Instrumentación Avanzada – Fa.Ci.A.S. – U.N.

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Dra. Graciela Silva; Lic. SebastianGomez

APUNTE TEÓRICO
INTRODUCCIÓN A LOS MÉTODOS ESPECTROMÉTRICOS

Los métodos espectrométricos son un amplio grupo de métodos analíticos que se basan en las
espectroscopias atómica y molecular. La espectroscopia es un término general para la ciencia
que trata de las distintas interacciones de la radiación con la materia. La espectrometría y los
métodos espectrométricos hacen referencia a la medida de la intensidad de la radiación
mediante un detector fotoeléctrico o con otro tipo de dispositivo electrónico. Los métodos
espectrométricos más ampliamente utilizados son los relacionados con la radiación
electromagnética, que es un tipo de energía que toma varias formas, de las cuales las más
fácilmente reconocibles son la luz y el calor radiante y sus manifestaciones más difícilmente
reconocibles incluyen los rayos gamma y los rayos X, así como las radiaciones ultravioleta, de
microondas y de radiofrecuencia.

Muchas de las propiedades de la radiación electromagnética se explican con un modelo clásico

de onda sinusoidal, que utiliza parámetros como la longitud de onda, la frecuencia, la
velocidad y la amplitud (Fig 1). A diferencia de otros fenómenos ondulatorios, como el sonido,
la radiación electromagnética no necesita un medio de apoyo para transmitirse y, por tanto, se
propaga fácilmente a través del vacío. Se define la amplitud A de una onda sinusoidal como la
longitud del vector eléctrico en el máximo de la onda. El tiempo, en segundos, necesario para
el paso de sucesivos máximos o mínimos por un punto fijo en el espacio es el período de la
radiación, T. La frecuencia, v, es el número de oscilaciones del campo por segundo, y es igual a
1/T. La longitud de onda, λ, es la distancia lineal entre dos puntos equivalentes de ondas
sucesivas. La multiplicación de la frecuencia en ciclos por segundo por la longitud de onda en
metros por ciclo da la velocidad de propagación de la onda en metros por segundo.

Figura 1: Arriba: Representación de onda electromagnética, con la onda correspondiente al cambo eléctrico (E) y al campo
magnético (B) en fase. Abajo: representación de dos ondas con distinta longitud de onda y su relación con la energía y la
frecuencia.
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El espectro electromagnético abarca un intervalo enorme de longitudes de onda y de

frecuencias, de hecho, el intervalo es tan grande que se necesita una escala logarítmica. La
región visible del espectro percibido por el ojo humano es muy pequeña si se compara con
otras regiones espectrales (Figura 2). Hay que tener en cuenta también que los métodos
espectroquímicos que utilizan no sólo la radiación visible sino también la radiación ultravioleta
e infrarroja se denominan con frecuencia métodos ópticos, a pesar de que el ojo humano no es
sensible a los dos últimos tipos de radiación

Figura 2: Regiones del espectro electromagnético

Experimentalmente se observa que la velocidad a la que se propaga la radiación a través de

una sustancia transparente es menor que su velocidad en el vacío y depende de los tipos y
concentraciones de átomos, iones o moléculas del medio. De estas observaciones se deduce
que la radiación debe interaccionar de alguna manera con la materia. El índice de refracción de
un medio es una medida de su interacción con la radiación. Así, la transmisión de la radiación a
través de la materia puede representarse como una retención momentánea de la energía
radiante por átomos, iones o moléculas, seguida de una emisión de la radiación en todas las
direcciones cuando las partículas vuelven a su estado inicial (relajación). Cuando la radiación
electromagnética se absorbe o se emite, se produce una transferencia permanente de energía
al medio absorbente o procedente del objeto emisor. Para describir estos fenómenos, hay que
tratar a la radiación electromagnética no como un conjunto de ondas, sino como un flujo de
partículas discretas denominadas fotones o cuantos.

Es la teoría cuántica la que explica estos fenómenos y postula que:

- Los átomos, iones y moléculas sólo pueden existir en ciertos estados discretos, caracterizados
por cantidades definidas de energía. Cuando una especie cambia su estado, absorbe o emite
una cantidad de energía exactamente igual a la diferencia de energía entre los estados.

- Cuando los átomos, iones o moléculas absorben o emiten radiación al realizar la transición de
un estado de energía a otro (E0 estado fundamental o basal, E1 estado excitado), la frecuencia
v o la longitud de onda, λ, de la radiación se relaciona con la diferencia de energía entre los
estados por la ecuación:

Ε1 - Ε0 = h* ν= h*c / λ
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Para átomos o iones en estado elemental, la energía de cualquier estado dado proviene del
movimiento de los electrones alrededor del núcleo cargado positivamente.
Consecuentemente, los distintos estados de energía se denominan estados electrónicos.
Además de los estados electrónicos, las moléculas también tienen cuantizados los estados
vibracionales, que están asociados a la energía de las vibraciones interatómicas, y los estados
rotacionales, que provienen de la rotación de las moléculas alrededor de sus centros de
gravedad. El estado de energía más bajo de un átomo o molécula es su estado fundamental.
Los estados de energía superiores se denominan estados excitados. Generalmente a
temperatura ambiente, las especies químicas se encuentran en su estado fundamental.

La radiación electromagnética se origina cuando las partículas excitadas (átomos, iones o

moléculas) se relajan a niveles de menor energía cediendo su exceso de energía en forma de
fotones. La excitación puede producirse por diversos medios, tales como:

1. el bombardeo con electrones u otras partículas elementales, que generalmente conduce a la

emisión de rayos X;

2. la exposición a chispas de corriente alterna o al calor de una llama, un arco o un horno, la

cual produce radiación ultravioleta, visible o infrarroja;

3. la irradiación con un haz de radiación electromagnética, que produce radiación fluorescente;

4. una reacción química exotérmica, que produce quimioluminiscencia.

La radiación emitida por una fuente excitada se caracteriza por un espectro de emisión, que
generalmente toma la forma de una representación gráfica de la potencia relativa de la
radiación emitida en función de la longitud de onda o de la frecuencia. Hay tres tipos de
espectros que son:

1. Espectros de líneas: los espectros de líneas en las regiones ultravioleta y visible se producen
cuando las especies radiantes son partículas atómicas individuales que están muy separadas
entre sí, en estado gaseoso.

2. Espectros de bandas: los espectros de bandas se encuentran con frecuencia en fuentes

espectrales que presentan radicales o pequeñas moléculas en estado gaseoso.

3. Espectros continuos: la verdadera radiación continua se produce cuando los sólidos se

calientan hasta la incandescencia (cuerpo negro). Los sólidos calentados son importantes
fuentes de radiación infrarroja, visible y ultravioleta cercano para instrumentos analíticos.

Cuando la radiación atraviesa una capa de un sólido, un líquido o un gas, ciertas frecuencias
pueden eliminarse selectivamente por absorción, un proceso en el que la energía
electromagnética se transfiere a los átomos, iones o moléculas que componen la muestra. La
absorción provoca que estas partículas pasen de su estado normal a temperatura ambiente, o
estado fundamental, a uno o más estados excitados de energía superior.

De acuerdo con la teoría cuántica, los átomos, moléculas o iones sólo tienen un número
limitado de niveles de energía discretos; de modo que para que se produzca la absorción de la
radiación, la energía de los fotones excitadores debe coincidir exactamente con la diferencia
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de energía entre el estado fundamental y uno de los estados excitados de las especies
absorbentes.

En la Figura 3, vemos se observa la representación de niveles energéticos posibles en un

átomo, y consideramos niveles energéticos discretos es decir únicos “lugares” posibles en los
que los electrones de la nube electrónica pueden ocupar (recordar teoría de orbitales
atómicos). Consideremos el trayecto que seguiría un único electrón. Cuando un átomo
absorbe radicación, el electrón se excita por la energía proveniente de la radiación y pasa de su
estado energético o nivel energético basal (E0) a uno excitado (que puede ser E1 en la figura).
Este proceso va a mantenerse mientras esté presente la fuente de radiación que induce la
excitación de los electrones. Ahora bien, si se apaga la fuente o interponemos algún objeto
entre fuente y átomo y el electrón deja de percibir esta energía que lo mantenía en estado
excitado, entonces se relaja. Cuando se relaja vemos el fenómeno de emisión de fotones.
Ocurre en este momento un retorno fotónico (es decir con emisión de fotones) y el electrón
pasa de el nivel energético excitado (1 en este caso) al nivel basal, entregando un fotón.

Figura 3: Diagrama energético de transición de electrones de un átomo cuando absorben radiación o la emiten.

La energía de ese fotón va a ser igual a h.υ donde h es la constante de Planck y υ es la

frecuencia. Como vimos antes, la frecuencia es inversamente proporcional a la longitud de
onda (λ). Entonces a mayor longitud de onda, menor será la frecuencia. Y al ser menor la
frecuencia, menor es la energía asociada a ese transición.

Ahora bien, en la Figura 4 si consideramos una molécula, y consideramos niveles energéticos

discretos es decir únicos “lugares” posibles en los que los electrones de la nube electrónica
pueden ocupar (recordar teoría de orbitales moleculares). Consideremos el trayecto que
seguiría un único electrón. Cuando molécula absorbe radicación, el electrón se excita por la
energía proveniente de la radiación y pasa de su estado energético o nivel energético basal (E0)
a uno excitado (que puede ser E1 o E2). Este proceso va a mantenerse mientras esté presente
la fuente de radiación. Ahora bien, consideramos que dentro de cada nivel electrónico de
existen otros niveles energéticos posibles que están dados por la posibilidad de LOS ENLANCES
DE LA MOLECULA de rotar y de vibrar como así de flexionarse, es que dentro del esquema
energético entre niveles E0 y E1 observamos otras líneas que representan niveles vibracionales,
y dentro de ellas niveles rotacionales (no esquematizados para simplificar el análisis).
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Figura 4: Diagramas energéticos de absorción (izquierda) y emisión (derecha) en moléculas. Se denotan los niveles energéticos
basal (E0) y excitados (E1 y E2). Dentro de cada nivel energético observamos niveles vibarcionales basales (0) y excitados (1, 2, 3 y
4).

El análisis energético es similar al del realizado con átomos. Ahora cae la posibilidad de que un
electrón caiga en un nivel excitado, y tiene distintas posibilidades de niveles vibracionales y
rotacionales. La energía de ese fotón va a ser igual a h.υ donde h es la constante de Planck y υ
es la frecuencia. Como vimos anteriormente. La única diferencia es que cuando un electrón se
relaja y salta entre niveles vibracionales y rotacionales, no emite fotones sino que entrega esta
energía en forma de calor (podríamos medirlo con un termómetro de muchisima sensibilidad).
Veremos una transición fotónica cuando pase del nivel ELECTRONICO excitado al basal, y en
este nivel electrónico a su vez puede caer en cualquier nivel vibracional o rotacional disponible
y si se lo permite, seguirá entregando energía en forma de calor mientras tenga niveles de
menor energía desocupados.

En general, el tiempo de vida de un átomo o una molécula excitados por absorción de

radiación es breve, ya que existen diversos procesos de relajación que les permiten regresar al
estado fundamental. La relajación no radiante implica la pérdida de energía a través de una
serie de pequeñas etapas, en las que la energía de excitación se transforma en energía cinética
al colisionar con otras moléculas, produciendose un pequeño aumento de la temperatura del
sistema. La fluorescencia y la fosforescencia son procesos de emisión, de importancia analítica,
en los que las moléculas se excitan mediante la absorción de un haz de radiación
electromagnética; la emisión radiante se produce cuando las especies excitadas regresan al
estado fundamental.
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FUNDAMENTOS DE ESPECTROFOTOMETRÍA
La espectrofotometría es uno de los métodos de análisis más usados, y se basa en la relación
que existe entre la absorción de luz por parte de un compuesto y su concentración. Cuando se
hace incidir radiación monocromática (de una sola longitud de onda) sobre un medio
homogéneo, una parte de la luz incidente es absorbida por el medio y otra transmitida, como
consecuencia de la intensidad del rayo de luz sea atenuada desde Po a P, siendo Po la
intensidad de la luz incidente y P la intensidad del rayo de radiación transmitido. Dependiendo
del compuesto y el tipo de absorción a medir, la muestra puede estar en fase líquida, sólida o
gaseosa. En las regiones visibles y ultravioleta del espectro electromagnético, la muestra es
generalmente disuelta para formar una solución.

Cada sustancia tiene su propio espectro de absorción, el cual es una curva que muestra la
cantidad de energía radiante absorbida, Absorbancia, por la sustancia en cada longitud de
onda del espectro electromagnético, es decir, a una determinada longitud de onda de la
energía radiante, cada sustancia absorbe una cantidad de radiación que es distinta a la que
absorbe otro compuesto (Fig. 5)

Figura 5: Espectro de absorción de dos compuestos A y B, en rojo y azul respectivamente.

El método espectrofotométrico se rige por dos leyes fundamentales: Ley de Lambert y Ley de
Beer.

1.- Ley de Lambert. : Esta ley establece que cuando pasa radiación monocromática por un
medio homogéneo, la disminución de la intensidad del haz de radiación incidente es
proporcional al espesor del medio, lo que equivale a decir que la intensidad de la radiación
transmitida disminuye exponencialmente al aumentar aritméticamente el espesor del medio
absorbente (Fig. 5).
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Figura 6: Ley de Lambert. Po : Intensidad de la luz incidente P : Intensidad de la luz transmitida b : Espesor del medio absorbente k
: Constante, cuyo valor depende de la naturaleza del soluto, de la longitud de onda de la radiación incidente, del espesor del
medio absorbente y de la naturaleza del medio.

2.- Ley de Beer : La intensidad de un haz de radiación monocromática disminuye

exponencialmente al aumentar aritméticamente la concentración de la sustancia absorbente,
cuando este haz pasa a través de un medio homogéneo (Fig. 7).

Figura 7: Ley de Beer. Po : Intensidad de la luz incidente P : Intensidad de la luz transmitida c : Concentración de la solución k :
Constante, cuyo valor depende de la naturaleza del soluto, de la longitud de onda de la radiación incidente, de la concentración de
la solución, y frecuentemente, de la naturaleza del medio.

Ambas leyes se combinan en una sola, generando la Ley de Lambert-Beer

Encontes,

donde :

a : Absortividad
b : Longitud o espesor del medio (longitud de la cubeta)
c : Concentración de la solución
T : Transmitancia
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Los términos absorbancia y transmitancia son definidos a continuación

Transmitancia (T): Es la razón entre la radiación monocromática transmitida (P) por una
muestra y la energía o radiación incidente (Po) sobre ella. Tanto la energía radiante incidente
como la transmitida deben ser medidas a la misma longitud de onda.

Se acostumbra a considerar radiación transmitida como la razón de la radiación transmitida

por la muestra y la radiación transmitida por un estándar arbitrario. Este estándar puede ser el
líquido (solvente) en que esta disuelta la muestra, aire, blanco analítico (solución que contiene
todos los componentes de la solución problema menos la sustancia problema) u otra sustancia
elegida arbitrariamente. Debido a que la transmitancia de este estándar no es necesariamente
100%, es necesario especificar el estándar con el cual la muestra es comparada.

Absorbancia(A): Se define como la cantidad de energía radiante absorbida por una sustancia
pura o en solución. Matemáticamente, corresponde al logaritmo negativo de la transmitancia.
T, transmitancia expresada como fracción decimal %T, transmitancia expresada como
porcentaje.

Entonces,

Resultando,

Esta ecuación indica que la absorbancia es una función lineal de la concentración, donde a es
una constante de proporcionalidad llamada absortividad. La magnitud de a depende de las
unidades de b (recorrido óptico) y c (concentración). Si la concentración c está expresada en
moles por litro y la longitud de la cubeta b en centímetros, la constante a recibe el nombre de
absortividad molar( ξ ) . Luego
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Mediciones de transmitancia y absorbancia.

Las mediciones de absorbancia o transmitancia se hacen por comparación entre la muestra

problema y un estándar arbitrario o referencia. Como la referencia debe poseer un porcentaje
de transmitancia de 100%, esta es llamada referencia de 100%., o una absorbancia de cero.

Selección de longitud de onda de trabajo.

La longitud de onda de trabajo corresponde, generalmente, a la longitud de onda en la cual la

absorbancia del analito (sustancia a analizar) es máxima, y recibe la denominación de Lambda
máximo (λmax). Para seleccionar el λmax., se hace un espectro de absorción o curva espectral,
y que consiste en una gráfica de la absorbancia de una solución de la sustancia absorbente de
concentración adecuada, medida a distintas longitudes de onda y en ella se determina el λmax.
(Fig.8).

Figura 8: Espectro de absorción o curva espectral.

Las mediciones de absorbancia se hacen en la zona de longitudes de onda donde se espera que
absorba la sustancia problema. Si se trata de sustancias coloreadas, las mediciones se realizan
en la zona visible del espectro electromagnético (380 a 800nm). En el caso de sustancias no
coloreadas, las mediciones se realizan en la región ultravioleta del espectro electromagnético
(200 a 380nm).

Curva de Calibración.

Uno de los métodos más utilizados para determinar la concentración de una muestra
problema, es el método de la curva de calibración. Esta curva de calibración es una gráfica que
relaciona la concentración de al menos cinco soluciones de estándar de concentraciones
conocidas, con la absorbancia de cada uno de ellos a la longitud de onda máxima (λ max) (Fig.
9).
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Figura 9: Curva de calibración

Una vez obtenida la gráfica se determina la función matemática que presenta dicha recta a
través del tratamiento estadístico de regresión de los mínimos cuadrados, la cual relaciona la
absorbancia y la concentración de un analito. La siguiente ecuación matemática corresponde a
dicha función:

Donde:

A : Absorbancia.

n : Intercepto de la recta (ordenada al origen)

m : Pendiente de la recta y que corresponde al producto entre absortividad molar de la

muestra y el espesor b de la cubeta.

c: concentración

Luego se mide la absorbancia de la solución problema y se interpola su valor en la gráfica o se

reemplaza en la ecuación (1), para obtener el valor de concentración del analito. La
concentración de la solución problema debe estar comprendida en el rango de concentración
que comprende la curva de calibración (Fig. 10). Si la concentración de la solución problema es
menor que la concentración del estándar más diluido, debe usarse el método de adición
estándar, que consiste en adicionar un volumen determinado de un estándar concentrado a la
solución problema, antes de realizar la lectura y que permite que esta lectura este dentro de
las obtenidas para la curva de calibración. Otra opción es concentrar el extracto obtenido de la
muestra original para que su concentración sea mayor. En el caso contrario, si la concentración
del analito es mayor que la concentración del estándar más concentrado, es decir esta por
valores más altos del rango de linealidad, la solución problema deberá ser diluida.
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Figura 10: interpolación gráfica

Al hacer la curva de calibración, se debe emplear la longitud de onda de máxima absorbancia

(λmax.), para obtener una recta con la máxima pendiente y así tener mayor sensibilidad y
precisión al hacer las mediciones. La medición de la absorbancia de la solución problema debe
hacerse a la misma longitud de onda que fue hecha la curva de calibración.