SECCION IV CONSTRUCCIÓN DE ADN HÍBRIDO

MOLÉCULAS
Dada la gran cantidad de endonucleasas de restricción y otras enzimas para manipular el ADN, es posible crear
cualquier molécula de ADN de interés. Como es imposible cubrir todas las formas posibles de manipular las
moléculas de ADN, esta sección discutirá los principios generales involucrados junto con varias técnicas específicas
que se usan con frecuencia. El Capítulo 8 describe métodos para crear mutaciones puntuales en el ADN.

UNIDAD 3.16 Subclonación de fragmentos de ADN

PROTOCOLO Para construir nuevas moléculas de ADN, los ADN iniciales se tratan con endonucleasas de restricción apropiadas y
BÁSICO otras enzimas si es necesario. Los componentes individuales de la molécula de ADN deseada se purifican mediante
electroforesis en gel de agarosa o poliacrilamida, se combinan y se tratan con ADN ligasa. Los productos de la
mezcla de ligadura (junto con las mezclas de control) se introducen en E. coli células y transformantes se identifican
mediante una selección genética apropiada. El ADN se prepara a partir de las colonias o placas y se somete a
mapeo de endonucleasas de restricción para determinar si se creó la molécula de ADN deseada. Todos los
experimentos de clonación siguen los pasos descritos a continuación.

Materiales

Fosfatasa del intestino de ternera (CIP) y tampón (opcional; UNIDAD 3.10)

mezcla de dNTP (0,5 mM cada uno; UNIDAD 3.4)
Fragmento de Klenow de E. coli ADN polimerasa I o ADN polimerasa T4 (opcional;
UNIDAD 3.5)

Enlazadores de oligonucleótidos (opcional) 10 mM

ATP
0,2 mM ditiotreitol (DTT)
ADN ligasa de T4 (medida en unidades de extremo cohesivo; UNIDAD 3.14)
2 × Tampón de ADN ligasa T4

Reactivos y equipos adicionales para las digestiones de endonucleasas de restricción.

( UNIDAD 3.1), transformación de E. coli células ( UNIDAD 1.8), Minipreps de ADN ( UNIDAD 1.6), y electroforesis en gel
de agarosa o poliacrilamida ( UNIDAD 2.5 o 2.7)

1. En un 20- µ l mezcla de reacción, escindir los componentes de ADN individuales con el apropiado
restricción endonucleasa. Después de que se complete la reacción, inactive las enzimas calentando 15 minutos a 75 °
C. Si no se necesitan más tratamientos enzimáticos, continúe con el paso 6.

Las mezclas de reacción se pueden hacer en cualquier volumen; 20 Es conveniente para la electroforesis en gel (paso 6). Muchas de
las manipulaciones enzimáticas posteriores (pasos 2 a 5) se pueden llevar a cabo secuencialmente sin más cambios de tampón.

2. Si los 5 ′ los fosfatos de uno de los ADN se eliminarán (ver Ejemplo 3.16.1), agregue
2 µ l de 10 × Tampón CIP y 1 U CIP; incubar 30 a 60 min a 37 ° C como se describe en
UNIDAD 3.10. Después de que se complete la reacción, inactive CIP calentando 15 minutos a 75 ° C. Si no se necesitan más
tratamientos enzimáticos, continúe con el paso 6.

3. Si uno o ambos extremos generados por una endonucleasa de restricción deben convertirse en extremos romos
(consulte el Ejemplo 3.16.4), agregue 1 µ l de una solución que contiene los 4 dNTP (0,5 mM cada uno) y una
cantidad apropiada del fragmento Klenow de E. coli ADN polimerasa I o T4 ADN polimerasa; llevar a cabo la
reacción de relleno o recorte como se describe en UNIDAD 3.5. Después de que se complete la reacción, inactive las
Subclonación de
fragmentos de ADN enzimas

3.16.1 Contribuido por Kevin Struhl

Protocolos actuales en biología molecular ( 1987) 3.16.1-3.16.2 Copyright ©

Suplemento 13 2000 por John Wiley & Sons, Inc.

 calentar 15 min a 75 ° C. Si se van a agregar conectores oligonucleotídicos (ver Ejemplo
3.16.6), continúe con el paso 4. Si se desea un fragmento de ADN que contenga solo un extremo romo, corte los
productos de reacción con una endonucleasa de restricción apropiada. Si no se necesitan más tratamientos
enzimáticos, continúe con el paso 6.

4. Agregar 0.1 a 1.0 µ g de un enlazador oligonucleotídico apropiado, 1 µ l de 10 mM ATP, 1 µ l

de 0.2 M DTT, y 20 a 100 unidades de extremo cohesivo de ADN ligasa T4; incubar durante la noche a las 15 ° C.
Inactivar la ligasa calentando 15 min a 75 ° C.

En general, los enlaces oligonucleotídicos se fosforilan antes de la ligadura (UNIDAD 3.10). Sin embargo, los
enlazadores no tienen que estar fosforilados, en cuyo caso los productos contendrán solo un enlazador en cada
extremo.

5. Separe los productos del paso 4 con la endonucleasa de restricción reconociendo el conector oligonucleotídico,
ajustando las condiciones del tampón si es necesario. Si solo uno de los dos extremos debe contener un conector,
escinda los productos con una enzima de restricción adicional (véanse los Ejemplos 3.16.2 y 3.16.6).

6. Aísle los segmentos de ADN deseados por electroforesis en gel o por otros métodos, si corresponde.

La electroforesis en geles de agarosa es el método más común. La purificación no es esencial para muchos experimentos
de clonación, pero generalmente es muy útil. Ver parámetros críticos.

7. Usando luz UV de onda larga para la visualización del ADN, corte las bandas deseadas y purifique el ADN del
material del gel utilizando los procedimientos descritos en UNIDAD 2.6.

Es fundamental utilizar fuentes de luz ultravioleta de onda larga para evitar daños en el ADN. Si se usa agarosa a baja temperatura de
gelificación / fusión, las reacciones de ligadura generalmente se pueden realizar directamente en la rodaja de gel (ver protocolo
alternativo).

8. Configure la siguiente reacción de ligadura: 9 µ l ADN de

componentes (0.1 a 5 µ g) 10 µ l 2 × tampón de

ligasa 1 µ l ATP 10 mM

20 a 500 U (extremo cohesivo) ADN ligasa T4 Incubar de 1 a

24 horas a las 15 ° C.

Ligaduras simples con dos fragmentos que tienen 4 pb 3 ′ o 5 ′ los extremos sobresalientes requieren mucha menos ligasa que las
ligaduras más complejas o las ligaduras de extremo romo. La calidad del ADN también afectará la cantidad de ligasa necesaria.

Los experimentos de clonación controlada generalmente implican varias reacciones de ligadura diferentes. Para simplificar, se deben
agregar ADN apropiados a cada tubo (agregando agua si es necesario) para que el volumen sea 9 l. Inmediatamente antes de su
uso, premezcle en hielo los ingredientes restantes (2 × tampón, ATP, enzima) en cantidades suficientes para todas las reacciones.
Para comenzar las reacciones de ligadura, agregue 11- Alícuotas de la premezcla a cada tubo que contiene ADN. Las cantidades y
proporciones de los ADN componentes y los controles para estas reacciones de ligadura se analizan a continuación.

9. Introducir 1 a 10 µ l de los productos ligados en competente E. coli celdas y seleccione para

transformantes en virtud del marcador genético presente en el vector.

10. De individuo E. coli transformantes, purifican ADN de plásmidos o fagos por miniprep
procedimientos y determinar sus estructuras mediante mapeo de restricción.

Si la frecuencia de los transformantes que contienen la molécula de ADN híbrido deseada es demasiado baja, el cribado inicial
Manipulación
mediante hibridación por filtro a colonias inmovilizadas (UNIDAD 6.2) o placas (UNIDAD enzimática de ADN y
6.1) o por técnicas genéticas es necesario. ARN

3.16.2

Protocolos actuales en biología molecular Suplemento 9

 PROTOCOLO LIGACIÓN DE FRAGMENTOS DE ADN EN REBANADAS DE GEL
ALTERNO
Este protocolo alternativo ahorra un tiempo considerable en comparación con el protocolo básico porque elimina la
purificación de los fragmentos de ADN lejos de la matriz de gel (Struhl,
1985). Es adecuado para la mayoría de los experimentos de clonación simple y es particularmente valioso para llevar a cabo un
conjunto de construcciones híbridas que involucran una variedad de diferentes fragmentos de ADN. Sin embargo, dado que la
eficiencia de clonación puede reducirse, este método debe emplearse solo cuando se desea hacer una (o relativamente pocas)
moléculas específicas.

Materiales adicionales

Tampón TAE de baja temperatura de gelificación / fusión (SeaPlaque, FMC Marine Colloids) TAE ( APÉNDICE
2)

1. Trate los ADN iniciales con endonucleasas de restricción apropiadas y otras enzimas, como se describe en
los pasos 1 a 6 del protocolo básico.

2. Someter los ADN tratados a electroforesis en agarosa de baja temperatura de gelificación / fusión usando tampón
TAE.

Es crítico que la agarosa sea de alta calidad. SeaPlaque es una buena opción. La concentración de agarosa debe mantenerse lo
más baja posible (el 0,7% es adecuado para la mayoría de las aplicaciones).

3. Recorte las bandas deseadas en el menor volumen posible (20 a 50 µ l) usando una cuchilla de afeitar limpia y coloque la
rodaja de gel en un tubo de microcentrífuga.

4. Derretir las rodajas de gel que contienen ADN a 70 ° C durante al menos 10 min.

Esta temperatura es lo suficientemente alta como para derretir la agarosa sin desnaturalizar el ADN.

5. En tubos separados para cada reacción de ligadura, combine las rodajas de gel que contienen ADN apropiados (y
agua si es necesario) para un volumen total de 9 µ l. Coloque los tubos a 37 ° C por unos minutos.

Las rodajas de gel deben permanecer fundidas a 37ºC. ° C.

6. A cada tubo que contenga ADN, agregue 11 µ l de una mezcla helada que contiene 2 × buffer,
ATP y ADN ligasa T4. Mezclar de inmediato tocando el tubo y colocar en hielo. Luego incubar las mezclas
de reacción de 1 a 48 horas a 15 ° C.

Los fragmentos de ADN aún se pueden ligar aunque la mezcla de reacción se haya resolidificado en un gel.

7. Una vez completada la reacción de ligadura, vuelva a cerrar las rodajas de gel de 5 a 10 minutos a 73 ° C y
agregar 5 µ l de los productos ligados a 200 µ l de competente E. coli células ( UNIDAD 1.8).

El gel refundido debe diluirse al menos 30 veces para que no se resuelva cuando las células se colocan en hielo.

8. Lleve a cabo los pasos 9 y 10 del protocolo básico.

La ligadura en rodajas de gel es adecuada para la mayoría de las aplicaciones de clonación. Si el método no funciona, los fragmentos de

ADN se pueden purificar del gel mediante diversas técnicas analizadas en la UNIDAD 2.6. Las ligaduras se llevan a cabo mediante el

protocolo básico.

REACTIVOS Y SOLUCIONES

2 × Tampón de ADN ligasa T4

100 mM Tris ⋅ Cl, pH 7.5 MgCl

20 mM 2
Subclonación de TDT 20 mM
fragmentos de ADN

3.16.3

Suplemento 9 Protocolos actuales en biología molecular

COMENTARIO Información de
antecedentes
La esencia de la tecnología de ADN recombinante es la
unión de dos o más segmentos separados de ADN para
generar una sola molécula de ADN que sea capaz de replicarse
de manera autónoma en un huésped dado. Las construcciones
más simples de moléculas de ADN híbridas implican la
clonación de secuencias de inserción en vectores de clonación
de plásmidos o bacteriófagos. Las secuencias de inserción
pueden derivar esencialmente de cualquier organismo, y
pueden aislarse directamente del genoma ( UNIDADES 5.3 y 5.4) de
ARNm ( UNIDAD
5.5) o de segmentos de ADN clonados previamente (en cuyo caso, el
procedimiento se denomina subclonación). Alternativamente, los
ADN de inserción se pueden crear directamente por síntesis de
ADN.
Parámetros críticos
Se deben considerar muchos factores diferentes antes
de embarcarse en cualquier manipulación específica de
ADN. Estos incluyen el número, tipo y concentración de
fragmentos de ADN, la preparación y purificación de
fragmentos de ADN y los sistemas de selección o selección
que podrían ser necesarios para identificar la molécula de
ADN de interés. Otra consideración práctica es el número de
moléculas de ADN híbrido que se desean para cualquier
experimento en particular. Por ejemplo, al generar bibliotecas
genómicas o de ADNc, es fundamental obtener el número
máximo de recombinantes. Las estrategias para producir
grandes bibliotecas se analizan en otra parte ( UNIDADES 5.1 y 5.2)
Por otro lado, cuando se desea hacer una (o relativamente
pocas) moléculas de ADN específicas, es importante maximizar
la frecuencia de generación de la molécula "correcta" en lugar
de la eficiencia de clonación absoluta. En otras palabras, es
mejor obtener un bajo número de colonias, que contienen
principalmente el ADN deseado en lugar de una gran cantidad
de colonias, algunas de las cuales contienen el ADN deseado.
De esta manera, la detección de las colonias o placas correctas
es innecesaria, y la preparación y análisis de ADN a partir de E.
coli
los transformantes se minimizan; Estos representan los principales pasos
que requieren mucho tiempo en el proceso general de clonación.
Aunque es obvio que las condiciones experimentales
deben diseñarse para favorecer los eventos de ligadura
deseados, el factor crucial para optimizar la frecuencia de las
moléculas correctas es reducir el "fondo" de los eventos no
deseados que darán como resultado moléculas de ADN
transformables. Una causa importante de antecedentes implica
Protocolos actuales en biología molecular
"Errores" en la preparación de los componentes de ADN de partida
(p. Ej., Digestión incompleta por endonucleasas de restricción).
Tales errores pueden reducirse significativamente, pero nunca
eliminarse por completo. La otra fuente principal de antecedentes
es la ligadura no deseada entre moléculas en la mezcla de
reacción. Este problema se aborda considerando todas las formas
posibles en que los componentes de partida (y los contaminantes
probables) pueden unirse para producir moléculas de ADN que
puedan transformarse E. coli a través de la selección genética que
se impone. Mediante "trucos" apropiados, las principales
"reacciones secundarias" a menudo se pueden minimizar; estos se
discuten a continuación.
Preparación de ADN y purificación de fragmentos
específicos. La eficiencia de obtener la molécula de ADN
recombinante deseada mejora enormemente purificando los
componentes individuales por electroforesis en geles de
agarosa. El esfuerzo adicional involucrado está más que
compensado por la eliminación (en la mayoría de los casos) de
la necesidad de seleccionar los recombinantes y la preparación
y análisis resultante de menos ADN. Igualmente importante, la
purificación en gel hace posible el uso de ADN miniprep crudo ( UNIDAD
1.6)
como material de partida inicial en lugar de ADN purificado con
CsCl, lo que elimina el tiempo, los gastos y el tedio.
Los fragmentos de ADN purificados están relativamente libres
de contaminantes menores que pueden causar problemas de fondo
importantes. Por ejemplo, si un vector plasmídico circular se
escinde con una eficacia del 99% con una sola enzima de
restricción, el 1% de las moléculas sin escindir son completamente
infecciosas, aunque no se puedan visualizar mediante tinción con
bromuro de etidio. Este fondo, que es inaceptablemente alto para
muchos experimentos, puede reducirse en gran medida mediante
la purificación en gel del ADN linealizado. La purificación en gel es
extremadamente útil en situaciones donde solo se necesita uno de
varios fragmentos o donde los fragmentos se generan por digestión
parcial. También es útil para la eliminación de pequeños
conectores oligonucleotídicos u otros contaminantes de bajo peso
molecular.
Los fragmentos de ADN separados electroforéticamente
deben aislarse en el menor volumen posible de rodaja de gel. La
pureza es más importante que el rendimiento. Los fragmentos de
ADN se pueden purificar lejos de la agarosa (o acrilamida)
mediante cualquiera de los procedimientos descritos en UNIDAD 2.6. Es
importante usar agarosa de alta calidad como SeaKem o
SeaPlaque, ya que otras preparaciones pueden contener
inhibidores de la ADN ligasa que son difíciles de eliminar. ADN
purificado de acrilamida
Manipulación
enzimática de ADN y
ARN
3.16.4
 Los geles generalmente no contienen tales inhibidores. Finalmente,
para la mayoría de las aplicaciones, las reacciones de ligadura se
pueden realizar directamente en rodajas de agarosa de baja
temperatura de gelificación / fusión (Struhl, 1985; ver protocolo
alternativo en la página 3.16.3). Al eliminar la necesidad de purificar
el ADN de la agarosa, se ahorra tiempo y esfuerzo considerables.
Ligadura intramolecular versus intermolecular de
fragmentos de ADN. Las concentraciones absolutas y
relativas de los fragmentos de ADN de entrada influyen en las
frecuencias de eventos de ligadura específicos. La primera
consideración es si el extremo de una molécula de ADN
particular se unirá al otro extremo de la misma molécula
(ligadura intramolecular) o a una molécula de ADN separada
(ligadura intermolecular). La segunda consideración es si los
eventos intermoleculares serán entre moléculas del mismo
tipo (vector-vector o inserto-inserto) o entre moléculas de un
tipo diferente (vector-inserto). La mayoría de las
construcciones híbridas implican uno o más eventos
intermoleculares seguidos de un evento intramolecular final
para generar una molécula de plásmido circular.
Eventos intramoleculares. Los eventos intramoleculares
son una fuente importante de antecedentes en muchos
experimentos de clonación, principalmente porque la
autoligadura de las moléculas del vector produce indeseados E.
coli transformantes Sin embargo, dado que la ligadura
intramolecular puede ocurrir solo si los extremos de la
molécula son cohesivos o romos, puede eliminarse casi por
completo usando moléculas con extremos heterólogos. Esto
se logra escindiendo el vector con dos endonucleasas de
restricción que producen extremos incompatibles. Para
situaciones en las que el vector debe escindirse con una
única endonucleasa, la unión intramolecular puede evitarse
eliminando ambos ′ fosfatos de cada molécula con fosfatasa
intestinal de ternera. Estas moléculas de vector
desfosforiladas se pueden ligar a ADN de insertos
fosforilados, aunque en cada extremo solo 1 de las 2 cadenas
se unirán covalentemente in vitro. Escherichia coli puede
reparar las mellas monocatenarias in vivo para generar las
moléculas de ADN deseadas.
La ligadura intramolecular de fragmentos de inserto
generalmente no afecta el fondo de colonias no deseadas.
Sin embargo, influye fuertemente en la frecuencia de
obtención de las colonias correctas porque el ADN inserto
autoligado no puede unirse al vector. Por lo tanto, en
situaciones donde los fragmentos de ADN de inserción
pueden ciclar, concentraciones relativamente altas de ADN
(20 a 100 µ g / ml) debe usarse para favorecer
Subclonación de
fragmentos de ADN
3.16.5
eventos de ligadura intermolecular. Esto es particularmente
cierto para fragmentos cortos de ADN que tienen muchas más
probabilidades de ciclarse que fragmentos grandes (para una
discusión teórica, ver Dugaiczyk et al., 1975).
Eventos intermoleculares. Casi todos los experimentos de
clonación que usan vectores plasmídicos requieren la unión de dos o
más moléculas de ADN separadas seguidas de la circularización del
producto. Obviamente, los eventos de ligadura intermolecular se
vuelven cada vez más favorecidos sobre la autounión a medida que
aumenta la concentración total de los extremos relevantes. Por lo
tanto, la eficiencia óptima de clonación ocurre a concentraciones de
ADN que son lo suficientemente altas como para permitir una unión
intermolecular suficiente, pero no tan altas como para reducir la
ligadura intramolecular. Para situaciones en las que el fondo es bajo,
las concentraciones de ADN entre 1 y 50
µ g / ml son aceptables.
Si excluimos los eventos de autoligado, la frecuencia de unir
diferentes segmentos de ADN está directamente relacionada con
la molaridad de cada componente en términos de extremos
específicos a unir. Por ejemplo, si hay cantidades equimolares de
vector (V) e inserto (I), el 50% de los productos bimoleculares
serán V – I, el 25% será V – V y el 25% será I – I. Sin embargo,
porque en la mayoría de los casos solo las moléculas que
contienen secuencias de vectores generarán E. coli transformantes,
es preferible utilizar concentraciones molares más altas de
fragmentos de inserto porque esto favorecerá los productos V – I
deseados sobre el fondo V – V. Esta consideración se vuelve
menos importante si los eventos V – V están excluidos por el
tratamiento con fosfatasa o si los eventos V – V no pueden
generar moléculas viables.
Cantidad de ADN. En general, no es necesario usar mucho
ADN. Para construcciones híbridas simples, aproximadamente del
1 al 10% de las moléculas de ADN del vector se convierten en el
ADN recombinante de interés. Con eficiencias de transformación
normales, 10 6 6 colonias por microgramo de ADN puro del vector,
los productos ligados que contienen tan poco como 1 ng de ADN
del vector tratado deberían generar de 10 a 100 transformantes.
Esto es más que suficiente si el fondo no es un problema. En
términos prácticos, si los fragmentos de ADN de partida se
visualizan fácilmente mediante tinción con bromuro de etidio
convencional, hay suficiente para la mayoría de los experimentos.
Esto es cierto incluso cuando se realiza la ligadura en rodajas de
gel (ver protocolo alternativo) donde solo se usa una fracción del
ADN electroforéticamente separado.
Construcciones más difíciles como las que involucran
extremos romos, tres fragmentos o Bal
31 nucleasa generalmente requieren más ADN. Cómo-
Protocolos actuales en biología molecular
Sin embargo, incluso en estos casos, hay suficiente ADN en
una fracción de una rodaja de gel para que se pueda utilizar el
protocolo alternativo. En general, de 25 a 100 ng de cada
componente de ADN (en un estándar 20- µ l reacción) suele ser
suficiente para obtener los recombinantes deseados. Por
supuesto, la eficiencia de clonación aumentará al usar
concentraciones más altas de los componentes. Si esto resulta
necesario, el ADN puede concentrarse fácilmente después de
purificarlo lejos de la agarosa ( UNIDAD 2.6).
Selección, selección y procedimientos de
enriquecimiento. Para algunas construcciones híbridas, las
colonias que contienen la molécula de ADN deseada se pueden
distinguir de las colonias de fondo por métodos genéticos. En tales
casos, las técnicas para la reducción de fondo se vuelven menos
importantes, lo que a menudo significa que se puede ahorrar
tiempo. Como un ejemplo extremo pero relativamente infrecuente,
si un fragmento contiene el gen de resistencia a la ampicilina y otro
fragmento contiene el gen de resistencia a la tetraciclina, el
recombinante que contiene ambos fragmentos puede
seleccionarse directamente en placas que contienen ambos
fármacos; no hay necesidad de purificar los ADN componentes
antes de la ligadura.
Los vectores de clonación se han diseñado para
seleccionar o seleccionar recombinantes. Quizás los más
utilizados son las series de vectores pUC o M13mp que
contienen el α- región de complementación de la E. coli lacZ gen
y producen placas o colonias azules en placas indicadoras
apropiadas ( UNIDAD 1.4). Inserción de un fragmento de ADN en el
lacZ La región generalmente causa una colonia o placa
blanca, que se ve fácilmente en un fondo de miles de
transformantes azules. Otro vector común, pBR322, contiene
dos marcadores seleccionables, ampicilina y resistencia a la
tetraciclina. La inserción en uno de estos genes marcadores
hace que la colonia sea sensible a ese fármaco; tales
colonias se pueden cribar mediante placas de réplica ( UNIDAD
1.5).
En muchos casos, el recombinante deseado contiene (o
carece) de regiones específicas de ADN que están presentes en
una o ambas moléculas de partida. Dichos recombinantes se
pueden identificar por hibridación de filtro de colonias o placas ( UNIDADESResultados anticipados
6.1
y 6.2) usando un apropiado 32 Sonda marcada con P ( UNIDAD
3.5). Estos procedimientos de detección pueden identificar el
recombinante correcto de un fondo de cientos o miles de
transformantes. Sin embargo, tardan varios días en
realizarse y son innecesarios si el fondo es aceptablemente
bajo.
Finalmente, la proporción de colonias correctas puede
aumentarse mediante enzimas apropiadas
Protocolos actuales en biología molecular
tratamiento después de la reacción de ligadura. Por ejemplo, si el
producto deseado carece de un Eco Sitio de RI, pero los productos no
deseados contienen dicho sitio, el fondo puede reducirse simplemente
por Eco RI escisión después de la reacción de ligadura. La mayoría de
las endonucleasas de restricción son activas en el tampón de ligasa.
Control S. Es crítico realizar experimentos de control
apropiados simultáneamente con la reacción de interés.
De esta manera, a menudo es posible determinar el éxito
relativo de la construcción híbrida. Tal conocimiento es
particularmente importante porque la preparación y el
análisis de ADN recombinantes prospectivos es la parte
más lenta del proceso general. Obviamente, vale la pena
minimizar el número de colonias que se examinarán a
partir de experimentos exitosos, así como evitar análisis
adicionales de intentos de clonación que claramente no
tuvieron éxito.
NOTA: Los controles básicos para cualquier experimento son
establecer y analizar reacciones de ligadura paralelas, cada una
de las cuales carece de un solo componente de ADN. Para
mantener constante el volumen de las reacciones de ligadura, el
ADN omitido debe reemplazarse por un volumen igual de agua. En
una construcción híbrida exitosa, el número de colonias obtenidas
cuando todos los componentes de ADN están presentes debe ser
mayor que cualquiera de las reacciones de control. Si este es el
caso, muchas o la mayoría de las colonias deberían contener la
molécula de interés.
Se deben realizar dos controles adicionales como parte
del procedimiento de transformación. Primero, se debe
incubar una alícuota de células competentes en ausencia de
ADN. La aparición de transformantes es indicativa de
contaminación en las células o tampones de transformación.
En segundo lugar, otra parte alícuota de células
competentes debería incubarse con 1 ng de un ADN de
control (ya sea plásmido o fago según el experimento) para
medir la eficiencia de la transformación; 1000 colonias o
placas deben lograrse de forma rutinaria.
Para construcciones híbridas simples, se deben generar
aproximadamente 100 a 10,000 colonias o placas, la mayoría
de las cuales deben ser la molécula deseada. Para
situaciones más complejas, el número esperado de colonias
debe estar entre 1 y 1000; dependiendo de la situación
individual, del 5 al 80% de las moléculas deben contener la
estructura deseada. Para muchos experimentos de
clonación, una colonia correcta es suficiente.
Manipulación
enzimática de ADN y
ARN
3.16.6
 Consideraciones de tiempo
Las reacciones enzimáticas generalmente se pueden
realizar en 1 a 4 h (excepto en experimentos que involucran la
ligadura de enlaces oligonucleotídicos). La electroforesis en gel
y la purificación de fragmentos de ADN deben tomar de 1 a 4
horas adicionales; Se obtienen tiempos más cortos utilizando
minigeles ( UNIDAD 2.5) y mediante el uso del protocolo alternativo.
Por lo tanto, en un día, debería ser posible pasar de los ADN
iniciales sin escindir a la reacción de ligadura. El día 2, los
productos ligados se pueden introducir en E. coli, y los
transformantes resultantes se obtendrán el día 3. Después de la
purificación de colonias o placas, el ADN de los transformantes
se puede preparar y analizar el día 4.
EJEMPLOS
Ejemplo 3.16.1: Subclonación de fragmentos
de ADN con extremos homólogos y cohesivos
Considere la clonación de un 2 kb Eco RI fragmento en un
vector que contiene un solo Eco Sitio de RI. La principal
fuente de antecedentes es el ADN de vector no ligado o
autoligado. En la mayoría de los casos, la autoligadura debe
reducirse tratando el Eco RI vector de ADN escindido con
fosfatasa alcalina intestinal de ternera (ver Fig. 3.16.1 a
continuación y UNIDAD 3.10). Aunque el tratamiento con fosfatasa
reduce la eficiencia absoluta de obtener la molécula de ADN
deseada, la gran
GCTTAAp
55′ pAATTC Vector 3′
3′ G 55′
fosfatasa
GCTTAA
AATTC ligasa
GCTTAA G
AA
TT
C
G
sin recircularización
Subclonación de
fragmentos de ADN
Figura 3.16.1 Tratamiento del vector escindido con CIP para reducir el fondo.
3.16.7
Es necesario reducir el fondo para obtener una frecuencia
relativa decente de la molécula deseada. La concentración
del (de los) ADN (s) insertado (s) debe ser relativamente alta
para facilitar la ligadura al vector. También se debe tener en
cuenta que el inserto de ADN puede contribuir a los
transformantes de fondo mediante autoligado,
especialmente cuando es difícil purificarlo de los fragmentos
"vectoriales" derivados del plásmido original.
Porque todos Eco Los extremos RI son equivalentes, el inserto
de 2 kb se puede clonar en cualquiera de las dos orientaciones
posibles con respecto a las secuencias del vector. Estos dos
resultados se pueden distinguir solo mediante el mapeo de
restricción utilizando una enzima que escinde asimétricamente
dentro del inserto de ADN. Además, es posible insertar múltiples
copias del fragmento en el vector. Generalmente, la inserción
múltiple es infrecuente a menos que las concentraciones de ADN
sean muy altas. Cuando se producen múltiples inserciones, las
inserciones están esencialmente orientadas siempre en la misma
dirección. Las moléculas que contienen copias en tándem
orientadas en la dirección opuesta son incapaces de replicarse en E.
coli a menos que el fragmento del inserto sea muy corto (menos de
30 pb).
Por todas las razones mencionadas anteriormente, es mejor evitar
la clonación de fragmentos con extremos homólogos y cohesivos
cuando sea posible. La clonación direccional, discutida a continuación,
es preferible.
GCTTAAp
55′ pAATTC Inserto 3′
3′ G 55′
ligasa
GAATTC GAATTC
CTTAAG CTTAAG
ADN recombinante (2
orientaciones)
Protocolos actuales en biología molecular
Ejemplo 3.16.2: Clonación direccional usando
fragmentos con extremos heterólogos
Este es, con mucho, el método más eficiente para la
clonación, y debe usarse siempre que sea posible. En el
ejemplo más simple, considere la unión de dos fragmentos,
cada uno producido por escisión con las enzimas A y B. La
autoligadura de cualquiera de los fragmentos se elimina
teóricamente, y la ligadura de dos fragmentos de vectores
produce una molécula de "repetición invertida perfecta" que
no puede ser estable mantenido en E. coli. Por lo tanto, el
fondo es muy bajo, y si las enzimas A y B producen 5 ′ o 3 ′ voladizos,
considerablemente más fácil si uno de los eventos de ligadura
la eficiencia es muy alta. Además, casi todos los
transformantes contendrán moléculas recombinantes en las
que una copia del inserto de ADN está orientada en una
dirección definida con respecto al vector. Las moléculas que
contienen dos copias del inserto no se pueden formar, y
aquellas con tres copias serán muy raras.
Los principales problemas asociados con la clonación
direccional provienen de errores en la generación de los
segmentos de ADN, particularmente la escisión incompleta del
vector por una de las endonucleasas de restricción. Las
moléculas de vector que se cortan individualmente pueden
autoligarse y generar fondo. Idealmente, las moléculas
escindidas por ambas enzimas pueden purificarse de aquellas
que se cortan de forma incompleta por electroforesis en gel. Sin
embargo, esto no es posible cuando los sitios para la escisión
por las enzimas A y B están muy juntos. Además, si los dos
sitios están extremadamente juntos, como es el caso de los
polienlazadores en los vectores pUC y M13mp, puede ser difícil
escindir las moléculas con ambas enzimas.
La alta eficiencia de la clonación direccional hace posible
crear moléculas compuestas de tres o más segmentos. Una
ligadura típica de tres piezas consistirá en fragmentos
generados por las enzimas A + B, B + C y A + C. El
recombinante deseado ocurrirá con menos frecuencia que en
el caso de la ligadura de dos fragmentos. Sin embargo, el bajo
fondo hace posible obtener la molécula deseada a una
frecuencia suficientemente alta para permitir el análisis
individual de las colonias.
Ejemplo 3.16.3: Ligadura de extremo romo
Aunque la ADN ligasa de T4 puede unir fragmentos con extremos
romos, la eficacia de la ligadura se reduce considerablemente en
comparación con los fragmentos con extremos cohesivos. La ligadura
de extremo romo se facilita mediante el uso de concentraciones más
altas de ADN y ∼ 10 veces más ligasa. A diferencia de la ligadura de
extremos cohesivos que requiere terminales compatibles, los
fragmentos romos son igualmente ligables, sin importar qué
endonucleasa se use para producir el
Protocolos actuales en biología molecular
termina La unión de extremos romos producidos por diferentes
enzimas casi siempre da como resultado un producto que no
puede ser escindido por ninguna enzima.
Las ligaduras más difíciles son aquellas en las que todos los
extremos relevantes son romos (por ejemplo, clonar un Sma Me
fragmento en un Sma He escindido el vector). Los problemas son
similares a los descritos en el Ejemplo 3.16.1 y se agravan por la
ineficiencia de la ligadura de extremo romo.
La clonación que involucra extremos romos es
involucra extremos cohesivos. Por ejemplo, dos fragmentos
generados por Sma yo y Eco RI se unen mucho más fácilmente
que dos Sma Segmentos generados por I. Además, dichos
extremos heterólogos permiten la clonación direccional y el fondo
es muy bajo (véase el ejemplo 3.16.2).
Ejemplo 3.16.4: Unión de fragmentos de ADN con
extremos incompatibles
Considere el caso de unirse a un Eco RI final (voladizo
5 ′ AATT) a un Saco Termino (voladizo 3 ′ AGCT). Para unir
estos términos incompatibles, es necesario convertirlos en
extremos romos. Para 5 ′ voladizos, esto se logra
"rellenando" los extremos con el fragmento Klenow de
E. coli ADN polimerasa I en presencia de los 4 dNTP (ver
Fig. 3.16.2 a continuación y UNIDAD 3.5).
Esta reacción debe llevarse a cabo en presencia de los 4
dNTP para evitar una acción de exonucleasa más extensa.
Para 3 ′ voladizos, los 3 ′ a 5 ′ La actividad exonucleasa de la ADN
polimerasa T4 o la enzima Klenow se usa para eliminar los
nucleótidos sobresalientes ( UNIDAD 3.5). Se prefiere la enzima T4
porque tiene una exonucleasa mucho más activa. Sin
embargo, la enzima Klenow hará el trabajo, y es
considerablemente menos costosa que la ADN polimerasa T4.
Ambas polimerasas son activas en todos los tampones de
endonucleasa de restricción y, por lo tanto, se pueden agregar
(junto con los 4 dNTP) directamente a la mezcla de reacción
después de la escisión.
Una vez que los extremos relevantes se han embotado, el
procedimiento de ligadura continúa como en el Ejemplo
3.16.3. Sin embargo, el paso adicional para generar los extremos
romos generalmente da como resultado una eficiencia reducida de
la ligadura; cuanto más extremos se rompan, peor será el
problema. La reacción de relleno para 5 ′ los voladizos suelen ser
más eficientes que la reacción de recorte durante 3 ′ extensiones Por
lo tanto, cuando se deben unir extremos incompatibles, es
preferible que algunas de las reacciones de ligadura requeridas
impliquen la unión de extremos cohesivos; por ejemplo, la unión de
un Bam HOLA- Eco RI (relleno) fragmento a un Bam HOLA- Saco Yo
(recortado) fragmento.
Manipulación
enzimática de ADN y
ARN
3.16.8
Suplemento 10
 Eco RI final
55′ GCTTAA 3′
3′ 55′
Fragmento de Klenow
4 dNTP
ADN polimerasa I
GAATT
CTTAA
ligasa
CTTAA G
GAATT C
regenerado Eco Sitio de RI
Figura 3.16.2 Unir fragmentos de ADN con extremos incompatibles.
En muchos casos, la unión de extremos incompatibles genera
un producto que no puede ser escindido por ninguna de las
enzimas de restricción utilizadas para producir los extremos. En
tales casos, la estructura de la molécula en el punto de fusión solo
puede determinarse mediante secuenciación de ADN.
A veces, sin embargo, uno de los sitios enzimáticos
debe regenerarse, lo que permite analizar las posibles
moléculas mediante mapeo de restricción. Por ejemplo, un
llenado Eco El sitio de RI tiene la secuencia terminal
GAATT. Si esto se une a un fragmento cuyo 5 ′ el nucleótido
terminal es C, el Eco El sitio de RI será restaurado. En
principio, un Saco El sitio I (GAGCTC) que se ha recortado
regenerará un Eco Sitio de RI que se ha rellenado.
Productos donde el Eco RI y
Saco I finales se han unido aberrantemente no dará lugar a la
regeneración de la Eco Sitio de RI.
Ejemplo 3.16.5: Ligadura de fragmentos
generados por escisión parcial
A veces, un fragmento de ADN dado contendrá sitios de
restricción interna que son los mismos que los de uno (o ambos)
de los extremos. En este caso, el fragmento solo puede
obtenerse mediante digestión con endonucleasa de restricción
parcial. Contrariamente a la opinión popular, no es difícil obtener
moléculas de ADN híbridas cuando uno o más de los
componentes se generan por escisión parcial por una
endonucleasa (s) de restricción. Al purificar en gel el producto o
los productos de escisión parcial deseados, las reacciones de
ligadura se pueden establecer de la manera normal, y deberían
ser igualmente eficientes. La principal dificultad con la escisión
parcial,
Subclonación de
fragmentos de ADN
3.16.9
Suplemento 10
Saco Termino
55′ 3′
3 ′ TCGAGC 55′
4 dNTPs
T4 ADN polimerasa
GC
obtener suficiente cantidad del fragmento específico,
generalmente se puede superar comenzando con más ADN (1 a
5 µ g debería ser suficiente) antes de la electroforesis en gel. Para
garantizar el grado adecuado de digestión parcial, se debe
realizar el método de dilución de enzimas en serie ( UNIDAD 3.1).
En algunos casos, será difícil purificar el producto de
escisión parcial deseado de productos no deseados. Esto
es especialmente cierto si la molécula de partida contiene
muchos sitios de escisión o si los sitios de escisión están
muy juntos. Sin embargo, si la reacción de ligadura tiene
un fondo bajo, tales impurezas son solo un problema
menor. Por ejemplo, si la "banda" que se corta del gel
contiene cuatro fragmentos clonables diferentes,
aproximadamente el 25% de los transformantes deberían
ser los de interés. Además, si el fragmento se genera por
escisión parcial en un extremo y la escisión completa por
otra enzima en el otro extremo, muchos de los
fragmentos contaminantes no pueden clonarse en el
vector y, por lo tanto, no contribuirán al fondo.
Ejemplo 3.16.6: Ligamientos que implican ligadores
de oligonucleótidos
Los enlazadores sintéticos son oligonucleótidos
autocomplementarios, típicamente de 8 a 12 bases de longitud,
que se unen para formar ADN de doble cadena de extremos
romos que contiene un sitio para la escisión de la endonucleasa
de restricción. Por ejemplo, G GAATTC C es un 8 pb Eco RI linker
(los nucleótidos subrayados representan el sitio de
reconocimiento). Los ligadores de oligonucleótidos facilitan
Protocolos actuales en biología molecular
la clonación de fragmentos de ADN de extremos romos, y son
valiosos para "introducir" nuevos sitios de restricción en las
posiciones deseadas. Una amplia variedad de enlazadores, cada
uno con una secuencia de reconocimiento específica, está
disponible en proveedores comerciales. Los enlazadores
generalmente se obtienen en forma no fosforilada. Para la mayoría
de las aplicaciones, se fosforilan utilizando ATP y polinucleótido
quinasa T4 ( UNIDAD 3.10). Después de la reacción de la quinasa, los
conectores fosforilados se pueden agregar directamente a la
reacción de ligadura.
Las ligaduras que involucran enlazadores se realizan en tres
etapas. Primero, el ADN de interés, que debe contener extremos
romos, se une al conector, como se ilustra en la figura 3.16.3.
Esta reacción se realiza con 0.1 a 1 µ g de enlazador, que
representa un exceso molar de 100 a 1000 veces de enlazador
sobre el fragmento. La alta concentración de extremos hace que
esta reacción de ligadura de extremo romo sea más eficiente de
lo normal. Generalmente, el conector se fosforila antes de la
ligadura. En este caso, los productos de ligadura típicamente
contendrán varios enlazadores en cada extremo del fragmento.
Algunos experimentos implican la ligadura de enlazadores no
fosforilados, en cuyo caso los productos contendrán solo un
enlazador en cada extremo.
En segundo lugar, después del tratamiento térmico para
inactivar la ligasa, los productos de esta reacción se escinden
con la enzima de restricción que reconoce el conector, como se
ilustra en la figura 3.16.3. Debido a la alta concentración de
sitios de restricción debido al enlazador, este paso generalmente
requiere incubación durante varias horas con una gran cantidad
de enzima de restricción (20 a 50 U). Es importante que el
fragmento no contenga un sitio interno que sea reconocido por la
enzima de restricción (a menos que el fragmento haya sido
metilado previamente por la metilasa correspondiente a la
ADN de extremos romos
pags
pags
ligasa
pGGAATTCCGGAATTCCGGAATTCC
CCTTAAGGCCTTAAGGCCTTAAGG
Eco Rhode Island
AATTCC
GG
Figura 3.16.3 Unir ADN de extremos romos para Eco RI linker.
Protocolos actuales en biología molecular
enzima restrictiva). Si es posible, los productos de ligadura deben
escindirse con una segunda enzima de restricción para producir
un fragmento con extremos heterólogos adecuados para la
clonación (véase el Ejemplo 3.16.2).
Tercero, el fragmento se purifica por electroforesis en gel y
luego se liga por métodos convencionales. El paso de
purificación en gel también elimina los enlazadores no ligados,
lo que interferiría con este segundo paso de ligadura. Los
enlazadores también se pueden eliminar por otros métodos
(cromatografía en Sepharose CL-4B o Sephacryl S-300; ver
UNIDADES 2.6 y 5.6), pero la electroforesis es más eficiente y
permite la purificación del fragmento deseado lejos de los
fragmentos no deseados.
Ejemplo 3.16.7: Clonación de oligonucleótidos
sintéticos
Los oligonucleótidos bicatenarios adecuados para la
clonación se pueden obtener hibridando dos oligonucleótidos
monocatenarios que se han sintetizado químicamente. En
general, dichos oligonucleótidos se fosforilan con T4 quinasa ( UNIDAD
3.10) antes del recocido. Los oligonucleótidos de doble cadena y
fosforilados también se pueden generar mediante "síntesis
mutuamente cebada" de oligonucleótidos de cadena sencilla
apropiados ( UNIDAD 8.2). Los oligonucleótidos obtenidos por
cualquiera de los métodos pueden clonarse mediante
procedimientos de ligadura estándar usando extremos
cohesivos o romos.
El principal problema asociado con la clonación de
oligonucleótidos es el de la inserción múltiple. Esto se debe a
que pequeñas cantidades de oligonucleótidos representan un
gran exceso molar. Este problema se resuelve mejor haciendo
una serie de diluciones en serie de oligonucleótidos de 10 veces
y estableciendo reacciones de ligadura paralelas usando
Eco RI linker
pGGAATTCC
CCTTAAGGp
GGAATTCCGGAATTCCGGAATTCC
CCTTAAGGCCTTAAGGCCTTAAGGp
GG
CCTTAA
Manipulación
enzimática de ADN y
ARN
3.16.10
Suplemento 26
 Estas diversas concentraciones. Si se desean inserciones Literatura citada
individuales, los transformantes deben recogerse de las placas Dugaiczyk, A., Boyer, HW y Goodman, HM
que representan la menor cantidad de oligonucleótido necesaria 1975. Ligadura de Eco RI fragmentos de ADN generados por
endonucleasa en estructuras lineales y circulares. J. Mol. Biol. 96:
para aumentar el número de colonias significativamente por
174-184. Struhl, K. 1985. Un método rápido para crear recom-
encima del fondo (es decir, la ausencia de oligonucleótido). En
general, las condiciones óptimas para la inserción única se
moléculas de ADN binante. Biotecnicas 3: 452-
producen cuando el oligonucleótido está presente en un exceso 453.
molar de 5 a 20 veces sobre los otros fragmentos en la mezcla
de ligadura.

Contribuido por Kevin Struhl

Harvard Medical School Boston,
Massachusetts

Subclonación de
fragmentos de ADN

3.16.11

Suplemento 26 Protocolos actuales en biología molecular