. El amoniaco, histidina, tirosina, triptofano, creatina y úrea, interfieren seriamente
en la reacción disminuyendo o impidiendo el desarrollo del color.

El reactivo es α-naftol e hipoclorito o hipobromito de sodio (agente oxidante) en medio

alcalino.

MATERIAL
Tubos de ensayo, Pipetas
Gradillas
Solución de aminoácidos 0.1 M (glicina, arginina)
Ovoalbúmina 0.1% (o Clara de Huevo 5%)
NaOH 10%
α-naftol solución alcohólica 0.5%
Hipobromito de sodio (a 0.66 ml de bromo líquido se le añade 100 ml de NaOH 5%. Esta
solución se mantendrá fría y no más de 1 ó 2 días).

METODO DE TRABAJO
Prepare el siguiente sistema de tubos:

Color
Tubo N° 1 2 3 4
observado
Glicina 0.1 M 1.0 - - -
Arginina 0.1 M - 1.0 - -
Ovoalbumina 0.1% - - 1.0 -
Agua destilada - - - 1.0
NaOH 10% 0.5 0.5 0.5 0.5
α-Naftol 0.5 0.5 0.5 0.5
Hipobromito de sodio 0.5 0.5 0.5 0.5

Después de agregar el α-naftol los tubos deben reposar en el hielo durante 3 minutos.
Luego agregar el hipobromito de sodio. Observe e interprete los resultados.

EXPERIMENTO N° 6. REACCION McCARTHY-SULLIVAN

FUNDAMENTO
Sirven para identificar la presencia de metionina. Para tal efecto se utiliza nitroprusiato
de sodio (Na2NOFe(CN)5) desarrollándose una coloración roja en presencia de dicho
aminoácido.

MATERIAL
Tubos de ensayo
Pipetas
Gradillas
Baño maría
Solución de aminoácidos 0.1 M (glicina, metionina)
Ovoalbúmina 0.1% (o Clara de Huevo 5%)
NaOH 6 N
Nitroprosiato de sodio (20 g/L. Prepárese fresco).
HCl 2 M

METODO DE TRABAJO
Prepare el siguiente sistema de tubos:

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 Manual de Prácticas de Bioquímica

Color
Tubo N° 1 2 3 4
observado
Glicina 0.1 M 1.0 - - -
Metionina 0.1 M - 1.0 - -
Ovoalbumina 0.1% - - 1.0 -
Agua destilada - - - 1.0
NaOH 6 N 1.0 1.0 1.0 1.0
Nitroprusiato de sodio 0.5 0.5 0.5 0.5

Lleve los tubos a baño maría a temperatura no mayor de 40°C durante 10 minutos.
Luego enfríe y por las paredes del tubo deslice 1.0 ml de HCl. Anote e interprete los
resultados. Luego agite los tubos y observe otra vez.

EXPERIMENTO N° 7. REACCION DE HOPKINS-COLE

FUNDAMENTO
Esta prueba es positiva para aminoácidos que poseen un anillo indol como el triptofano.
El grupo indol del triptofano reacciona con el ácido glioxílico (CHO-COOH) del reactivo en
presencia del ácido sulfúrico dando un color púrpura o violeta en la interfase de los dos
líquidos.

MATERIAL
Tubos de ensayo
Pipetas
Gradillas
Baño maría
Solución de aminoácidos 0.1 M (glicina, triptofano)
Ovoalbúmina 0.1% (o Clara de Huevo 5%)
Acido sulfúrico concentrado
Reactivo de Hopkins-Cole

METODO DE TRABAJO
Prepare el siguiente sistema de tubos:

Color
Tubo N° 1 2 3 4
observado
Glicina 0.1 M 1.0 - - -
Triptofano 0.1 M - 1.0 - -
Ovoalbumina 0.1% - - 1.0 -
Agua destilada - - - 1.0
Reactivo Hopkins-Cole 0.2 0.2 0.2 0.2

Después de añadir el reactivo de Hopkins-Cole agite y agregue a cada tubo, deslizando

por las paredes, 1.0 ml de ácido sulfúrico concentrado, luego lleve al baño de agua hirviente
por 3 minutos. Retire y enfríe. Anote e interprete los resultados.

CUESTIONARIO
1. Calcular el punto isoeléctrico de los siguientes aminoácidos: a) glicina, b) ácido glutámico
y c) lisina. Desarrolle las reacciones de disociación

2. Cuáles son las movilidades electroforéticas relativas a pH 5.68 de alanina, arginina ácido
glutámico, serina y triptofano.

3. Una solución que contiene ácido aspártico (pI=2.98), glicina (pI=5.97), leucina (pI=5.98) y

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 Manual de Prácticas de Bioquímica

lisina (pI=9.74) en tampón citrato pH=3 es aplicada a una columna cambiadora de cationes
equilibrada con el mismo tampón. En qué orden eluirán los aminoácidos de la columna?

4. Dibujar la curva de titulación aproximada de la tirosina. Indicar el punto isoeléctrico y los

valores de pKa..

5. Calcular las concentraciones de las especies iónicas de una solución de histidina 0, 25 M

a pH 2. (pK1= 1.82, pK2= 6, pK3= 9.17)

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